Alpha-lipoic acid: A possible pharmacological agent for treating dry eye disease and retinopathy in diabetes Clin Exp Pharmacol Physiol . 2020 Dec;47(12):1883-1890. doi: . Epub 2020 Jul 21. PMID: 32621549 DOI: IF=（2015）index (一般偏难) 摘要： α-硫辛酸（ALA）是天然存在的二硫醇微量营养素，可充当线粒体酶活性的辅助因子。由于其潜在的抗氧化剂活性，它被认为是“通用抗氧化剂”。先前的研究报道了ALA的药理学优势，例如 血糖控制 ， 改善的胰岛素敏感性 以及 减轻糖尿病并发症 （如神经病变和心血管疾病）的发生。糖尿病患者中普遍存在 干眼病和视网膜病 。 实验研究证明了ALA在干眼症和糖尿病性视网膜病中的有益作用 。ALA可以通过 下调 角膜上皮细胞中基质金属蛋白酶9的表达并激活眼表的抗氧化状态来预防干眼症。此外，它的直接 抗氧化作用 还可以防止氧化应激引起的角膜表面侵蚀和泪腺损害。ALA通过 抑制 O-联结的β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和核因子-κB活性并减轻氧化应激来预防糖尿病性视网膜病。它可以 激活 视网膜神经节细胞中的核因子红系2相关因子2和AMP激活的蛋白激酶。在视网膜前病变糖尿病患者中进行的临床试验表明，含染料木黄酮和维生素的ALA可以保护视网膜细胞并降低糖尿病患者的炎症作用。然而，很少有研究探索其在干眼病和糖尿病性视网膜病中的有益作用。因此，这篇评论文章讨论了ALA在干眼病和糖尿病性视网膜病中的作用的最新进展， 关键字： α-硫辛酸；抗氧化剂 糖尿病性视网膜病变; 干眼病 基质金属蛋白酶 核因子红系2相关因子2。 1引言 α-硫辛酸（ALA）1,2-二硫杂环戊酸酯-3-戊酸是一种天然存在的低分子量（ g / mol）二硫醇微量营养素，可作为与线粒体代谢相关的生物能酶活性的辅助因子。 1 ALA与丙酮酸脱氢酶，α-酮戊二酸脱氢酶，支链α-酮酸脱氢酶和甘氨酸裂解系统等酶的赖氨酸残基的ε-氨基共价连接。 1 ， 2 与硫醇基团此有机硫化合物在植物和动物中产生。动物的主要来源是肉，尤其是红肉，而植物的主要来源是西兰花，抱子甘蓝，菠菜，马铃薯，番茄和豌豆。 3 ， 4 它可以在哺乳动物细胞的线粒体中合成，发现在病理条件下会降低。 5 在人类中，ALA是在心脏，肝脏和肾脏中合成的。 6 商业ALA是R和S形式的外消旋混合物。天然存在的R形式充当线粒体酶的辅因子。 7 食物中R和S形式的绝对生物利用度均不超过40％，并且能够穿越血脑和血视网膜屏障。 8 ， 9 许多植物衍生的抗氧化剂，包括在ALA老化相关的病症的治疗用途最近进行了综述。 10 Hagen等人证明，饮食中补充2周的ALA可以改善线粒体功能，这可以通过增加老年大鼠的O 2消耗量和线粒体膜电位来证明。 11 ALA或其钯共轭形式可改善老年大鼠心肌和大脑中的电子传输链活性。 12 - 14 如防止心血管疾病，炎症，衰老和认知功能障碍阿尔茨海默病ALA的许多生物活性吸引了其药理好处。 15 - 17 ALA的抗癌作用表现在各种癌细胞系。 18 ， 19 该作用通过生长因子受体结合蛋白2（一种细胞信号通路的衔接蛋白和AMP激活的蛋白激酶（AMPK））介导，导致表皮生长因子受体（EGFR）和哺乳动物雷帕霉素S6信号转导的靶标下调。途径。 20 ， 21 此外，ALA可以下调几个蛋白激酶，包括粘着斑激酶，细胞外信号调节激酶1/2和蛋白激酶B这将最终抑制转化生长因子β1信号的磷酸化。这被解释为ALA对乳腺癌细胞抗侵袭作用的可能机制。 22 ALA或其还原形式的二氢硫辛酸（DHLA）可以直接或间接调节蛋白激酶C和AMPK的表达，这是细胞代谢的许多下游信号传导途径中的关键酶。 23 ， 24 此外，作为过氧化物酶体增殖物激活受体α和γ的激动剂。 25 这些机制解释了ALA对肥胖，非酒精性脂肪肝和肝纤维化的有益作用。 26 - 28 由于氧化应激参与糖尿病并发症的分子机制，因此ALA的抗氧化作用可用于其治疗。大多数临床研究表明，在减轻糖尿病患者的氧化应激，神经病以及与神经病有关的疼痛和感觉异常方面具有药理作用。 29 ， 30 。然而，最近的荟萃分析与安慰剂相比时结束ALA的对血糖控制和胰岛素敏感性的影响不显着。 31 在2型糖尿病患者中普遍存在视网膜病变和干眼症。 32 实验研究证明ALA在干眼病和糖尿病性视网膜病中的有效性。但是，尚未通过临床试验确定其在这些眼部疾病中的作用。因此，本文综述了ALA在干眼病和糖尿病性视网膜病中的作用。截至2020年6月，在PubMed，Scopus和Web of Science中使用搜索词α-硫辛酸和眼部疾病或干眼症或糖尿病性视网膜病变对相关文章进行了文献检索。 2 硫辛酸的抗氧化剂和抗炎活性 α-硫辛酸是一种强大的抗氧化剂分子，因此被认为是“通用抗氧化剂”。ALA和DHLA的抗氧化和抗炎作用如图 1 所示 。通过基于NAD（P）H的反应，ALA易于从饮食中吸收，运输到细胞并在肝脏中还原为DHLA。由于它可溶于水和脂肪，因此广泛分布在细胞膜和细胞质中。 33 ALA的氧化形式和还原形式均具有抗氧化性能。 1 ， 33 ， 34 的范围内的氧化还原活性含硫天然产品，包括ALA的药理学性质被关联到硫醇基团。 35 ALA的潜在抗氧化作用可以归因于直接活性氧（ROS）清除能力，金属离子螯合能力和恢复细胞抗氧化剂的能力，例如还原型谷胱甘肽（GSH），辅酶Q，维生素C和E含量。 11 ， 34 ， 36 研究已经证明ALA可以提高下降在肝细胞和心肌细胞中GSH，维生素C，维生素E和辅酶Q的水平。 36 发现ALA的脂质体制剂可增强其抗氧化能力。 37 在ALA的ROS清除特性中，在生物系统中已证明清除了羟基自由基，次氯酸，过氧自由基和单线态氧。 38 它还可能通过过渡金属螯合发挥抗氧化作用。ALA可以螯合Fe 2+和Cu 2+，从而防止氧化还原活性金属介导的反应，如Fenton和Haber-Weiss反应。 2 ， 39 ， 40 此外，由于金属螯合性质它可以有效地减轻与重金属中毒有关的毒性。α-硫辛酸可以增加主要抗氧化剂的基因表达，例如超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）。该作用是通过氧化还原敏感的转录因子，核因子erythroid-2相关因子2（Nrf2）的稳定和核易位介导的。 41 由于Nrf2阻断了核因子-κB（NF-κB）的活化，因此可以解释ALA的Nrf2活化和抗氧化特性，因为它具有抗炎作用。 41 此外，人类神经母细胞瘤细胞中显示出一种新型的ALA抗炎机制，它可以使DNA甲基化，从而下调炎性细胞因子白介素（IL）-1β和IL-6的水平。 42 体外和体内研究均表明ALA和DHLA的促氧化特性。DHLA的促氧化特性可能是通过羟基自由基的产生介导的。 15 此外，ALA和DHLA已显示出可促进离体大鼠肝脏线粒体中线粒体通透性的转变，从而产生过量的ROS（如超氧阴离子）。DHLA刺激大鼠肝线粒体和线粒体下颗粒中超氧阴离子的产生。 43 因此，选择合适的ALA药理剂量对于限制其抗氧化作用至关重要。 44 为确定老年人群体中ALA的耐受性而进行的一项研究得出的结论是，每天600毫克一餐，连续5天的口服剂量耐受性良好。 45 但是，较高剂量可能产生上消化道副作用和潮红感。 45 3 硫辛酸在眼病中的作用 干眼症 干眼病是一种与年龄有关的多因素慢性疾病，会因泪液产生中断和角膜上皮完整性丧失而影响眼表。此病最初会引起轻度不适。以后，它可能导致眼表疤痕，可能导致不可逆的视力损害。泪腺中泪液的产生与神经内分泌，激素和免疫学因素有关。带有角膜上皮的眼泪可保持眼表的水合作用和表面光滑度。眼膜，眼角膜和房水中的酶抗氧化剂和非酶抗氧化剂可提供抗氧化应激的保护。抗氧化剂关键酶SOD，CAT和GPx， 46 ， 47 在正常角膜上皮，抗氧化酶活性的顺序被报告为SOD> CAT> GPx的。 48 除此之外，眼泪蛋白乳铁蛋白和S100A还有助于眼表的抗氧化防御。 经常与干眼症有关的环境因素包括暴露于污染物，臭氧，紫外线辐射以及长期使用防腐眼药水（如治疗青光眼）。 49 这些因素会增加氧化应激，从而导致眼表发炎。 50 ， 51 在干眼疾病的病理生理学活性氧和氮物种的重要的作用是通过增加证明在眼表面组织8-羟基脱氧鸟苷2，4-羟基壬烯醛，丙二醛和硝基酪氨酸水平。 