基因编辑论文3000字

基因编辑论文3000字

最近被朋友圈和各大公众号基因编辑婴儿的文章链接和评论刷屏了，因为这个事情和每个人的未来息息相关，涉及范围广泛，不同的大V出现了两极分化的观点，不同的观点也一直在激烈的碰撞。

生物医学界普遍强烈谴责这种行为，我们群也进行了激烈的讨论，尤其群里有生物医学界的学霸。发表了两点观点：“在人没有疾病的情况下，人为的为了做实验编辑基因，对人不带来治疗效果，而是带来潜在风险”。这两个小孩原本就是健康的小孩，在我眼里这样的做实验人的目的完全是为了自己的成功和出名。

第二点，学霸提到：“还记得几个月前出了个新闻用基因编辑方法可以把蚊子灭绝吗？同样的技术，用在不同生物上也会有类似的效果，制约大家的就是行业规范和伦理。结果，现在，这些全被击穿了”。

这样的一个如同基因的核弹武器具有巨大的威力，是需要收到严格限制和管控的。因为威力巨大，用的人不同，会具备毁灭性打击，进攻总是比防守容易。千万不能低估大众的想象力。

这次的新闻广泛的传播，基因编辑撕开了一个口子后，有多少人会幻想去做这方面的试验，尤其是有先天性遗传病的，生健康小孩困难的，已经有不同想法的有钱人，觉得自己这代不行，想要靠下一代好基因的普通人.......

第三点，“这样的生物技术出现，以后就会让人种分离——穷人和富人，无论生理技能和寿命都将不一样”。人人生而平等，就是无论贫穷还是富有，下一代的基因都是相差无几的，这个情况如果下去，无非这些结果。

“弱小和无知不是生存的障碍，傲慢才是”——《三体》里面贯穿整个小说的一句话想送给大家。当我们拥有不属于自己的超力量时候，比如核弹，基因改造.....就像一个反对的大V所说“当人类把自己想象成上帝，那将是最可怕的灾难的开始。”

也有一个大V说了这个事件对未来的影响“基因编辑婴儿，这个技术已经打开，那就关不上了，尤其是有明确好处时，舆论的谴责，法律的禁止，都无法阻止想要的人们得到它。接受也罢，抗拒也罢，它终将改变人类。”我不否认这个以后可能会发展到，地下操作这些事情，完全禁止总是非常理想化的。现实中，不同的人的道德水平和关于道德伦理的理解实在是千差万别的。

很多人看到这次的新闻，仿佛置身于科幻文章一样。我自己从小也是科幻谜，初中开始就一直每月看《科幻世界》，高中开始在《科幻世界》中追刘慈欣的《三体》连载，现在反复看了很多遍。那么多年前那么多篇科幻世界的文章，对其中两篇婴儿的基因改造科幻文，非常印象深刻。

第一篇短篇科幻文章：

里面的科学家是顶尖的生物医学界的科学狂人，他致力于通过科学改造出来最完美的人类小孩，设置出来完美小孩之前，他的朋友一直反对他在做上帝的工作，但是已经来不及反对了。

就像这两天的双胞胎已经出生了。很颠覆的一刻来临，他虔诚的看着他的实验室出来的那个完美婴儿，结果出来的是一个非常普通，和别的婴儿毫无差别的人类小孩……

这篇科幻明显的写了一个故事，我们不断追求完美的小孩其实已经存在，宇宙创造我们就已经很完美了。

第二篇短篇科幻文章：

一位女科学家，觉得每个婴儿从成长的过程要学的东西，是耗费十几年的。因为如此，科技的增长才非常缓慢。于是她研究出，母体的记忆，感受，经历，和思维是同样遗传给腹中胎儿的。

她疯狂开始做人体试验，第一个实验中婴儿是研究所的一位保洁阿姨，怀孕的小孩。当这个小孩还在肚子里面的时候，已经拥有保洁阿姨这半辈子的记忆，感受，学识，思维所有她脑中的东西，在小孩脑子也有。

于是小孩子尚在肚子里的时候，开始和她们两个沟通聊天。和她妈妈回忆起，她妈小时候，大字不识，成长过程差点在农村里面就夭折的各种辛苦的经历。回忆她那时候去县城，几十公里，从农村一路走过去，脚磨的起泡，在路边饥渴难耐的感觉。

