细胞生物学的应用论文

细胞生物学的应用论文

经历了近两年的艰苦努力，《药学细胞生物学》一书终于完稿待印。在欣慰之余，编写组的

全体人员期待着借此书同读者进行学术的交流与沟通。

细胞生物学是最活跃的生物学科之一，其知识结构更新迅速，而药学版细胞生物学书籍国内

外尚无先例可借鉴。为适应学科发展的实际需要，改变国内药学院校细胞生物学课程一直只

能选用《细胞生物学》或《医学细胞生物学》教材而与药学专业有一定偏离的被动局面，我

们竭尽所能，编写了此书。

鉴于本书主要为药学本科专业的生物学基础教材，在编写过程中，既着重考虑了教材所要求

的基础性与系统性，又充分注意到将内容的新颖性与知识结构的合理性相结合。本书的主线

是根据当前细胞生物学与药学两门学科交叉发展的特点与趋势，从细胞、超微结构和分子水

平的不同层次，阐述细胞在生命活动中的规律和本质，特别强调细胞生物学与药学学科的紧

密联系，并提供了一定篇幅的药学示例，以有助于药学专业读者对细胞生物学学科的理解与

把握。本书力求使读者既掌握细胞生物学的基本理论与知识，又增强对药学知识的理解和应

用。

本书虽是应实际所需而编写，但毕竟是初次尝试，编者深感自己的知识水平与能力有限，在

取材范围和编写深度上难免有不当、疏漏甚至错误之处，恳请读者批评指正，以便再版时努

力完善与修正。

编者

2005年9月
作者简介：目录：第一章绪论(1)

内容提要(1)

第一节细胞生物学概述(1)

一、细胞生物学的研究内容(1)

二、细胞生物学发展简史(5)

三、细胞生物学与诺贝尔奖(9)

第二节细胞生物学与现代药学(11)

一、细胞生物学是现代药学的基础理论(11)

二、细胞生物学研究成果与技术在药学领域中的应用(12

)

三、药学细胞生物学的涵义(19)

思考题(20)

参考文献(20)

第二章细胞概述(22)

内容提要(22)

第一节细胞的基本生物学意义(22)

一、细胞是生物有机体的基本结构单位(22)

二、细胞是生物有机体代谢与功能的基本单位(23)

三、细胞是生物有机体生长与发育的基本单位(23)

四、细胞是遗传的基本单位(23)

第二节细胞的化学组成(23)

第三节细胞的形态与大小(24)

一、细胞的形态(24)

二、细胞的大小(25)

三、细胞的计量单位(25)

第四节原核细胞与真核细胞(26)

一、原核细胞的结构特点(26)

二、真核细胞的结构特点(27)

三、原核细胞与真核细胞基本特征的比较(29

)

第五节细胞与药物作用靶标(31)

一、药物作用靶标的概念(31)

二、细胞的药物作用靶标(31)

三、靶标药物在抗肿瘤研究中的应用现状(33)

思考题(33)

参考文献(33)

第三章细胞生物学研究方法与技术(35)

内容提要(35)

第一节细胞形态显微观察技术(35)

一、显微镜的发展简史(35)

二、显微镜的分类(37)

三、显微技术的基本概念与成像原理(38)

四、常用的光学显微镜(44)

五、电子显微镜(48)

六、显微技术在药学领域的应用(58)

第二节细胞化学技术(63)

一、酶细胞化学原理与方法(64)

二、免疫细胞化学原理与方法(65)

三、放射自显影术(67)

四、原位杂交技术(69)

五、问题与展望(69)

第三节细胞及其组分的分级分离与分析(70)

一、细胞的分离与纯化(70)

二、细胞组分的分级分离(73)

三、细胞分离与纯化技术的整合应用(77)

四、细胞组分的显色分析(78)

五、流式细胞计量术及其应用(79)

第四节细胞培养与细胞制药工程(85)

一、细胞培养概述(85)

二、动物细胞培养与Caco-2细胞模型(88)

三、细胞工程制药的主要技术与发展(93)

第五节功能基因组学及其重要研究技术(97)

一、功能基因组学的定义和内涵(97)

二、功能基因组的重要研究技术(98)

思考题(101)

参考文献(102)

第四章细胞膜(103)

内容提要(103)

第一节生物膜的化学组成与结构特征(104)