49 ， 52 - 54 ROS的水平和活性保护酶导致的氧化性损伤和眼表面炎症之间的不平衡。 49 ， 55 减少的结膜上皮抗氧化酶（SOD，CAT和GPX）的表达是在与干眼疾病的受试者中发现。 56 干眼动物模型表明，氧化产物在角膜上皮中积累。 57 Kruk等人发现，增加的氧化应激反过来会导致眼表发炎和干眼症的发生。 58 眼泪中基质金属蛋白酶（MMP）及其抑制剂之间平衡的改变是与眼表疾病相关的病理生理机制之一。 59 ， 60 在氧化应激，MMP的在角膜上皮屏障（对-和反式-细胞上皮）的分子的破坏作用在干眼病进行了说明。 61 ， 62 MMP-9过度表达已被证明在干眼病。 63 类似于Kelch的ECH相关蛋白1（Keap1）-Nrf2抗氧化反应元件途径在调节抗氧化剂基因的表达，维持角膜上皮细胞的抗氧化剂状态并从而保护眼表免受干眼症的影响中起着关键作用。 64 ， 65 因此，Nfr-2在角膜上皮细胞中的激活可以间接增强抗氧化防御能力，例如SOD，CAT和GPx。 66 最近的一项研究得出结论，在干眼模型中，Nrf-2激活剂可有效抵抗角膜上皮细胞损伤。 67 仅少数研究提出氧化应激作为干眼病局部治疗的靶标。 49 ， 68 的氧化应激和ALA的干眼疾病中的作用描述于图 2 。最近的体外和体内研究表明，ALA可以下调MMP-2和MMP-9的表达并增加其组织抑制剂在眼泪中的表达。 69 ， 70个 研究在动物模型表明，ALA和硒蛋白P可以有助于减轻氧化应激的眼表。 71 ALA通过激活眼表细胞中的Nrf-2来增加泪腺过氧化物酶并恢复泪腺产生。 72 ALA对大鼠辐射性泪腺损伤具有保护作用，其作用是通过抑制活化的T细胞表达和NF-κB信号传导途径介导的，从而提示ALA在干眼症中可能具有治疗作用。 73 糖尿病患者中普遍存在干眼病。 32 在2型糖尿病患者中，糖尿病视网膜病变与干眼症之间存在显着相关性。 74 糖尿病患者血糖控制不佳也与干眼症发生率相关。 75 糖尿病中干眼症的可能机制与高血糖症有关，高血糖症可能导致高泪膜渗透压和眼表发炎。由于泪腺的神经病变，这种炎症和氧化应激降低了杯状细胞密度，结膜上皮鳞状化生以及泪液产生不足。 76 - 78 ALA的降血糖，抗炎和抗氧化作用可能对糖尿病相关的干眼症有效。然而，需要更多的研究来确定其在干眼病中的作用。 糖尿病性视网膜病 糖尿病性视网膜病仍然是糖尿病的主要眼部并发症之一。已经证明包括氧化应激和炎症在内的各种机制可导致糖尿病性视网膜病的形成。 79 葡萄糖的自动氧化，高级糖基化终产物的形成增加以及醛糖还原酶和蛋白激酶C活性的增加，是导致糖尿病视网膜多种细胞类型中ROS形成的因素。 65 糖尿病视网膜病变的病理生理学也报道了肾素-血管紧张素过度活化，血液血液动力学变化，白细胞介导的内皮细胞损伤以及视网膜毛细血管基底膜灌注不足和增厚。 80 - 83 高血糖症会在己糖胺的生物合成途径中诱导 O- 连接的β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的激活。这种增强的 O- 连接的β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性产生了 O- 连接的β-N-乙酰氨基葡萄糖信号传导，这与糖尿病性视网膜病的发病机理有关。 84 ， 85 ö -GlcNAcylation在高血糖状态可以激活NF-κB，炎性转录因子。 86 由于视网膜神经节细胞（RGC）死亡，氧化应激和炎症在糖尿病性视网膜病变的发展中起着重要作用。 86 在图 3中 描述了ALA在糖尿病性视网膜病中的作用 。ALA在线粒体生物能反应中的作用以及在细胞膜和细胞溶质中作为抗氧化剂的作用可以显着控制糖尿病性视网膜病变，神经病变和其他血管疾病。 29 此外，ALA可以增强血管内皮细胞对内皮细胞的抗氧化防御能力。 87 Inman等人已经证明饮食疗法可以减轻氧化应激，从而改善青光眼的RGC存活率。 88 ALA补充4-11个月可以改变与氧化应激相关的基因和蛋白质的表达。 88 与对照组相比，ALA治疗组的RGC数和轴突转运，轴突数和轴突完整性发生了变化。 88 所测量的视网膜脂质过氧化，蛋白质亚硝基化和DNA氧化水平支持了这一效果。ALA可以激活内皮型一氧化氮合酶产生一氧化氮，改善内皮功能，并抑制糖尿病患者的糖基化反应。 29 ， 89 Nrf2在氧化应激过程中在视网膜中的保护作用被证明。 90 然而，糖尿病患者的高血糖水平可能有助于Keap1的表观遗传修饰，以增加其在细胞质中的水平，并且在糖尿病性视网膜病变中观察到Nrf2的相关失活。 91 ， 92 ALA增强的Nrf-2的视网膜神经元的核易位。 93 为ALA提出的另一种保护糖尿病小鼠RGC的机制是通过激活AMPK和抑制 O- 连接的β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性来介导的。 94 ALA可以抑制糖尿病动物视网膜中的NF-kB活化和血管内皮生长因子的作用。 95 在视网膜病变前期糖尿病患者中进行的临床试验表明，以染料木黄酮和维生素进行的ALA剂量为400 mg / d持续2个月可以保护视网膜细胞。 96 最近的一项研究表明，以600 mg / d的ALA对糖尿病患者的抗炎作用持续4个月。 97 但是，Haritoglou等人进行的临床试验表明，每天的ALA（600毫克，持续2年）不能预防在胰岛素依赖型糖尿病患者中发生具有临床意义的黄斑水肿。 98 因此，需要更多的研究来确定ALA在糖尿病性视网膜病中的作用。 4 结论与未来展望 硫辛酸被认为是“通用抗氧化剂”。ALA的抗氧化作用与直接ROS清除能力，金属离子螯合能力及其恢复细胞抗氧化剂的能力有关。ROS和抗氧化剂含量之间的不平衡会导致眼表的氧化损伤和炎症。动物模型研究表明，ALA和硒蛋白P可能有助于缓解眼表的氧化应激。ALA增加了泪腺过氧化物酶的活性并恢复了泪腺的产生，从而改善了干眼症。还发现ALA对糖尿病性视网膜病有效。它通过诱导Keap1-Nrf2-ARE信号通路在视网膜中发挥抗氧化应激的神经保护作用。 O- 连接的β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性。通过抗氧化活性，ALA可以抑制细胞凋亡并维持RGC。临床试验发现口服ALA（600 mg / d）可以有效缓解糖尿病患者中轻度至中度多发性神经病的作用，范围为40天至4年。 99 - 101 短期ALA治疗（600毫克/千克，静脉注射8周）可以改善在糖尿病患者中早期肾病。 102 口服剂量为1300 mg / d的ALA以及维生素E或二十碳五烯酸和能量受限的饮食8-10周可减轻肥胖症的体重。 26 ， 103 最近的研究结果发现，连续六个月给予ALA以及其他抗氧化剂和二十二碳六烯酸可减轻原发性开角型青光眼患者的氧化应激，而没有任何不良影响。 104 制备了一种基于纳米胶束的ALA滴眼剂，用于糖尿病相关的角膜治疗，它可以增强ALA的角膜通透性，稳定性，溶解性和积累。 105 ALA预防这些糖尿病并发症的有益作用是值得的。但是，在糖尿病患者中使用ALA治疗眼病（如干眼症和糖尿病性视网膜病）的临床试验尚不足以支持其有益作用。尽管进行了临床和临床前研究，但仍需要使用不同的口服剂量或ALA滴眼剂进行更有针对性的长期临床试验，以探索其在眼部疾病中的治疗潜力。 致谢 作者非常感谢印度印度喀拉拉邦Elthuruth，Thrissur，St。Aloysius HSS英语系Babitha NV，高级HSST，英语系的宝贵帮助。 利益冲突 作者声明没有潜在的利益冲突。 同行评审 本文的同行评审历史记录可从 ‐获得 。
电子产品的蓝光对于身体来说危害非常的大，蓝光照射常见的就是会出皮疹，而且还会出红色的皮疹，皮肤损伤也会非常严重；在平常可以去佩戴抗蓝光的眼镜，对于长时间看电脑还有手机的人群，就要在集中用眼的时候去佩戴防蓝光眼镜。