保洁阿姨对着腹中胎儿说，这些都过去了，现在生活也慢慢变好了，期待着胎儿的降生。结果胎儿反应剧烈，她对世界所有的认知都是母亲这么艰辛的半辈子，她受不了自己也要过那样的人生，这与母亲腹中羊水温暖的环境天渊之别。

不管这个女科学家和保洁阿姨怎么对胎儿说未来的生活会越来越好的，胎儿始终不信，总记得她妈这么多年的苦难……觉得自己是肯定过不了那么难的生活，然后婴儿就在肚子里面用脐带缠绕了自己的脖子，自杀了。

直到这样，这个女科学家才明白，无知其实是对婴儿成长的重要保护。

我看过那么多篇科幻文章，当我们想象自己在那个世界之后，再回到现实世界，会异常珍惜现实世界的平和和幸福，这些我们习以为常的东西，待我们进入科幻的世界后，才会发现，我们以为的理所当然，其实只是偶然。

活生生的陷害——用700字让你看明白“基因编辑双胞胎事件”

2.好了，现在又有一个人觉得自己长得很一般，他想一劳永逸，自己一般也就算了，关键是不能让后代一般啊。那怎么办呢，直接敲除受精卵中影响长相的基因，也就是后代先天就没有了那些缺陷基因。

3.好，现在他的后代出生了，这些后代也是人， 是人就有正常结婚生育的权利 。那么……

4.第一个问题，也是最大的一个问题： 整个人类的基因从今天开始就可以说被污染了。

哪怕仅仅追溯到现代智人走出非洲，也是六万年过去了，再往前追溯则是几十万几亿年，这么多年来， 人这种生物的基因可以说是经受了极其严苛的挑选，从大尺度看，不仅每一种基因都有用，目前的基因组合结构更不能动。 但这对双胞胎，已经动了基因， 她们与所有人类的蓝本都不同了，她们将来和其他人结婚生子，后代会是什么样子，我们不知道，有些后果很可能需要数代人之后才呈现。

5.目前的基因编辑技术只能敲除， 无法修补，也就是这个过程不可逆。

6.基因编辑技术 很可能出现脱靶现象 ，哪怕我们见到的这对双胞胎是成功敲除了ccr5基因，但有没有改动到其它基因我们不知道，也就是说， 错误很可能不止一个。

7. 很多病并不是单基因问题 ，人体是个复杂的系统工程，人类对基因的认识极其有限。北欧大概有1%的人先天就有ccr5基因缺陷，从不得艾滋病，但这些人患流感的死亡率更高。

8.这件事更需要警惕的是，开了一个极其恶劣的先河。那就是 把基因编辑从治疗用于防治，那你可以防我为什么不能防？ 在基因编辑不成熟的情况下，大家都去弄， 那人类很快就会走进一条死路。 如果基因编辑技术很成熟， 那就是永无止境的贫富分化， 因为富人永远可以把自己孩子的基因编辑得更好。

最后一句话，这件事其实是个别人算计甚至陷害了整个人类。

CRISPR/Cas9：基因编辑的历史与发展

[](_javascript:void(0);)

|

CRISPR/Cas系统是细菌和古菌特有的一种天然防御系统，用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。当外源基因入侵时，该防御系统的 CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的 RNA，然后 CRISPR 相关酶(Cas)在序列识别处切割外源基因组DNA，从而达到防御目的。

根据Cas蛋白的特点，可将CRISPR/Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系统需要借助复杂的蛋白复合体发挥作用，Ⅱ型系统仅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可对靶目标进行编辑，结构简单，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系统。

CRISPR/Cas自诞生以来，迅速发展，已经成为生命科学领域最耀眼、最有前景的技术。尤其是近两年，在全世界科学家的共同努力下，CRISPR/Cas相关新进展新突破不断涌现。

一、基因编辑技术的发展史

基因编辑可以分为三代，第一代：ZFN；第二代：TELEN；第三代：CRISPR/Cas。这三个基因编辑技术都利用了DNA修复机制，所以我们先来了解一下DNA修复机制（ 图1 ）。[图片上传失败...(image-8dab49-1625385468208)]