一、生物膜的化学组成(104)

二、细胞膜的分子结构模型(110)

三、细胞膜的基本特性(112)

第二节物质的跨膜运输(116)

一、小分子物质和离子的穿膜运输(117)

二、大分子物质的膜泡运输(124)

第三节膜表面受体与介导的主要信号转导(129

)

一、离子通道受体(131)

二、G蛋白偶联受体与其介导的信号转导(134)

三、酶偶联受体(142)

四、受体理论与临床用药(147)

第四节细胞膜异常与疾病(148)

一、细胞膜转运系统异常(149)

二、细胞膜受体异常(149)

三、细胞膜与肿瘤(150)

四、细胞膜损伤(151)

第五节细胞膜在药学领域中的研究和应用(152

)

一、药物与细胞膜的相互作用(152)

二、细胞膜研究热点内容(158)

三、细胞膜技术及其在药学研究中的应用(158

)

思考题(164)

参考文献(164)

第五章细胞内膜系统(166)

内容提要(166)

第一节研究细胞内膜系统的方法学(167)

一、放射自显影术(168)

二、荧光蛋白技术(168)

三、亚细胞组分的生化分析(168)

四、无细胞系统(168)

五、遗传菌株突变技术(169)

第二节内质网(169)

一、内质网的基本结构特征(170)

二、内质网的化学组成(171)

三、内质网的类型(172)

四、内质网的功能(174)

五、内质网与疾病(183)

六、分子伴侣及其应用(185)

七、内质网研究展望(188)

第三节高尔基体(188)

一、高尔基体的基本特征(190)

二、高尔基体的功能(194)

三、高尔基体的病理状态(203)

四、高尔基体与药学研究的相互促进(204)

第四节溶酶体(205)

一、溶酶体的基本结构特征与分类(205)

二、溶酶体的功能(207)

三、溶酶体的形成(210)

四、溶酶体与疾病(212)

五、溶酶体的相关药学应用(213)

第五节微粒体与药物代谢(217)

一、微粒体与细胞色素P450酶系(218)

二、药物代谢研究的基本概念与方法(221)

三、重要的CYP氧化代谢酶举例(229)

思考题(234)

参考文献(235)

第六章线粒体(237)

内容提要(237)

第一节线粒体的生物学特征(237)

一、线粒体的形态与结构(238)

二、线粒体的化学组成与酶定位(240)

三、线粒体的增殖方式(242)

四、线粒体的半自主性(243)

第二节线粒体的主要功能(246)

一、真核细胞中的氧化作用(247)

二、氧化磷酸化是代谢能量转换的主要环节(249)

第三节线粒体与医药学(256)

一、病理过程中的线粒体变化及线粒体病的诊断(256

)

二、药物与毒物对线粒体的影响(257)

三、线粒体靶标药物制剂技术(262)

四、线粒体与糖尿病(264)

五、线粒体与细胞凋亡(264)

思考题(265)

参考文献(265)

第七章细胞核(267)

内容提要(267)

第一节细胞核的超微结构与功能(268)

一、核被膜的超微结构与功能(268)

二、染色质的结构与染色体的构建(272)

三、核仁的超微结构与功能(284)

四、细胞核基质(核骨架)(288)

五、细胞核的功能(289)

第二节细胞核异常相关疾病及其治疗(291)

一、遗传性疾病(291)

二、恶性肿瘤(294)

思考题(294)

参考文献(295)

第八章核糖体(296)

内容提要(296)

第一节核糖体的形态结构与存在类型(297)

一、核糖体的形态结构(297)

二、核糖体的存在类型(297)

第二节核糖体的理化性质(298)

第三节核糖体的自组装(299)

第四节核糖体的功能(300)

一、合成蛋白质的类型(301)

二、蛋白质的生物合成(302)

第五节异常情况下核糖体的变化(308)

第六节影响蛋白质合成的药物(308)

一、血红素对血红蛋白合成的调节(309)

二、干扰素对蛋白质合成的调节(309)

三、抗生素对蛋白质生物合成的影响(309)

思考题(310)

参考文献(310)

第九章细胞骨架(311)

内容提要(311)

第一节细胞骨架概述(311)

一、细胞骨架的概念与主要功能(311)

二、细胞骨架的遗传学研究方法(313)

第二节微丝(314)

一、微丝的分子结构(314)