基质金属蛋白酶 (MMPs)，又称基质金属多肽酶或matrixins，它是一类锌依赖性的蛋白水解酶，可降解细胞外基质 (ECM) 中的多种蛋白。MMPs 属于金属蛋白酶的 metzincin超家族，其他成员如 astacins、serralysins、reprolysins、adamalysins 或 ADAMs。MMPs 由 24 个人类基因和 23 个小鼠基因编码。 MMP 家族至少可以分为六个亚家族：(1) 胶原酶; (2) 明胶酶，(3) 溶血素，(4) 基质溶素，(5) 膜型MMPs，(6) 其他 MMPs。 MMPs 的典型结构包括 N 端酶原前肽结构域、金属蛋白酶催化结构域、可变长度的连接区和 C 端类血凝蛋白结构域。 所有MMPs 都是作为原酶产生的，需要在生理条件下进行蛋白裂解，以促进前肽结构域的释放 (酶原激活)，并产生成熟的基质金属蛋白酶。MMPs 在许多生物学过程中发挥了关键作用，如胚胎发生、正常组织重塑、伤口愈合和血管生成，以及在疾病中也发挥了重要作用，如动脉粥样硬化、关节炎、癌症和组织溃疡 MCE重组蛋白产品种类丰富，涵盖细胞因子、病毒蛋白、免疫检查点蛋白、CAR-T蛋白、CD抗原、受体蛋白、生物素标记蛋白、GMP蛋白、酶等多种分类，可用于人、病毒、小鼠、大鼠、猴、猪、狗、牛、羊、兔、猫、非洲爪蟾等多种不同研究领域的生物学研究，包括蛋白结构研究、免疫检测试剂、重组蛋白药物、诊断试剂开发、抗体药物靶点、CAR-T细胞治疗靶点、Fc受体、流感病毒蛋白和细胞因子等热门研究领域。MCE因高品质的产品和优质的售前售后服务，成为全球数以百万计的科学家和技术人员值得信赖的实验伙伴。 产品种类丰富：细胞因子和生长因子, 免疫检查点蛋白, CAR-T相关蛋白, CD抗原, 受体蛋白, 酶&调节子, 补体系统蛋白, 病毒类蛋白, 生物素标记蛋白, 荧光标记蛋白, GMP蛋白, 泛素相关蛋白等。 产品物种多样性：人、病毒、小鼠、大鼠、猴、猪、狗、牛、羊、兔、猫、非洲爪蟾、细菌、真菌等 低内毒素水平：LAL法验证，内毒素含量低于绝大多数供应标准 高纯度：SDS-PAGE和HPLC检测验证 高生物活性：相关体内/体外生物学实验测定 稳定的一致性：多批次检测数据确认 规格齐全：满足客户的多种预分装规格 重组蛋白定制服务 * 从基因设计到蛋白制备的一站式服务 * 自主研发多种高表达载体与菌株 * 专业的重组蛋白技术研发团队 * 提供毫克至克级高纯度蛋白定制服务 * 提供蛋白在生物研究应用中专业的技术支持
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酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。 目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。 因此，本研究以开发耐温偏酸性蛋白酶为目标，进行了以下几方面的研究： (1)偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选。 (2)偏酸性蛋白酶粗酶酶学性质的研究。 (3)偏酸性蛋白酶固体发酵条件的优化。 (4)偏酸性蛋白酶产生菌P-1007的初步鉴定。 (5)偏酸性蛋白酶在啤酒澄清中的应用。 本论文主要研究结果和结论如下： (1)用常规土壤分离方法，从土壤样品中筛选到一株产偏酸性蛋白酶的菌株，命名为P-1007。 (2)通过单因素发酵条件实验和正交实验的方法得到最佳固体发酵条件为：麦麸15g，黄豆粉8％，葡萄糖3％，NaH2PO41％，％，水35ml，最佳起始，最适发酵温度为40℃。在此条件下所产酶活可达3700u/g，比原始菌株发酵酶活提高了将近2倍，且产酶稳定性较好。 (3)菌株P-1007所产的偏酸性蛋白酶的最适作用pH值为，最适作用温度为50℃。酶的pH稳定性和耐温性较好，50℃、条件下保温8h后剩余酶活可达83％以上，、50℃条件下保温2h后剩余酶活仍在70％以上。Mn2+、Cu2+对偏酸性蛋白酶有明显的激活作用，其它金属离子则对该酶有不同程度的抑制作用。与目前所得到的酸性蛋白酶相比较，偏酸性蛋白酶具有较高的作用pH值和较好的耐温性。 (3)从菌株P-1007菌落形态、显微观察以及区序列分析可以看出菌株P-1007可能属于烟曲霉。 (4)从酶学性质上可以看出，菌株P-1007所产的偏酸性蛋白酶的作用条件满足于啤酒澄清工艺的要求，因此本实验进行了偏酸性蛋白酶在啤酒澄清中的应用研究以及该酶与酿造复合酶和啤酒用中性蛋白酶作用效果的比较。研究结果表明：经偏酸性蛋白酶作用后，麦汁和发酵液中酪氨酸含量、透光率、总氮量、可凝固性氮含量都有了明显的提高。麦汁中a-氨基氮含量也增加了，说明偏酸性蛋白酶将凝固性蛋白质水解成了分子量较小的a-氨基氮，为啤酒酵母的生长繁殖提供了氮源。同时发酵液中的a-氨基氮含量却降低了，分析原因为发酵阶段中酵母利用a-氨基氮的速度比偏酸性蛋白酶降解蛋白质的速度快。麦汁和发酵液的pH值都无太大变化，因此不会影响啤酒酵母的生长和繁殖。在与酿造复合酶和啤酒用中性蛋白酶作用效果的比较中发现，三种酶的作用效果大致相同，但从最适作用条件来看，偏酸性蛋白酶比另两种蛋白酶更适合于啤酒澄清工艺。 以上研究结果表明，本课题筛选到的菌株P-1007所产偏酸性蛋白酶的作用条件特别适合于啤酒澄清工艺，因此在啤酒工业中有较好的应用前景。 关键字:烟曲霉,偏酸性蛋白酶,发酵条件优化,酶学性质,rDNA-ITS区序列分析,啤酒澄清
本论文主要研究了以大豆废渣为原料制备风味良好的大豆多肽的问题。摒弃了常规的酸法、碱法和一般的酶解方法,采用自行选育的微生物蛋白酶结合木瓜蛋白酶和胰蛋白酶多酶协同作用,制备水解度高、风味良好的大豆多肽。 实验从我国传统发酵食品豆腐乳出发,筛选到一株所产微生物蛋白酶对大豆蛋白有一定降解能力,同时能够消除内切酶水解大豆蛋白后产生不良风味的菌株,命名为MY10。对MY10进行了初步鉴定,发现其为毛霉属。研究了菌体生长和产酶特性的关系,发现该菌株在液体培养基中84h时达到最大,培养基的pH值在0～48h不断下降,48h时pH值为,之后pH值开始回升,84h后为以上,通过测定蛋白酶活性,发现MY10所产蛋白酶在84h活性达到最大;对粗酶液进行了分离纯化,首先确定了用60%的饱和(NH_4)_2SO_4进行沉淀,然后过Sephadex G75,通过蛋白酶活性的测定,发现可能含有中性蛋白酶和碱性蛋白酶;对粗酶液性质进行了研究,发现该酶系的最适pH值为,中性、碱性蛋白酶的最适温度分别为60℃、50℃。由于该酶系的蛋白酶活性不是很高,为了提高豆粕的水解度,得到水解程度较高的大豆多肽,本论文选用木瓜蛋...英文摘要: The problem of producing flavorful polypeptides from soybean residue was discussed in this research. The routine methods such as acid、 alkali and common enzymatic hydrolysate were discarded while the cooperation of self-selected protein enzyme from microbe with papain and typsin was used to produce soybean polypeptides with high degree of hydrolysis and excellent strain of fungus that could produce protein enzyme with certain ability to decompound soybean proteins and dispel the distasteful flavor ...目录:1 文献综述 10-21 1．1 大豆蛋白的组成与结构 10-11 1．2 大豆多肽的生物活性和主要用途 11-12 1．3 大豆蛋白改性 12-14 1．4 苦味肽形成的机理及脱苦方法 14-18 1．4．1 苦味肤的形成机理 15-16 1．4．2 脱苦方法 16-18 1．5 腐乳毛霉对大豆蛋白的作用 18-20 1．6 豆粕中抗营养因子的研究 20-21 2 本论文的研究设想 21-22 3 材料与方法 22-30 3．1 材料 22-23 3．1．1 实验原料与主要试剂 22 3．1．2 培养基 22-23 3．1．3 仪器设备 23 3．2 方法 23-30 3．2．1 微生物蛋白酶产生菌株的筛选、鉴定及其发酵条件的研究 23-26 3．2．2 双酶水解大豆蛋白 26-27 3．2．3 风味良好的大豆多肤的制备 27-30 4 结果与分析 30-53 4．1 微生物蛋白酶产生菌株的筛选、鉴定及其发酵条件 30-40 4．1．1 微生物蛋白酶产生菌株的筛选 30-31 4．1．2 菌种鉴定 31-33 4．1．3 MY10菌体生长和产酶特性的研究 33-35 4．1．4 酶的分离纯化 35-37 4．1．5 粗酶液性质研究 37-40 4．2 双酶水解大豆蛋白 40-48 4．2．1 内切酶水解豆粕的研究 40-48 4．3 风味良好的大豆多肤的制备 48-49 4．4 酶解前后豆粕营养成分变化分析 49-53 4．4．1 氨基酸含量测定结果 49 4．4．2 蛋白质降解的分析 49-50 4．4．3 酶解前后抗营养因子变化分析 50-53 5 讨论 53-57 5．1 微生物蛋白酶产生菌株的筛选、鉴定及其发酵条件的研究 53-54 5．1．1 微生物蛋白酶产生菌株的筛选 53 5．1．2 酶的分离纯化 53 5．1．3 MY10蛋白酶系性质研究 53-54 5．2 双酶水解大豆蛋白 54-56 5．2．1 豆粕的预处理 54 5．2．2 酶解过程中反应条件的控制 54-55 5．2．3 豆腥味的去除 55 5．2．4 酶解过程的研究 55-56 5．2．5 苦味的研究 56 5．3 风味良好的大豆多肤的制备 56-57 5．4 酶解前后豆粕营养成分变化分析 57 6 结论 57-59 致谢