图1-NHEJ修复（左），HDR修复（右）

NHEJ（Non-homologous end joining）

非同源性末端接合

NHEJ修复机制不需要任何模版，修复蛋白直接将双股裂断的DNA末端彼此拉近，在DNA连接酶的帮助下重新接合（ 图1 ）。

HDR（Homology directed repair）

同源重组修复

当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，HDR才能发生。

NHEJ的机制简单又不依靠模版，因而NHEJ的活性相对于HDR高出许多。但NHEJ修复出错的概率较高，容易造成移码突变等，基因编辑正是利用了这一点（ 图1 ）。

的识别切割机制

融合锌指模块和FokI切割结构域形成ZFN ；以二聚体的形式靶向切割每个锌指结构；特异识别3个碱基 ；组装多个锌指结构(识别12-18bp)形成的ZFN对可特异切割基因组靶点 （ 图2 ）。

[图片上传失败...(image-3f1d8d-1625385468209)]

图2-ZFN基因编辑原理图

的识别切割机制

两个TALE靶向识别靶点两侧的序列；每个TALE融合一个FokI内切酶结构域；FokI通过TALE靶向形成二聚体切割靶点；设计灵活识别特异性强（ 图3 ）。

[图片上传失败...(image-6dcfc-1625385468209)]

图3-TELEN基因编辑原理图

Cas9的识别切割机制

crRNA通过碱基配对与 tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA（ 图4 ）。

[图片上传失败...(image-c85235-1625385468209)]

图4-CRISPR/Cas9基因编辑原理图

ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9比较

[图片上传失败...(image-dd6344-1625385468209)]

图5-三种基因编辑的比较

二、CRISPR/Cas技术的介绍

CRISPR/Cas9 系统的发现

1987年，在大肠杆菌的基因组中首次发现了一个特殊的重复间隔序列——CRISPR序列，随后，在其他细菌和古菌中也发现了这一特殊序列。

2005年，发现这些CRISPR序列和噬菌体的基因序列匹配度很高，说明CRISPR 可能参与了微生物的免疫防御。

2011年，CRISPR/Cas系统的分子机制被揭示：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR 转录生成 前体crRNA (pre-crRNA)， pre-crRNA 经过加工形成含有与外源基因匹配序列的crRNA，该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后，介导 Cas 蛋白结合并切割，从而保护自身免受入侵。

2013年，发现CRISPR/Cas9系统可高效地编辑基因组。随后张锋等使用CRISPR系统成功的在人类细胞和小鼠细胞中实现了基因编辑。

从此开始，CRISPR/Cas9技术给生命科学领域带来了巨大冲击，CRISPR/Cas9相关研究成果频频登上CNS等顶级期刊，近两年更是成为诺贝尔奖热门候选。

CRISPR/Cas技术的原理

CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA，改造成具有引导作用的sgRNA （single guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割（图4）。

CRISPR/Cas技术的优势

设计简单，简明的碱基互补设计原则，识别不受基因组甲基化影响，能靶向几乎任意细胞任意序列，方便同时靶向多个靶点，切割效率高。

三、CRISPR/Cas的脱靶效应

PAM**** (Protospacer adjacent motif )

前间区序列邻近基序

PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件。如果靶序列 3′端没有PAM序列，即使靶序列与sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不会切割该序列位点。 PAM序列主要影响CRISPR/Cas9的DNA切割效率。在细胞水平上，NGG介导的切割效率是最高的。

sgR****NA ****(Single guide RNA )

向导 RNA

sgRNA与目标基因组相结合的 20nt 序列区决定着 CRISPR/Cas 系统的靶向特异性。CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性其实主要依赖于sgRNA与靠近PAM区的10~12 bp的碱基配对，而其余远离PAM序列 8~10 bp 碱基的错配对靶位点识别的影响并不明显。目前研究结果均提示，可能靠近 PAM 的 8~14 bp 序列是决定特异性的关键，其他序列也均在不同程度上影响脱靶效应。