二、微丝结合蛋白(316)

三、肌肉收缩系统(319)

四、微丝的功能(322)

五、研究微丝的遗传学新方法(324)

第三节微管(324)

一、微管的分子结构(324)

二、微管结合蛋白(326)

三、微管组织中心(327)

四、微管的功能(329)

第四节中间纤维(332)

一、中间纤维的类型(332)

二、中间纤维的分子结构(334)

三、中间纤维结合蛋白(335)

四、中间纤维的功能(335)

五、三种细胞骨架的比较(336)

第五节细胞骨架蛋白与疾病及新药开发(336)

一、细胞骨架蛋白异常表达与疾病的举例(336

)

二、微管抑制剂作为抗肿瘤药物的研究与开发(338)

三、功能基因组学为细胞骨架研究提供了新机遇

(347)

思考题(348)

参考文献(348)

第十章细胞增殖(350)

内容提要(350)

第一节细胞周期的基本概念(351)

一、什么是细胞周期(351)

二、细胞同步化(353)

第二节有丝分裂(354)

一、细胞分裂的类型(354)

二、有丝分裂的基本过程(354)

第三节减数分裂(363)

一、间期(365)

二、分裂期(365)

第四节细胞周期调控(369)

一、细胞周期调控的研究背景概述(369)

二、细胞周期的主要调控因子及其调控方式(374)

三、DNA复制的调控(381)

四、细胞周期关卡的调控(382)

五、生长因子的调控(384)

六、蛋白质合成对细胞增殖的影响(384)

第五节酵母细胞周期调控的功能基因组学研究实例(385

)

一、寻找周期性表达的基因(385)

二、M和G1期转录水平达到峰值的基因(386)

三、S期和G2期转录水平达到峰值的基因(386)

四、周期性表达基因的转录调控(386)

五、细胞周期调控的基因表达的保守性(387)

第六节基于细胞周期相关机制的新药开发(389

)

一、细胞周期研究在抗肿瘤新药开发中的应用(389)

二、细胞周期研究在抗病毒与抗真菌药物开发中的应用(

395)

三、利用细胞周期标记分子研究药物作用的机制与筛选新药(395)

思考题(396)

参考文献(397)

第十一章细胞分化(398)

内容提要(398)

第一节细胞分化的概念与胚胎发育过程中细胞分化的潜能变化(398)

一、细胞分化的概念与特点(399)

二、细胞分化的主要标志与研究方法(408)

三、胚胎发育过程中细胞分化的潜能变化(410

)

第二节细胞分化的分子机制与基因表达的调控(414)

一、细胞分化的分子机制(414)

二、细胞分化基因表达的调控(415)

第三节影响细胞分化的因素(419)

一、细胞内部组分对细胞分化的影响(421)

二、位置信息对分化的影响(422)

三、外部信号等对细胞分化的诱导和抑制(423

)

第四节细胞分化及其相关技术在肿瘤研究中的应用(426

)

一、细胞分化与肿瘤(426)

二、干细胞研究的应用价值与肿瘤(433)

三、肿瘤与诱导分化(439)

四、应用蛋白质组学技术研究肿瘤诱导分化的药物靶标(

442)

思考题(445)

参考文献(445)

第十二章细胞凋亡与衰老(446)

内容提要(446)

第一节细胞凋亡的特征与分子机制(447)

一、细胞凋亡的形态学与生物化学特征(447)

二、细胞凋亡与坏死的区别(452)

三、细胞凋亡发生的四个阶段(453)

四、影响细胞凋亡的因素(459)

五、细胞凋亡检测技术(460)

第二节细胞凋亡在药物开发中的应用远景(463

)

一、细胞凋亡异常与疾病(463)

二、细胞凋亡药物的应用远景(464)

第三节细胞衰老(470)

一、细胞衰老的机制(471)

二、抗衰老药物(476)

思考题(480)