生物活性肽是蛋白质中25个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性极高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。以下为几种重要生物活性肽的发展状况。乳肽早在20世纪50年代，该公司即以乳酪蛋白酶解制取了第一代的酪蛋白肽和氨基酸混合物，含5～8个氨基酸组成的肽和70％以上的游离氨基酸，用于低抗原性防过敏牛奶粉，在市场上行销40多年；60～70年代，开发出第二代的高度水解乳清蛋白肽混合物，含10～12个氨基酸组成的肽和40％～60％的游离氨基酸。以上两代产品的游离氨基酸含量过高，影响了产品的风味和生物效价；90年代，推出了低度水解乳清蛋白肽混合物，含10～15个氨基酸组成的肽和20％以下的游离氨基酸，产品风味明显改善，生物效价提高。 992年，和研究了胰蛋白酶、凝乳蛋白酶等酶的固定化反应器制取乳肽的工艺，可以通过调节流速来控制反应程度，并通过重复使用酶来降低成本。1989年，.和.研究了带超滤膜的酶反应器，在反应器内加入钙和磷酸根离子，用于制备酪蛋白磷酸肽和去磷酸化酪蛋白多肽。 我国对乳肽的研究不多，主要是进行蛋白酶的筛选和酶解工艺的优化，如1991年，肖安乐等人筛选出胰蛋白酶的胰酶是水解变性乳清蛋白质的最佳酶种；1994年，王凤翼等人对胰蛋白酶控制水解α－酪蛋白的最佳条件进行了优选；张和平等人采用胰蛋白酶水解热敏性乳清蛋白，获得热稳定好、易溶解的多肽，并以此开发出稳定性良好的乳清饮料；1995年，于江虹也从牛乳酪蛋白中分离提纯获得酪蛋白磷酸肽，证实了其在小肠中可与钙、铁等矿物质形成可溶性络合物，促进人体对钙、铁的吸收；广州市轻工研究所生产的酪蛋白磷酸肽CPP含量达85％以上，易溶于水，加工性能稳定，已在我国市场上推出。最近，我国生物工作者开发了采用微生物发酵控制、蛋白转化率高的乳肽产品，其中氨态氮占20％左右、肽态氮占80％左右，产品无不良气味，已获专利；湖北工学院吴思方等人进行了固定化胰蛋白酶生产酪蛋白磷酸肽的研究，CPP得率为％，产品中CPP总含量为15％，此工艺中酶可重复多次使用，既降低了成本，又有利于产品分离和生产自动化。大豆肽大豆肽是大豆蛋白质经酸法或酶法水解后分离、精制而得到的多肽混合物，以3～6个氨基酸组成的小分子肽为主，还含有少量大分子肽、游离氨基酸、糖类和无机盐等成分，分子质量在1000μ以下。大豆肽的蛋白质含量为85％左右，其氨基酸组成与大豆蛋白质相同，必需氨基酸的平衡良好，含量丰富。大豆肽与大豆蛋白相比，具有消化吸收率高、提供能量迅速、降低胆固醇、降血压和促进脂肪代谢的生理功能以及无豆腥味、无蛋白变性、酸性不沉淀、加热不凝固、易溶于水、流动性好等良好的加工性能，是优良的保健食品素材。 大豆肽的生产有酸法水解和酶法水解。酸法因水解程度不易控制、生产条件苛刻、氨基酸受到损害而很少采用；酶法水解易控制、条件温和、不损害氨基酸而大多被采用。酶的选择至关重要。通常选用胰蛋白酶、胃蛋白酶等动物蛋白酶，也可选用木瓜和菠萝等植物蛋白酶。但应用较广的主要是放线菌166、枯草芽孢杆菌1389、栖土曲霉3942、黑曲霉3350和地衣型芽杆菌2709等微生物蛋白酶。 20世纪70年代初，美国首先研制出大豆肽，公司建成了年产5000吨食用大豆肽装置；日本于80年代开始研制大豆肽，不二制油公司首先采用酶法规模化生产出3种大豆肽，雪印和森永等乳业公司应用大豆肽生产食品。 我国近几年也开展了大豆肽的生产和应用研究。江西省科学院高科技中心李雄辉等人采用ASI389中性蛋白酶和木瓜蛋白酶双酶水解生产大豆肽，使大豆肽生成率为％，肽态氮含量大于85％，游离氨基酸含量小于8％，平均肽键长度5～8，分子质量2000μ左右。双酶水解工艺既缩短了酶解时间、提高了蛋白质水解度，又减轻了产品苦味。华南理工大学黄惠华等人用木瓜蛋白酶对大豆分离蛋白进行水解试验，测得木瓜蛋白酶的动力学常数。另外，无锡轻工大学的葛文光对大豆肽的生理功能及作用效果进行了研究；郭敏亮采用豆粕生产出大豆肽饮料等。 根据大豆肽的理化特性，可用大豆肽为基本素材，开发肠胃功能不良者和消化道手术病人康复的肠道营养食品的流态食品、降胆固醇、降血压、预防心血管疾病的保健食品，增强肌肉和消除疲劳的运动员食品、婴幼儿及老年人保健食品、促进脂肪代谢的减肥食品、酸性蛋白饮料和用作促进微生物生长、代谢的发酵促进剂等。高F值寡肽高F值寡肽即是由动、植物蛋白酶解后制得的具有高支链、低芳香族氨基酸组成的寡肽，以低苯丙氨酸寡肽为代表，具有独特的生理功能。F值是指支链氨基酸（BCAA）与芳香族氨基酸（AAA）的摩尔比值。 1976年，Yamashita等人首次利用胃蛋白酶和链霉蛋白酶从鱼蛋白和大豆分离蛋白酶解中制得含低苯丙氨酸的寡肽混合物，产率分别为％和％，苯丙氨酸含量分别为％和％。1982年，Nakhost等人用α－胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A酶解大豆蛋白，也制得相似的产物。1986年，Soichi等人进行了多种酶分别酶解乳清蛋白制取低苯丙氨酸寡肽的多种工艺、方法试验，结果以胃蛋白酶－链霉蛋白酶两步水解法为佳，产品得率为％、苯丙氨酸含量为％。1991年，Shinya等人用嗜碱蛋白酶和肌动蛋白酶水解玉米醇溶蛋白，制取了无苦味高F值寡肽，产率为％，F值，AAA含量为％。 1996年，西班牙的Bautista等人用肌动蛋白酶和Kerase中性蛋白酶酶解葵花浓缩蛋白，制取高F值寡肽，产率为％，F值为，AAA含量为％。王梅也在1992年首次采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶降解玉米黄粉；成功地研制出高F值寡肽混合物，产率为％，F值为，AAA含量为％，完全符合高F值制剂的要求，为解决玉米湿法淀粉厂副产品——黄粉的综合利用开创了新路子。 高F值寡肽具有消除或减轻肝性脑病症状、改善肝功能和改善多种病人蛋白质营养失常状态及抗疲劳等功能，除可制作治疗肝疾药品外，还可广泛用作保肝、护肝功能食品，烧伤、外科手术、脓毒血症等高付出病人及消化酶缺乏患者的蛋白营养食品和肠道营养剂，高强度劳动者和运动员食品营养强化剂等。谷胱甘肽（GSH）谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的活性三肽，广泛存在于动物肝脏、血液、酵母和小麦胚芽中，各种蔬菜等植物组织中也有少量分布。谷胱甘肽具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子。日本在50年代开始研制并应用于食品，现已在食品加工领域得到广泛应用。我国对谷胱甘肽的研究尚处于起步阶段。 谷胱甘肽的生产方法主要有溶剂萃取法、化学合成法、微生物发酵法和酶合成法等4种，其中利用微生物细胞或酶生物合成谷胱甘肽极具发展潜力，目前即以酵母发酵法生产为主。 由于谷胱甘肽分子有一个特异的γ－肽键，决定了它在人机体中的许多重要生理功能，如蛋白质和核糖核酸的合成、氧及营养物质的运输、内源酶的活力、代谢和细胞保护、参与体内三羧酸循环及糖代谢，具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老、清除体内过多自由基、解毒护肝、预防糖尿病和癌症等功效，因此而成为机体防御功能肽的代表。谷胱甘肽除可在临床上用作治疗眼角膜疾病，解除丙烯酯、氟化物、重金属、一氧化碳、有机溶剂等中毒症状的解毒药物外，还可用于运动营养食品和功能食品添加剂等。中国在生物活性肽的研究开发上，从事活性肽的研究单位也多从医药角度出发，研究力量及投入较少，限制了活性肽药食两用功能的发挥，市场上国产的活性肽药品和食品寥寥无几。但近几年研究逐步活跃起来，报道渐多，前景看好。当前生物活性肽研究开发的方向是：肽的定向酶解技术开发，包括高效、专一性强的酶种选育、复合酶系共同作用机理、机制，脱苦微生物的分离、纯化和机理研究，酶解工艺改进技术等；功能性肽的分离、分析技术开发，包括新型高效分离设备和分离工艺，灵敏度高、简单易行的目标肽活性分析检测体系和分析技术及下游精制技术；肽的功能性生物学评价研究；生物活性肽功能食品开发等。
大家好，这里是茗创科技。由于对运动伪迹敏感、电磁干扰敏感、成像过程幽闭等原因，现有的脑功能研究技术，如脑电图（EEG），事件相关电位（ERP），功能核磁共振成像（fMRI）不适用于儿童（尤其婴幼儿）等研究对象，亦不适用于自然情境等高生态效度场景的研究和应用。近红外脑功能成像（functional near-infrared spectroscopy，fNIRS）被认为是一种能满足以上要求的脑功能成像技术，为脑科学基础研究和临床应用提供了全新的观测手段。 想了解近红外脑功能成像 (fNIRS)的小伙伴们看过来。 fNIRS是一种利用近红外光无创测量含氧血红蛋白(HbO2)和脱氧血红蛋白(HHb)浓度的新技术。 近红外脑功能成像原理 功能性近红外光谱(fNIRS)是一种新技术，利用近红外光非侵入性测量人脑组织中含氧血红蛋白（HbO2）和脱氧血红蛋白（HHb）的浓度，或它们相对于基线周期的典型变化（ΔHbO2）和（ΔHHb）。fNIRS依赖于神经血管耦合机制，以及近红外光深入生物组织的能力。fNIRS具有无创、安全、便携、对运动伪影敏感性低的特点，已被广泛应用于人体研究（如老年痴呆、婴幼儿及儿童、帕金森病、精神疾病、脑卒中等）。最常见的使用的近红外光谱方法是采用稳态光源和连续波近红外光谱(CW-fNIRS) 。由于CW-fNIRS系统可以无线化和小型化，所以一些应用也已在自由活动的动物身上进行，如山羊、小鼠和绵羊等。 以下整理了关于fNIRS的最新研究内容： 1. Neurophotonics （ ）：在婴儿期使用漫反射光学断层扫描灵敏度研究头皮与皮质对应的发育变化 漫射光学断层扫描（DOT）使用近红外光谱（NIRS）来测量脑血红蛋白浓度的变化。 NIRS数据的结构解释需要准确描述颅脑关系和DOT对底层皮质结构的敏感性。而关于儿童人群的这些信息是有限的，因为他们的大脑发育很快。 该研究旨在考察婴儿（2周至24个月）、儿童（4岁至12岁）和成人（20至24岁）头皮到皮层距离的年龄相关差异以及头皮位置和皮层感兴趣区域（ROI）的影像。使用空间头皮投影和光子传播模拟方法以及基于MRI的年龄匹配的真实头部模型。 结果发现，婴儿的头皮到皮层的距离存在年龄差异，而在儿童和成人中，这种差异会更大。头皮位置和皮质ROI之间的概率映射存在的年龄差异，包括空间投影和DOT敏感性。我们的发现对NIRS/fNIRS数据的准确解释依赖于对DOT敏感性的估计，而DOT敏感性反映了头部和皮层的发育。应使用适合年龄的真实头部模型为婴儿的独立DOT数据提供结构上的指导。 原文：Investigating developmental changes inscalp-to-cortex correspondence using diffuse optical tomography sensitivity ininfancy. 2. Journal of Biophotonics （ ）：通过漫相关光谱法和近红外光谱法评估自闭症小鼠模型中灌注和代谢的量化 需要用于自闭症早期诊断的定量生物标志物。脑血流量和氧化代谢参数可以更好的用于特征对比。扩散相关光谱 (DCS) 已被证明是获得动物和人类脑血流对比的可靠方法。因此，在这项研究中，我们采用DCS和fNIRS评估了应用于已建立的自闭症小鼠模型。结果显示，与对照组(分别为( ± ) * 10-8 cm2/s， ± μmol/100 g/min)相比，自闭症组(p=)血流量( ± ) * 10-8 cm2 /s)显著降低(~40%)，氧化代谢(p=) ( ± μmol/100 g/min)显著降低(~70%)。这些结果表明 DCS 和 fNIRS 的组合可以为无创自闭症病理状况的评估提供血液动力学和代谢对比。 原文：Quantificationof Perfusion and Metabolism in an Autism Mouse Model Assessed by DiffuseCorrelation Spectroscopy and Near-Infrared Spectroscopy. 3. Front Hum Neurosci （ ）：团队协作决策的脑间同步：一项 fNIRS 超扫描研究 在很多情况下，决策行为大多由团队模式（即两个以上的人）组成。然而，缺乏基于大脑模型来认识团队互动如何促进和影响团队协作决策 (TCDM) 行为。为了研究在现实的人际互动情境中，两个人被要求在一个多人囚徒困境游戏中对他们的对手建立TCDM模型，同时使用功能性近红外光谱测量神经活动。 这些实验有两个主要发现。首先，TCDM和ISDM之间存在不同的神经基质，它们受社会环境线索的调节。即，在个体独立决策 (ISDM) 阶段，低激励奖励在左额下回 (IFG) 内产生更高的激活，而背外侧前额叶皮层 (DLPFC) 和中额极区在TCDM阶段被激活。高激励奖励在TCDM阶段在正确的IFG中引起了更高的脑间同步 (IBS) 值。其次，在ISDM期间，男性在DLPFC和中间额极区显示出更高的激活，而女性在TCDM期间在右侧IFG中引起更高的IBS。这些性别效应表明，在个体社会困境情境中，男性和女性可能分别依赖于非社会和社会认知能力做出决定，而在TCDM的社会互动情境中，女性可能同时依赖于社会和非社会认知能力。这项研究为未来TCDM行为的神经科学工作提供了基础和有趣的视角。 原文：Interbrain Synchrony of Team CollaborativeDecision-Making: An fNIRS Hyperscanning Study. 4. Scientific Reports （ ）：重复经颅磁刺激中抑郁症的漫射光学断层成像 重复经颅磁刺激(rTMS)是一种安全有效的抑郁症治疗方法。然而，由于靶目标未优化，理想刺激参数不明确，以及缺乏关于大脑在刺激期间和刺激后的生理反应的信息，其潜力可能会受阻。虽然神经成像是获取这些关键信息的理想方法，但现有的模式由于分辨率低以及电磁频谱的显著噪声干扰而受到限制。 在这项研究中，我们使用了一种新型的漫射光学断层成像(DOT)设备，以加深我们对rTMS在抑郁症中的神经生理学影响的理解。招募年龄在18至70岁的健康和抑郁症被试。治疗参数标准化，以左侧背外侧前额叶皮层为靶点，磁场强度为100%运动阈值，脉冲频率为10 / s，刺激时间为4 s，休息时间为26 s。同时从对侧背外侧前额叶皮层获得DOT成像。最终分析包括6名健康和7名抑郁症被试的数据。成功采集到血红蛋白变化和体素三维激活模式。与健康被试相比，抑郁症被试对经颅磁刺激有延迟和较弱的反应，激活量减少。在这项研究中，我们证明了DOT安全可靠地捕捉和比较抑郁和健康被试的皮质反应模式与rTMS的能力。文中介绍了这种新兴的光学功能成像模式，作为一种研究靶向性、新的治疗参数和抑郁症rTMS生理效应的新方法。 原文：Neuroimaging of depression with diffuse opticaltomography during repetitive transcranial magnetic stimulation. 5. Scientific Reports （ ）：有无自闭症谱系障碍的儿童在摇摆同步任务中的运动和皮层激活：一项 fNIRS 研究 自闭症谱系障碍(ASD)儿童在模仿和人际同步(IPS)等社交嵌入动作方面存在困难。然而，其背后相关的运动特征和潜在的神经机制尚不清楚。该研究比较了ASD患儿和非ASD患儿在不同社会信息水平下进行全身、摇摆同步任务时的运动特征和皮层激活模式。 选择30名有ASD和没有ASD的儿童(平均年龄：岁，SE：岁)参与本研究。当儿童观察到一个成人测试者左右摇摆时，记录其独自摇摆（solo）、与测试者面对面时（face）、有或没有指尖接触（touch）条件下的摇摆 (即IPS)，其运动和基于fNIRS的皮层激活情况。 