参考文献(480)详细介绍：
《药学细胞生物学》为国内第一部将细胞生物学与药学学科有机结合，面向全国高等药学院

校各专业本科生的生物学基础教材。本书以细胞生物学理论、原理和技术为基础，

研究其在新药研发、药学研究以及药品生产等方面的应用。全书共12章，涵盖药学细胞生物

学所涉及的基本理论和一些研究热点，包括绪论、细胞概述、研究方法、细胞膜、细胞内膜

系统、线粒体、细胞核、核糖体、细胞骨架，细胞增殖、细胞分化、细胞衰老与凋亡，并在

各章中融入了相关的药学知识与应用。相信本书的出版将对读者有所启迪，使其更加易于理

解细胞生物学与药学学科的相关知识和技术。

细胞工程论文

细胞工程论文

细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。下面是我为大家整理的细胞工程论文，欢迎阅读。

【摘要】 目的制作去细胞肌肉组织工程支架，并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法 采用TNT和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架，冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养7 d后，用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT3及BDNF的表达,扫描电子显微镜观察其超微结构。结果 支架中细胞去除完全，其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性，并呈现NT3、BDNF免疫反应阳性。扫描电镜显示，羊膜上皮细胞在支架中分布均匀，生长良好。结论 成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架，其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。

【关键词】 去细胞肌肉;人羊膜上皮细胞;生物相容性

近年来组织工程研究的重要进展之一就是采用自体或异体移植物制作天然生物降解材料的组织工程支架。其中去细胞移植物与机体有良好的生物相容性。去细胞肌肉支架可作为生物工程支架支持神经细胞轴突再生。Mligiliche等〔1〕把去细胞肌肉移植入大鼠坐骨神经缺损处,4 w后发现有大量神经轴突长入去细胞肌肉支架中。由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限，去细胞肌肉支架要发挥更大的作用往往需要向支架中植入种子细胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮细胞可分泌多种神经因子〔4，5〕，促进神经元轴突的生长，是一种良好的治疗神经系统疾病的种子细胞。本研究利用化学去细胞的方法制成去细胞肌肉支架，并把羊膜上皮细胞种入去细胞肌肉支架内，探究两者的相容性，为开展组织工程治疗神经系统方面的疾病提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Wistar 大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。

1.1.2 试剂 IMDM培养基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 单克隆抗体购自Neomarker公司;神经营养素(NT)3,脑源性神经营养因子(BDNF)兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司，SABC免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。人羊膜上皮细胞株为本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 去细胞肌肉支架的制备 参考 Brown等〔6〕去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架，简述如下：取Wistar大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50 r/min摇48 h后,转入3%的TritonX100溶液,摇床中37℃、50 r/min摇48 h。然后放入蒸馏水中，摇床37℃、50 r/min摇48 h。换成1% SDS溶液，摇床37℃，50 r/min摇48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存备用。

1.2.2 支架形态结构的观察及成分鉴定 肉眼观察去细胞肌肉的形态。去细胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖90 min，15%蔗糖90 min，30%蔗糖过夜以梯度脱水，OCT包埋，冷丙酮速冻，之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片机切片，HE 染色，观察其内部结构。此外对切片进行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)检测支架的细胞外基质成分。

1.2.3 人羊膜上皮细胞的培养 人羊膜上皮细胞在DMEM培养液中(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素，200 μg/ml的谷氨酰胺)，37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80%汇合后，传代培养。

1.2.4 人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架相容性的鉴定

1.2.4.1 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合，弃去培养液，0.25%胰蛋白酶消化，当胞体回缩，细胞间隙变宽时，用血清终止消化，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液于离心管中，1 000 r/min，离心3 min。用DMEM重悬细胞。用1 ml注射器吸入细胞悬液，以2×106/ml 密度注入去细胞肌肉支架中分装至24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，培养1 w。掺入Brdu(终浓度为10 mg/L)，继续培养1 d后，恒冷箱切片机切片(方法同前)。切片经PBS 洗后，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min，血清封闭20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀释)单克隆抗体，BDNF和NT3多克隆抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜，PBS 洗后，二抗37℃孵育30 min，PBS 洗后，SABC37℃孵育30 min，DAB显色。光镜下观察。

1.2.4.2 扫描电子显微镜鉴定羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架上的生长情况 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合时，用上述方法消化下来后，把羊膜上皮细胞种植到去细胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养7 d后，用2%戊二醛固定后，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥，镀膜，采用扫描电子显微镜观察并拍照。

2 结 果

2.1 支架的组织结构与成分 去细胞肌肉外观呈乳白色,半透明,质地柔软。从大体上看，肌肉去细胞前后整体大小与形状无显著变化。支架纵切面的HE染色观察可见骨骼肌细胞成分消失,而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道。VG+ET染色证明支架成分主要为胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分，胶原纤维为红色波浪状结构，弹性纤维为蓝色丝状结构，见图1。

2.2 羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架的兼容性 见图2，HE染色显示人羊膜上皮细胞在支架中生长良好，分布均匀(图

图1 去细胞肌肉支架大体与组织切片染色

图2 去细胞肌肉支架的病理图片2A)。免疫组化染色显示，BrdU阳性细胞数目多，提示支架中的人羊膜上皮细胞有增殖能力(图2B)。抗NT3和BDNF染色显示，支架中的人羊膜上皮细胞含有NT3、BDNF阳性颗粒，呈棕褐色分布在细胞质中(图2C，2D)。JSM5600LV扫描电子显微镜显示，在支架内部分布有大量细胞，细胞在支架中分布比较均匀，生长状态良好(图2E)。

3 讨 论

理想的支架材料应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去细胞肌肉作为治疗神经损伤的生物工程支架材料有如下优势：(1)去细胞肌肉的细胞外基质成分对组织细胞的'迁移、黏附、生长代谢都有重要作用，研究表明再生的轴突可以很好的黏附在去细胞肌肉支架上〔9〕。(2)去细胞肌肉的排列结构与神经膜管类似,仅在直径上略大于神经膜管〔10〕，它们提供了轴突可生长穿过的足够空间〔9〕，该结构对于诱导神经轴突再生是十分重要的。 Fansa等比较了接种施万细胞的不同去细胞生物材料(肌肉，静脉，神经外膜)桥接缺损的外周神经的结果，发现缺乏神经膜管样结构的去细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突是无序和排列混乱的，而有神经膜管样结构的去细胞肌肉支架中的再生轴突是有序排列的〔11〕。这种轴突再生的有序性对神经损伤的轴突再生同样也是十分重要的。(3)去细胞肌肉引起的免疫排斥反应较小〔9，12〕。这些优势都说明去细胞肌肉可作为治疗神经损伤的理想的材料。本研究采用的制作去细胞肌肉的方法主要用来减少异种移植材料的免疫排斥反应。该方法能有效的去除脂膜和膜相关抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留细胞外基质成分的原始空间结构。肌细胞正常呈平行分布，其细胞外基质成分也是平行分布的，从支架纵切面的结果看支架的纤维成分也是平行排布的，VG+ET染色结果显示细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完好。这些结果进一步证实此方法可成功制备去细胞肌肉支架。

由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限〔13〕，去细胞肌肉的生物相容性也有待验证。本研究用人羊膜上皮细胞作为种子细胞种入去细胞肌肉支架以探讨其相容性。研究表明，羊膜上皮细胞中含有多种生物活性因子，包括黏蛋白、转移生长因子、前列腺素E、表皮生长因子样物质,IL1，IL8 等因子，另外，还可分泌BDNF和NT3等重要的神经营养因子〔4〕。其中层黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子对神经损伤的治疗具有十分重要的作用。羊膜上皮细胞可作为一种较理想的种子细胞，与去细胞肌肉支架结合可能成为治疗神经系统疾病的一个理想的组织工程材料。本实验观察到人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中分布均匀，抗BrdU、BDNF及NT3免疫组化显示去细胞肌肉支架中羊膜上皮细胞有良好的增殖能力，并能表达BDNF和NT3，说明羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中保持了良好的生物学活性。以上结果一方面证明了本研究制作的去细胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面为应用羊膜上皮细胞和去细胞肌肉支架结合治疗神经系统疾病提供了理论和实验基础。

总之 ，本研究成功制备了去细胞肌肉支架，并证实人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中能分泌重要的神经营养因子，人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体为神经缺损再生提供了基底膜、神经营养因子等种种有利因素，构成了良好的神经再生微环境，有利于使神经缺损得到较好地修复，为进一步研究羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体治疗神经损伤奠定了一定的实验基础。

【参考文献】

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11 Fansa H，Keilhoff ison of different biogenic matrices seeded with cultured Schwann cells for bridging peripheral nerve defects〔J〕. Neurol Res,2004;26(2):16773.

12 Brown AL，Farhat W，Merguerian PA,et al.22 week assessment of bladder acellular matrix as a bladder augmentation material in a porcine model〔J〕.Biomaterials,2002;23：217990.