研究结果发现，与正常发育的非ASD儿童相比，ASD儿童表现出同步性降低和更小的摇摆幅度。总的来说，额外的社会视觉(面部)和社会视觉加上社会触觉信息(触摸)可能会增加到达额顶叶区域的信息，导致皮层激活的放大。然而，ASD儿童在IPS期间，显示其额下回和颞上沟的皮层激活减少。当他们在获得更多社会信息时，皮层激活没有显著增加，这说明ASD儿童可能在感知和处理多重社会信息输入(触觉和视觉)方面存在困难。皮层激活与IPS行为和社交表现显著相关。本研究是第一个考察不同程度的社会信息如何影响自闭症患儿和非自闭症患儿的全身IPS和皮质激活模式的研究，并且确定了ASD相关神经生物标志物可作为评估ASD儿童干预效果的客观指标。 原文：Movement kinematics and cortical activation in children with and withoutautism spectrum disorder during sway synchrony tasks: an fNIRS study. 6. Physiological Measurement （ ）：自闭症静息状态 fNIRS 信号的复杂性改变：一种多尺度熵方法 脑电信号处理中的特征提取和识别对于发展基于脑成像的自闭症谱系障碍（ASD）诊断具有重要意义。在这项研究中，通过多尺度熵（MSE）方法对从双侧颞叶收集的静息态 (RS) 功能近红外光谱（fNIRS）信号的复杂性进行评估。25名ASD儿童和22名正常发育（TD）儿童参与了本次实验研究。MSE的定量分析揭示了ASD儿童RS-fNIRS的复杂性增加。特别是，左侧颞叶在ASD儿童和TD儿童之间存在显著差异，且RS信号和静息态功能连接（RSFC）的复杂性呈负相关。这些结果表明MSE可以作为RS-fNIRS信号表征ASD的一种新方法。 原文：Altered complexity in resting-state fNIRS signal in autism: a multiscaleentropy approach. 7. Scientific Reports （ ）：与年龄相关的表现退化和皮层活动增加，在时间和项目控制 fNIRS 测量上的比较 在我们这个老龄化社会，神经退行性过程的研究是非常有趣的。不同神经认知条件下的皮层激活是一个有前景的预测因子。在此背景下，本研究以区组设计为基础，采用追踪测试(TMT)和功能性近红外光谱法对250名健康老年人(53-84岁)的执行功能进行了调查。从而研究年龄对TMT期间表现和皮质血氧合的影响。 在神经生理学的层面上，各种各样的研究都认为，在执行高要求的任务时，老年人的皮层比年轻人显示出更高的激活，这通常被解释为一种代偿机制的证据 。 例如，Herrmann和Muller等人的fNIRS研究发现，与年轻人相比，老年人的背外侧前额叶皮层(DLPFC)有更多的双侧激活，且激活模式发生改变。另一个与年龄有关的认知能力下降的假说是神经去分化。该假说表明，随着年龄的增长，神经分化程度降低，同时神经加工的选择性和个体大脑区域的功能特异性降低。基于上述认知衰老模型，本研究旨在通过比较两种不同的方法来更好地理解老年神经激活和表现的相互作用：第一，皮层血液氧合(O2Hb during task completion; time-controlled)；第二，项目控制的血氧合（作为附加指标）(O2Hb/item)。 结果显示，与中年个体相比，老年参与者的处理速度显著下降，然而，在TMT a部分，错误率也更低。在神经生理学水平上，我们观察到，在完成TMT时，老年参与者的皮层血液氧合增加。最后，在(O2Hb/item)的测量上，没有发现老年参与者中每个项目的血流动力学皮层反应明显增加。研究结果证实，随着年龄的增长，认知能力会下降，但皮层活动会增加 。 原文：Age-related deterioration of performance and increase of cortex activitycomparing time- versus item-controlled fNIRS measurement. 8. Scientific Reports （ ）：监测青光眼患者对视觉刺激的血流动力学反应 本研究采用时域功能近红外光谱技术(TD-fNIRS)评估了青光眼与健康眼被试在接受视觉刺激后，枕叶皮层的血流动力学响应功能(HRF)。TD-fNIRS与连续光波（CW）fNIRS相比，其优点之一是可以获得组织光学特性的绝对值，即吸收系数(μa)和减散射系数(μs’)。参与本研究的被试共有98名，临床分为健康被试、青光眼患者(原发性开角型青光眼)和混合被试(即对两只眼睛进行不同分类)。对73名健康眼和62名青光眼的HRF进行检查。氧合和脱氧血红蛋白浓度的振幅，及其相对于刺激开始的潜伏期，通过用标准HRF拟合它们的时间过程来估计。 研究发现，青光眼的O2Hb和HHb浓度振幅低于对照组。这表明青光眼患者的视觉通路可能存在多层次的神经元变性，包括枕叶皮层区域。总的来说，本研究发现，TD-NIRS的易用性和无创性使该技术成为更好地评估青光眼病理的支持工具。 原文：Monitoring the haemodynamic response to visual stimulation in glaucomapatients. 9. Scientific Reports （ ）：光子调制使一个困难的认知任务变得不那么费劲 在健康人群中，光神经调制(PNM)对认知和情感功能有积极的作用。此外，PNM对痴呆、创伤性脑损伤、中风和抑郁症患者也有着积极的影响。然而，与改善认知功能(如记忆和执行功能)相关的脑血流动力学变化尚未被探索。最近我们的研究中，对30名老年人在一次分钟的真实或虚假PNM之前和之后进行了认知测试，并采用功能性近红外光谱(fNIRS)检测单剂量PNM后额叶血流动力学的变化，从而评估其额叶功能。结果发现，与刺激前的认知表现相比，只有接受了真实PNM的老年人在刺激后的行动选择、抑制能力和心理灵活性方面有显著改善。且接受真实PNM的人，在视觉记忆任务中有明显的血流动力学反应减少（氧合血红蛋白水平降低）和视觉记忆表现的改善。这些发现表明，PNM可能降低完成需要高记忆负荷的认知任务所需的认知努力。而本次研究的目的是为了进一步检查是否会在年轻的健康成年人中观察到类似的结果。 本实验选取33名健康青年，随机分为对照组和实验组。实验组对前额进行单一的PNM刺激，而对照组进行假性刺激(相同的过程，但没有机器激活)。在刺激前后，所有参与者在0和3个back条件下执行 n -back任务来评估他们的工作记忆功能，并通过fNIRS测量他们在任务期间的血流动力学反应。 研究结果发现，在记忆相关的额叶激活中，有显著的组(实验vs.控制)×时间(PNM前vs. PNM后)交互作用。具体来说，只有实验组的额叶血流动力学水平在这个困难的任务中有显著下降。与记忆相关的额叶激活与Rey Osterrieth复合图形测试的即时和延迟回忆显著相关。因此，PNM可能降低完成高记忆负荷任务所需的认知努力 。 原文：Photoneuromodulation makes a difficult cognitive task less arduous. 10. Scientific Reports （ ）：模拟驾驶中前额叶脑负荷的相关性 : 一项功能性近红外光谱研究 最佳的心理负荷对驾驶表现起着关键作用。通过脑机接口自动适应驾驶员当前心理负荷的驾驶员辅助系统可能会对交通安全做出巨大贡献。为了设计经济的脑机接口而不影响驾驶员的舒适度，有必要确定大脑中对脑负荷变化最敏感的区域。 在本研究中，我们使用功能性近红外光谱和主观评分来测量两个不同需求的虚拟驾驶环境中的心理负荷。结果发现，要求高的城市环境比要求低的乡村环境有更高的主观工作量评分和更高的双侧额中回激活。进一步的空间分辨率分析显示，在右侧前额叶背外侧皮层有一个激活中心，该区域与空间工作记忆处理密切相关。 因此，在复杂环境中，驾驶员心理负荷的主要组成部分可能来自于道路以及其他道路使用者的大量空间信息需要不断维护、处理和更新。我们认为右额中回可能是一个适合应用强大的小区域脑机接口的区域。 原文：Shedding light on the prefrontal correlates of mental workload in simulateddriving: a functional near-infrared spectroscopy study.
1.“小梁切除术296例疗效观察”，《第三届全国青光眼学术会议论文汇编》，1987年，西安临潼2.“搜风止痒汤治疗春季结膜炎疗效观察”，《眼科通讯》，1988年，第3期3.“以银花、地榆、山楂、玉片、为主治疗急性菌痢43例”，《陕西中医函授》，1989年，第1期4.“病毒性角膜炎56例辩证治疗体会”，《陕西中医函授》，1990年，第1期5.“功能性泪溢从肾论治”，《山西中医》，1990年，第1期6.“局部冷敷少量放血治疗麦粒肿”，《陕西中医函授》，1990年，第2期7.“中西医结合治疗眼内出血若干问题的探讨”，《中西医结合眼科杂志》，1990年，8卷，第3期8.“有关药物影响中医眼科临床疗效问题的初步探讨”，《全国中医眼科基础理论研讨会议论文汇编》，1990年5月，湖南，慈利9.“经络学说在眼病诊断上的指导意义”，《新疆中医特色研讨会论文汇编》，1990年10.“伴有全身疾病的老年性白内障手术复明初步体会”，《第二届中国康复医学学术会议论文汇编》，1991年11.“中西医结合治疗眼内出血的研究思路及方法”，《中国临床医学理论与实践》，1991卷12.“辨证治疗高度近视黄斑出血32例”，《中国中医眼科杂志》，1992年，2卷，第2期13.“治目眩验方介绍”，《新疆中医药》，1992年，第2期14.“脾与高度近视黄斑出血发病机制及治疗”，《新疆中医学》，1993年，第1期15.“白内障术后低视力原因分析”，《石河子医学院学报》，1993年，15卷，第1期16.“暴盲125例分例”，《中国中医眼科杂志》，1993年，3卷，3期17.“与《五轮八廓辨证完善论试探》一文作者若干问题的商榷”，《江西中医》杂志，1994年增刊，眼科专辑18.“玻璃体出血”，《中医杂病诊治》，中原农民出版社，1994年6月，第1版19.“392例角膜异物眼前部观察”，《石河子医学院学报》，1995年，17卷，第1期20.“中药治疗青光眼术后持续性前房不形成”，《新疆中医药》，1995年，第4期21.“玻璃体出血三期论文及有关问题述系”，《中国中医杂志》，1995年，5卷，第3期22.“国际眼科会议述要”，《乌鲁木齐医学》，2001年23.“论痰饮眼病的病因病机及辩证”，《中国中医眼科杂志》，2002年，12卷，第3期24.“伴有瞳孔闭锁，瞳孔膜闭的白内障摘除人工晶状体植入术”，《农垦医学》，2002年，24卷，4期25.“新疆老年性白内障临床特点的研究”，《中国实用眼科杂志》，2003年，第13期26.“功能性泪溢从肾辨治的临床探讨”，《新疆中医药》，2003年，21卷，第6期27.“中药对人工晶体膜形成的作用”，《中国中医眼科杂志》，2004年，14卷，第2期28.“白内障超声乳化术后低视力原因分析”，《眼外伤职业眼病杂志》，2004年，26卷，第4期29.“中西医结合治疗重症人工晶体膜形成”，《新疆中医药》，2005年第23卷，第4期30.“改进翼状胬肉剥离及人羊膜移植术临床观察”，《眼外伤职业眼病杂志》，2005年27卷，第1期31.“非缝线固定专用人工晶体睫状沟缝线固定术”，《新疆医学》，2005年，35卷，第4期32.“翼状胬肉切除联合羊膜移植的临床应用”，《新疆医学》，2006年，36卷，第3期33.“非染色囊袋减压撕囊术500眼临床报告”，《国际眼科杂志》，2007年，7卷，第6期34.“抽水囊联合前房成形术治疗睫状环阻滞性青光眼”《新疆医学》2008年，38卷，第11期35.“超声乳化晶状体摘除联合前部玻璃体切除治疗睫状环阻滞性青光眼的临床观察”《中国中医眼科杂志》2008年，18卷，第5期36.“玻璃体切除术后白内障超声乳化摘除人工晶状体植入术临床体会”《新疆医学》2008年，38卷，第2期
蛋白质提取与制备的原理和方法 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白：溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白：一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白：溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出醇溶蛋白：溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇壳蛋白：在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液精蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀组蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等): 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽然有了不改进，但其主要原理仍不外乎两个方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态分为差速离心、超滤、分子筛及透析等方法；按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法；按电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等；按生物功能专一性有亲合层析法等。由于不同生物大分子结构及理化性质不同，分离方法也不一样。即同一类生物大分子由于选用材料不同，使用方法差别也很大。因此很难有一个统一标准的方法对任何蛋白质均可循用。因此实验前应进行充分调查研究，查阅有关文献资料，对欲分离提纯物质的物理、化学及生物学性质先有一定了解，然后再着手进行实验工作。对于一个未知结构及性质的试样进行创造性的分离提纯时，更需要经过各种方法比较和摸索，才能找到一些工作规律和获得预期结果。其次在分离提纯工作前，常须建立相应的分析鉴定方法，以正确指导整个分离纯化工作的顺利进行。高度提纯某一生物大分子，一般要经过多种方法、步骤及不断变换各种外界条件才能达到目的。因此，整个实验过程方法的优劣，选择条件效果的好坏，均须通过分析鉴定来判明。另一方面，蛋白质常以与其他生物体物质结合形式存在，因此也易与这些物质结合，这给分离精制带来了困难。如极微量的金属和糖对巨大蛋白质的稳定性起决定作用，若被除去则不稳定的蛋白质结晶化的难度也随之增加。如高峰淀粉酶A的Ca2+，胰岛素Zn2+等。此外，高分子蛋白质具有一定的立体构象，相当不稳定，如前所述极易变性、变构，因此限制了分离精制的方法。通常是根据具体对象联用各种方法。为得到天然状态的蛋白质，尽量采用温和的手段，如中性、低温、避免起泡等，并还要注意防腐。注意共存成分的影响。如蝮蛇粗毒的蛋白质水解酶活性很高，在分离纯化中需引起重视。纯化蝮蛇神经毒素时，当室温超过20℃时，几乎得不到神经毒素。蝮蛇毒中的蛋白水解酶能被 EDTA完全抑制，因此在进行柱层析前先将粗毒素溶液处理，即使在室温高于20℃，仍能很好的得到神经毒素。整个制备过程一般可分为5个阶段：①材料的选择和预处理②细胞的破碎（有时需进行细胞器的分离）③提取④纯化（包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、层析、超离心及结晶等）⑤浓缩、干燥及保存。以上5个阶段不是要求每个方案都完整地具备，也不是每一阶段截然分开。不论是哪一阶段使用哪一种方法，均必须在操作中保存生物大分子结构的完整性。保存活性防止变性及降解现象的发生。因空间结构主要依靠氢键、盐键和范德华力的存在，遇酸、遇碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均可导致活性丧失。因此选择的条件应为十分温和。同时应注意防止系统中重金属离子、细胞自身酶系及其他有毒物质的污染。蛋白质提取与制备的注意事宜：一、原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C较马的易结晶，马的血红蛋白 较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白 酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白 、贫血血红蛋白 ）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。二、前处理1、细胞的破碎材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性或pH显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失。⑵物理方法主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。Ⅰ反复冻融法于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白 冻结变性。Ⅱ冷热变替法将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。Ⅲ超声波法暴露于9～10千周声波或10～500千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。Ⅳ加压破碎法加一定气压或水压也可使细胞破碎。⑶化学及生物化学方法Ⅰ有机溶媒法粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。Ⅱ自溶法将待破碎的鲜材料在一定pH和适当的温度下，利用自身的蛋白 酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。利用该法可从胰脏制取羧肽酶。自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。于温室30℃左右较早溶化。自体融解过程中PH显著变化，随时要调节pH。自溶温度选在0～4℃，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。Ⅲ酶法与前述的自体融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。但值得提出的是溶菌酶处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量高，而多易结晶化。1g菌体加1～10mg溶菌酶，～内完全溶菌。于生理食盐水或蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出。除溶菌酶外，蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。表面活性剂处理较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡淀及去氧胆酸钠等。此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。2、细胞器的分离制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，对于制备一些难度较大需求纯度较高的生物大分子是有利的。尤其近年来分子生物学、分子遗传学、遗传工程等学科和技术的发展，对分布在各种细胞器上的核酸和蛋白质的研究工作日益增多，分离各种细胞器上的各类核酸和特异性蛋白质已成为生物大分子制备工作重要内容之一。各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。DNA几乎全部集中在细胞核内。RNA则大部分分布于细胞质。各种酶在细胞内分布也有一定位置。因此制备细胞器上的生物大分子时，预先须对整个细胞结构和各类生物大分子在细胞内分布匹有所了解。以肝细胞为例,蛋白质、酶及核酸在肝细胞内分布情况为: 细胞核: 精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系 RNA占总量10%左右 DNA几乎全部粒线体: 电子传递、氯化磷酸化、三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、脲合成等酶 系RNA占总量5%左右 DNA微量内质网（微粒体）: 蛋白质合成酶系、羟化酶系 RNA占总量50%左右溶酶体：水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、组织蛋白酶及糖苷及糖苷酶等） 高尔基氏体: 糖苷转移酶、粘多糖及类固醇合成酶系 细胞膜：载体与受体蛋白、特异抗蛋、ATP酶、环化腺苷酶、5’-核苷酸酶、琥珀酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸酶等 ,细胞液 嘧啶和嘌呤代谢、氨基酸合成酶系、可溶性蛋白类 RNA（主要为tRNA）占总量30%.细胞器的分离一般采用差速离心法。细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。细胞器的分离制备、介质的选择十分重要。