13 李培建，李兵仓，胥少汀.肌基膜管移植修复脊髓缺损的实验研究〔J〕.中华创伤杂志,2001;17(9)：5258.

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激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用》
摘要激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图象分析仪器，现已广泛应用于荧光定量测量、共焦图象分析、三维图象重建、活细胞动力学参数监测和胞间通讯研究等方面。其性能为普遍光学显微镜质的飞跃，是电子显微镜的一个补充。本文以美国Meridian公司的ACASULTIMA312为例简要介绍了激光扫描共聚显微镜系统的结构，功能和生物学应用前景。

关键词; 激光；共聚焦显微镜；粘附细胞分析与筛选（ACAS）
TheLaserScanningConfocalMicroscopySystemanditsBiologicalApplications

ChenYaowen,LinJielong,LaiXiaoying,MeiPinchao

(e,CentralLab,ShantouGuangdong515031)

AhstractTheLaserScanningConfocalMicroscopyisanewmedicalimageanalysisinstrument,swidelyappliedinsuchfieldsasfluorescentquantitativemeasurement,conpocalimageandlyusis,3-Dreconstruction,Kineticsignalmonitioringoflivingcell,cellcellcommunicationresearches,paper,ACSAULTIMA312(MeridianCo,USA)istakenasanexampletointroducetheprincipleofconfocalmicroscopy,itsfunetionsandbiologicalapplications.

KeywordsLaserConfocalMicroscopyAdherentCellAnalysisandsorting(ACSA)

激光扫描共聚焦显微镜（LaserscanningConfocalMicroscopy，简称LSCM）是近代生物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域[1、2、3]，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，为这些领域新一代强有力的研究工具。

创建于1983年的美国Meridian公司，在90年代推出的“激光扫描共聚焦显微镜”这一项具有划时代的义意的高科技产品，曾获得美国“政府新产品奖”和两次“高科技领先技术奖”，它能达到每秒120幅画面的高速扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真彩色的激光共聚焦原色图象。我院最近引起的ACASuLTIMA312是Meridian公司最新的高科技产品，为同类仪器中档次最高、功能最全的精密仪器。现以该仪器为例介绍激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用。

1、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成

有关共聚焦显微镜的某些技术原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜[5]，1985年WijnaendtsVanResandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章，到了1987年，才发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。

激光扫描共聚焦显微镜成像原理如图1所示，激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜，变成一束直径较大的平行光束，长通分色反射镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发射沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚焦透镜、会聚在聚焦物镜的焦点处，再通过焦点处的针孔，由检测器接收。

从图1中可以看出，只有在物镜的焦平面上发出的荧光才够到达检测器，其它位置发出的光均不能过针孔。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上，因而称这种方式成像的显微镜为共聚焦显微镜为共聚显微镜。在成像过程中针孔起着关键作用，针孔直径的大小不仅决定是以共聚焦扫描方式成像还是以普遍学显微镜扫描方式成像，而且对图像的对比度和分辨率有重要的影响。

ACASULTIMa312采用快速镜扫描或台阶扫描对样品逐点扫描成像，由于样品中不同的扫描点始终在物镜和会聚透镜的光轴上，因而它以相同的信噪比扫描整个样品，扫描精度达0.1μm，扫描面积最大的为10cm×8cm，当激光逐点扫描样品时，针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，并将之转化为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚聚焦图像。一个微动步进马达控制栽物台的升降，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标本相应的光学横断面的图像。这称为“光学切片”。再利用计算机的图像处理及三维重建软件。可以得到高清晰度来表现标本的外形剖面，十分灵活、直观地进行形态学观察。

2、激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统

2.1ACASULTIMa312硬件及参数指标 激光光源：氩离子激光（50mW的紫外光、999mW的可见光），能同时/顺序/分别输出紫外光和可见光，激发波长为351-364nm；488nm；514nm。 计算机系统：80586/133MHzPCI/80MBRAM/2000MBSCSI硬盘/150MBBernoulli盘驱动器/17’’大屏幕显示器。 共聚焦系统：计算机自动控制光路准调节；计算机控制孔径校准；计算机调节孔径大小；自动Z轴调节（最小0.1μm）。 光学探测系统：3个测窗式PMT采集荧光；1个CCD系统；12位的高速A/D转换器。 图像分辨率：图像大小1535×1535；像素最小距离：0.1μm；灰度为4096级。 扫描方式：快速镜扫描DualScan台阶扫描；扫描精度0.1μm；扫描面积最大为10cm×8cm；扫描平面：XY和XZ和独特点、线、面扫描。2.2激光扫描共聚焦显微镜软件系统

ACASULTIMa312系统采用独特设计的软件将激光细胞仪与先进的计算机技术结合，产生快速、高效、灵活的操作系统，完备的数据采集、分析与管理功能。基于生物医学研究有如下的软件。

ImageAnalyze—对于单色、比色和三色标记的二维荧光图像的定量分析，可产生透射光图像重叠，同时AutoImage可多个区域的自动扫描和荧光定量，以及相同区域的时间顺序扫描。 RatioAnalysis和Kinetics—测定细胞内的离子变化，可有点扫描、线扫描及图像扫描三种测定形式，以监测各种速率的生物反应。 Cell–CellCommunicationandFRAP-相邻细胞的FRAP分析。该软件首先用可光淬灭特异的细胞荧光，然后在多个时间点扫描，此扫描可对单一区域或细胞的多个选择区域，可产生透射光图像并与其它图像重叠。 CellList—储存被选择细胞的位置，即可自动对较大样品进行扫描，又可产生较小样品特异部位的网络位置表，以进行自动的测量、筛选和重复测定。 CellSorting—ACAS具备如下四种分选方式： AblationSort:预选定义一个荧光阈值，然后对特定细胞杀伤。②CookieCutterSort在用户定义的中心点四周切割Cookies。③QuickSort：对已定义的细胞表列，用Ablation或CookieCutter作分选。④ManualSort：直接使用鼠标控制载物台位置及激光脉冲，并杀灭和分选细胞，进行细胞显微外科，染色体切割和光隐阱等操作。 ConfocalImaging—共聚焦分析，可实现Z轴定量，三维立体图像分析（包括SFP模拟荧光处理法，DP深度投影法和SP文体投影法），以及视点移动动画。

3激光扫描共聚焦显微镜在细胞生物学中的应用

3.1定量荧光测量

ACAS可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。
3.2定量共聚焦图像分析

借助于ACAS激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化，如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。

3.3三维重组分析生物结构

ACAS使用SFP进行三维图像重组，SFP将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。

3.4动态荧光测定

Ca2+、pH及其它细胞内离子测定，利用ACAS能迅速对样品的点，线或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如Indo-1、BCECF、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。

3.5荧光光漂白恢复（FRAP）--活细胞的动力学参数

荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过ACAS可直接测量分子扩散率、恢复速度，并由此而揭示细胞结构及相关的机制。

3.6胞间通讯研究

动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内Ca2+,PH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。

3.7细胞膜流动性测定

ACAS设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。

3.8笼锁—解笼锁测定

许多重要的生活物质都有其笼锁化合物，在处于笼锁状态时，其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在细胞的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用ACAS可以人为控制这种瞬间光的照射波长和时间，从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。

3.9粘附细胞分选

ACAS是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学仪器，它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法：（1）Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司专利技术，首先将细胞贴壁培养在特制培养皿上，然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何形状，而非选择细胞则因在八角形之外而被去除，该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞，即使百万分之一机率的也非常理想。（2）激光消除法，该方法亦基于细胞形态及荧光特性，用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整活细胞亚群继续培养，此方法特别适于对数量较多细胞的选择。

3.10细胞激光显微外科及光陷阱技术

借助ACAS可将激光当作“光子刀”使用，借此来完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体、溶酶体等细胞器、染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞外科手术。通过ACAS光陷阱操作来移动细胞的微小颗粒和结构，该新技术广泛用于染色体、细胞器及细胞骨架的移动。
4、结语

激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图像分析仪器，与传统的光学显微镜相比，大大地提高了分辨率，能得到真正具有三维清晰度的原色图象。并可探测某些低对比度或弱荧光样品，通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量Ca2+、pH值，Na1+、Mg2+等影响细胞代谢的各种生理指标[9]，对细胞动力学研究有着重要的意义。同时激光扫描共聚显微镜可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏，更接近细胞生活状态参数测定。可见激光扫描共聚焦显微镜是普遍显微镜上的质的飞跃，是电子显微镜的一个补充，现已广泛用于荧光定量测量，共焦图像分析，三维图像重建、活细胞动力学参数分析和胞间通讯研究等方面，在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。