最早使用的介质是生理盐水。因它容易使亚细胞颗粒发生聚集作用结成块状，沉淀分离效果不理想，现一般改用蔗糖、Ficoll（一种蔗糖多聚物）或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。1.水溶液提取大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶剂。以盐溶液及缓冲液提取蛋白质经常注意下面几个因素。盐浓度等渗盐溶液尤以～磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用碳酸氢钠液提取等。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合，也常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低，如脱氧核糖核蛋白质需用1mol/L以上氯化钠液提取。总之，只要能溶解在水溶液中而与细胞颗粒结合不太紧密的蛋白质和酶，细胞破碎后选择适当的盐浓度及PH，一般是不难提取的。只有某些与细胞颗粒上的脂类物质结合较紧的，需采用有机溶剂或加入表面活性剂处理等方法提取。PH值蛋白质提取液的PH值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果。如细胞色素C属碱性蛋白质，常用稀酸提取，肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱提取。某些蛋白质或酶与其分物质结合常以离子键形式存在，选择pH3～6范围对于分离提取是有利的。温度多数酶的提取温度在5℃以下。少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化。如胃蛋白酶等及许多多肽激素类，选择37～50℃条件下提取，效果比低温提取更好。此外提取酶时加入底物或辅酶，改变酶分子表面电荷分布，也能促进提取效果。2.有机溶剂提取有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。但一些和脂结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取。从一些粒线体（Mitochondria）及微粒体（Microsome）等含多量脂质物质中提取蛋白质时，采用Morton的丁醇法效果较好。因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10%，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH及温度选择范围较广（pH3～10，温度-2℃至40℃）。国内用该法曾成功地提取了琥珀酸脱氢酶。丁醇法对提取碱性磷酸脂酶效果也是十分显著的。胰岛素既能溶于稀酸、稀碱又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60―70%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可抑制蛋白质水解酶对胰岛素的破坏，同时也达到大量除去杂蛋白的目的。3.表面活性剂的利用 对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，也有采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷基磺酸钠等处理。表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（Triton X-100 、Tirton X-114、吐温60及吐温80）等。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起酶失活，使用较多。对于膜结构上的脂蛋白和结构，己广泛采用胆酸盐处理，两者形成复合物，并带上净电荷，由于电荷再排斥作用使膜破裂。近年来研究膜蛋白使用表面活性剂的稀溶液提取时，较喜欢用非离子型表面活性剂。4.对提取物的保护在各种细胞中普遍存在着蛋白水解酶，提取时要注意防止由它引起的水解。前面所讲的降低提取温度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多数蛋白水解酶的最适PH在3～5或更高些，因在较低PH条件下可降低蛋白质水解酶引起的破坏程度。低pH可使许多酶的酶原在提取过程中不致激活而保留在酶原状态，不表现水解活力。加蛋白质水解酶的抑制剂也同样起保护作用，如以丝氨酸为活性中心的酶加二异丙基氟磷酸，以巯基为中心的酶加对氯汞苯甲酸等。提取溶液中加有机溶剂时也能产生相类似的作用。蛋白水解酶的性质变化很大，上述条件均视具体对象而变化。有一些蛋白含巯基，这些巯基可能是活性所必需。在提取这种蛋白不要带入金属离子和氧化剂。前者可往提取液中加金属螯合剂如EDTA，后者可加入还原剂如抗坏血酸。有某些蛋白质带一些非共价键结合的配基。提取时要注意保护，不要使酸基丢失。蛋白质提取与制备的方法：1.分离纯化的原则从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后操作。常用有机溶剂提取除去。对于异类物质，提纯蛋白质和酶时常混有核酸或多糖，一般可用专一性酶水解，有机溶剂抽取及选择性部分沉淀等方法处理。小分子物质常在整个制备过程中通过多次液相与固相转化中被分离或最后用透析法除去。而对同类物质如酶与杂蛋白、RNA、DNA以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之间产分离，情况则复杂得多。主要采用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超离心法及柱层析法等。其中盐析法、等电点法及结晶法用于蛋白质和酶的提纯较多，有机溶剂抽提和沉淀用于核提纯较多，柱层析法、梯度离心法对蛋白质和核酸的提纯应用十分广泛。如前所述，蛋白质的分离纯化较难，而且其本身的性质又限制了某些方法的使用，因此要研究目的物的微细特征，巧妙的联用各种方法并进行严密的操作，同时有必要了解精制各过程的精制程度和回收率。具有活性的蛋白质可利用吸收光谱等物理性质或以相当于单位氮活性增加为尺度进行追踪。其他蛋白质可用电泳、超离心、层析、扩散及溶解等测定纯度。如结晶核糖核酸酶经层析分为两个成分。可见对确定蛋白质结晶纯度尚无最终的尺度。根据经验即或纯净的标准品，有极微量的不纯物时，也会给实验带来较大的影响。不稳定的蛋白质，如分离SH-酶时使用试剂及缓冲液等，要确认不含重金属离子（特级试剂也需检定）。蛋白质纯化的操作如脱盐、浓缩干燥等均与低分子化合物不同，必须经过独特的繁琐操作。蛋白质和蛋白质相互分离主要利用它们之间的各种性质的微小差别。诸如分子形状、分子量大小、电离性质、溶解度、生物功能专一性等。蛋白质提取液中，除包含所需要的蛋白质（或酶）外，还含有其它蛋白质、多糖、脂类、核酸及肽类等杂质。杂质除去的方法有：A.核酸沉淀法该法可用核酸沉淀剂和氯化锰、硫酸鱼精蛋白或链霉素等。必要时也可用脱氧核糖核酸酶除去核酸。即在粗匀浆中加入少量DNase,于4℃保温30～60min，可使DNA降解为足够小的碎片，以致不影响以后的纯化。B.醋酸铅沉淀法利用醋酸铅沉淀剂除去杂蛋白。因这些沉淀剂也常常使需要的酶（或蛋白质）缓缓变性而失去活性，所以用这类试剂时应迅速进行盐析，使样品与这类试剂脱离接触。C.调pH值或加热沉淀法利用蛋白质酸碱变性性质的差异除去杂蛋白。利用蛋白质的热变性的温度系数差异，可在一定的PH下将蛋白提取液加热到一定的温度，使对热不稳定的杂蛋白性沉淀而除去。D.选择性变性法利用各种蛋白质稳定性的不同，可用选择性变性法来除去杂蛋白 。例如胰蛋白 酶及细胞色素C等少数特别稳定的酶，甚至可用三氯醋酸处理，此时其它杂蛋白 均变性而沉淀，而胰蛋白 酶和细胞色素C则仍留在溶液中。E.透析法小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互转化中被分离，或最后用透析法除去。F.利用溶解度不同的纯化方法2.盐析法盐析法对于许多非电解质的分离纯化均适合。对蛋白质和酶的提纯应用也最早。至今还广泛使用，一般粗抽提物经常利用盐析法进行粗分。也有反复用盐析法得到纯的蛋白质的例子。其原理是蛋白质在低盐浓度下的溶解度随盐液浓度升高而增加（盐溶，与离子强度10～1间成比例增加）。球蛋白 当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出（盐析）（离子强度I2～10）。这是由于蛋白质分子内和分子间的电荷的极性基团有静电引力。当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子一的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质相互聚集而沉淀析出。盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。盐的选择如上所述，蛋白质在水中溶解度取决于蛋白质分子上离子基团周围的水分子数目，即取决于蛋白质的水合程度。因此，控制水合程度，也就是控制蛋白质的溶解度。控制方法最常用的是加入中性盐。主要有硫酸铵、硫酸镁 、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25℃时饱满和溶解度为,即767g/l;0℃时饱满和溶解度为,即676g/l）。在这一溶解度范围内，许多蛋白质均可盐析出来，且硫酸铵价廉易得，分段效果较其它盐好，不易引起蛋白质变性。应用硫酸铵时对蛋白 氮的测定有干扰，另外缓冲能力较差，故有时也应用硫酸钠，如盐析免疫球蛋白 ，用硫酸钠的效果也不错，硫酸钠的缺点是30℃以下溶解度太低。其它的中性盐如磷酸钠的盐析作用比硫酸铵好，但也由于溶解度太低，受温度影响大，故应用不广。氯化钠的溶解度不如硫酸铵，但在不同温度下它的溶解度变化不大，这是方便之处。它也是便宜不易纯化的试剂。硫酸铵浓溶液的PH常在～之间,市售的硫酸铵还常含有少量游离硫酸,PH值往往降至以下,当用其他PH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节.确定沉淀蛋白质所需硫酸铵浓度的方法将少量样品冷却到0～5℃，然后搅拌加入固体硫酸铵粉末，见蛋白质产生沉淀时，离心除去沉淀，分析上清液确定所要蛋白质的浓度，如它仍在溶液中则弃去沉淀，再加更多的硫酸铵于上清液中，直到产生蛋白质沉淀时止。以所要提取的蛋白质在溶液中的浓度对硫酸铵浓度作图，得沉淀曲线，找出蛋白质开始沉淀的浓度。如不考虑收率，饱和度区间可取得窄一些，使纯度高一些。盐析时注意的几个问题:(1)盐的饱和度: 不同蛋白质盐析时要求盐的饱和度不同。分离几个混合组成的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加。每出现一种蛋白质沉淀进行离心或过滤分离后，再继续增加盐的饱和度，使第2种蛋白质沉淀。例如用硫酸铵盐析分离血浆中的蛋白质饱和度达20%时，纤维蛋白原首先析出；饱和增至28～33%时，优球蛋白 析出；饱和度再增至33～50%时，拟球蛋白 析出；饱和度大于50%以上时清蛋白 析出。用硫酸铵不同饱和度分段盐析法，可从牛胰酸性提取液中分离得到9种以上蛋白质及酶。(2)PH值: pH值在等电点时蛋白质溶解度最小易沉淀析出。因此盐析时除个别特殊情况外，pH值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。由于硫酸铵有弱酸性，它的饱和溶液的pH值低于7，如所要蛋白质遇酸易变性则应在适当缓冲液中进行。(3)蛋白质浓度: 在相同盐析条件下蛋白质浓度愈高愈易沉淀。使用盐的饱和度的极限也愈低。如血清球蛋白 的浓度从增至时,需用中性盐的饱和度的最低极限从29%递减至24%.某一蛋白质欲进行两次盐析时,第1次由于浓度较稀,盐析分段范围较宽,第2次则逐渐变窄.例如胆碱酯酶用硫酸铵盐析进时，第1次硫酸铵饱和度为35%至60%,第2次为40%至60%.蛋白质浓度高些虽然对沉淀有利,但浓度过高也易引起杂蛋白的共沉作用.因此,必须选择适当浓度尽可能避免共沉作用的干扰。(4)温度: 由于浓盐液对蛋白质有一定保护作用，盐析操作一般可在室温下进行。至于某些对热特别敏感的酶，则宜维持低温条件。通常蛋白质盐析时对温度要求不太严格。但在中性盐中结晶纯化时，温度影响则比较明显。================================================
你好，请问你是想问蛋白酶在豆制品加工中的应用及发展前景如何吗？蛋白酶在豆制品加工中的应用及发展前景很好。蛋白酶作为重要工业制酶剂,拥有着较高的功能与应用价值,能够催化蛋白质和多肽的水解,蛋白酶主要任在植物茎吐、以及微生物中,无其在食品加工领域,催化食品蛋白质降解的酶主要体现在以下几种:即认为添加的蛋白酶制剂、微生物分泌的蛋白酶、内源蛋白酶。而蛋白酶在食品加工中的应用,为该领域带来了较大的福音,在一定程度上促进了食品行业的发展，所以蛋白酶在豆制品加工中的应用及发展前景很好。