生物细胞小论文

论细胞生物学的发展 悠悠300余年，关于细胞的研究硕果累累；近50年来更进入了分子水平，老树又绽新花。许多研究成果已经或将要走进我们的生活：植物细胞在培养瓶中悄然长成幼苗；动物体细胞核移植诞生了克隆动物；不同生物细胞间DNA的转移创造出新的生物类型及其产品；病危的生命期盼着干细胞移植的救助…… 现在，生物学在人类的生产生活中的使用愈加广泛。美国细胞生物学家威尔逊曾经说过：“每一个生物科学问题的答案都必须在细胞中。”这句话明显说明了细胞生物学对整个生物科学的研究有着怎样的重要性。细胞生物学的发展，越来越受到人们的重视。 谈起细胞生物学，不得不提的是建立于19世纪的《细胞学说》。《细胞学说》的建立可谓是自然科学史上的一座丰碑。《细胞学说》的两位建立者——德国科学家施莱登和施旺。经过长时间不断的探索和研究，分别从结构、功能和分裂三个方面对细胞进行了探究，并从中提炼出了三个要点，构成了《细胞学说》的主体。《细胞学说》的建立，不仅为达尔文的《进化论》奠定了基础，更为后人对细胞生物学的研究，做出了巨大贡献。 在细胞学说创立的100年间，人们对细胞的研究基本停留在简单观察和形态描述的水平，细胞在生物学家的眼中多多少少还像一团胶状物，里面杂乱地散布着一些含混不清的东西。此时出现了一名科学家——美国的细胞生物学科学家克劳德，他决心把细胞内部的组分分离开，探索细胞内组分的结构和功能。当时分离细胞器所遇到的困难是今天的人们难以想象的。许多人对他冷嘲热讽，认为把好好的细胞弄碎是毫无意义的。但是克劳德坚信，要深入了解细胞的秘密，就必须将细胞内的组分分离出来。经过艰苦的努力，他终于摸索出采用不同的转速对破碎的细胞进行离心的方法，将细胞内的不同组分分开。这就是一直沿用至今的“转速离心法”。 如果说《细胞学说》是通往细胞生物学的一扇门，那么我认为克劳德的“转速离心法”便是这扇门的钥匙。这种方法的发现，使人类对细胞内部的进一步探究，有着非常重要的意义。 随着对细胞内更深入的探究，人类发现了细胞中一个新的世界。细胞中每个组分如此精巧，一个个小小的细胞器，在细胞中都起到了非常关键的作用。霍中和院士在《细胞生物学》中写到：“我确信哪怕最简单的一个细胞，也比迄今为止设计出的任何只能电脑更精巧。”人类也曾经试图组装出一个细胞。1990年，科学家发现人体生殖道支原体可能是最小、最简单的细胞。1995年，美国科学见文特尔领导的研究小组，对这种支原体的基因组进行了测序，发现它仅有480个基因。如果在480个基因中辨认出对细胞生活必不可少的“基本基因”，那么就有希望人工合成这些基因——一段不很长的DNA分子。 文特尔的方法是破坏一个又一个的基因，看那些基因是绝对不可或缺的，终于筛选出了300个对生命活动必不可少的基因，但其中100个基因的重要性尚不清楚。 文特尔以及其他一些科学家认为，如果能人工合成这300个基因的DNA分子，再用一个细胞膜把它和环境分隔开，在培养基中培养，让他能够生存、生长和繁殖，组装细胞就成功了。科学家现在已经能够合成长度为5000个碱基因对的DNA片段，文特尔估计生殖道支原体的DNA的碱基对比这要多100倍，因此，DNA的人工合成还需要方法上的创新。怎样给DNA分子包上细胞膜也是一个难题。他们的设想是，把生殖道支原体细胞的DNA破坏掉，再把人工合成的基因组“注入”支原体细胞。 有关实验还在进行中，不过可以确信的是，人类对细胞生物学的研究愈加深入，对人类今后的发展就愈加有利。通过不断的科学探究和深入研究，我相信在不久的将来，细胞生物学将成为一个重要的科学领域，会吸引更多的人去探索、研究。它也会绽放出他耀眼的光辉，来迎接着这崭新的时代！