CRISPR/Cas9的脱靶效应给研究带来了一定程度上的不确定性，也是限制其发挥更大潜力的主要原因之一。

2017年5月30日， Nature 杂志子刊 Nature Methods 刊登了美国哥伦比亚大学研究人员的一篇文章，研究人员通过CRISPR/Cas9成功修复了导致小鼠失明的基因后，对小鼠进行全基因测序，发现修复后的小鼠基因组有超过1500个单核苷酸突变，以及超过100个位点发生大片段插入或缺失（ 图6 ）。文章的结论无疑引发了巨大震动，也给正在进行中的CRISPR/Cas9带来了不确定性。

[图片上传失败...(image-f21b76-1625385468208)]

图6--动物体内实验中CRISPR/Cas9编辑后发生意想不到的突变

仔细分析后，发现该文章并不十分严谨，文章仅有两只小鼠作为实验组，一只作为对照组，数量不足以证明结论是否只是个例。而且单碱基突变是生物体内自然现象，不能全归于CRISPR/Cas9。整个实验只基于一个sgRNA数据，且该sgRNA特异性评分很低，造成脱靶效应也应该在预料之中（ 图7 ）。

[图片上传失败...(image-751d94-1625385468208)]

图7--针对 Nature Methods 文章的回应

经过一系列的研究和改进，目前CRISPR系统的脱靶性已经很低，当然，要想达到理想的状态，还有很长的路要走。

四、CRISPR/Cas技术的进展

2016年6月，张锋在 Science 发表文章，发现CRISPR/Cas13a能有切割细菌的特定RNA序列。

2016年9月，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，证实CRISPR/Cas13a可以用于RNA检测。

2017年2月22日，美国纪念斯隆.凯特林癌症中心（MSK）研究人员在 Nature 杂志发文，使用腺相关病毒（AAV）介导，将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于CAR-T疗法。该研究既解决了传统CAR-T疗法的随机整合可能存在的潜在危害，又大大降低了CAR-T细胞发生分化或癌化的风险，赋予了CAR-T技术全新的高效性、稳定性、安全性。

2017年8月2日，Shoukhrat Mitalipov在 Nature 发表长文，使用CRISPR/Cas9技术修正了植入子宫前的人类胚胎中一种和遗传性心脏病有关的变异。该研究证实了通过编辑人类胚胎进行治疗遗传病是安全可行的。值得一提的是，该成果受到了基因编辑领域大牛George Church等人的质疑。

2017年8月11日，杨璐菡等在 Science 发表文章，通过CRISPR/Cas9技术敲除猪基因组中的内源逆转录病毒（PERV）序列，并克隆出多只PERV失活小猪。向最终实现使用猪器官进行人体器官移植的终极目标迈进了一大步。

2017年9月，杂交水稻之父”袁隆平院士宣布使用CRISPR/Cas9技术敲除与镉吸收和积累相关基因的水稻育种成功。该研究从根本上解决了水稻镉污染的问题，将扭转我国部分农作物重金属超标的问题，进而改善部分人群重金属慢性中毒的问题。

2017年10月4日，张锋在 Nature 发表论文证实CRISPR/Cas13a能够在哺乳动物细胞中编辑特定的RNA。CRISPR/Cas13a能够达到RNAi相似的降低基因表达的效率，而且有更强的特异性，且对细胞内天然的转录后调控网络的影响更小。

2017年10月19日，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，设计了高精确性的Cas9变体—HypaCas9。该研究极大地降低了Cas9的脱靶效应，且不降低靶向切割效率。

2017年10月25日，张锋在 Science 发表文章介绍CRISPR新系统--REPAIR，可以高效的进行RNA的单碱基修复。因为不改变DNA序列，所以为通过基因编辑治疗遗传病而又不永久影响基因组提供了新可能。

2017年10月25日，哈佛大学Broad研究所的David Liu实验室在 Nature 发表长文，报道了新型腺嘌呤基因编辑器——ecTadA-dCas9，可以将A·T碱基对转换成G·C碱基对，该技术首次实现了不依赖DNA断裂即可进行基因编辑的技术，即单碱基基因编辑技术。该技术高于其它基因组编辑方法的效率，且几乎没有随机插入、删除或其它突变等不良副作用，因此为今后大范围治疗点突变遗传疾病提供了极大的便利。

五****、展望

近几年CRISPR/Cas基因编辑技术飞速发展，推广应用到了生物、医学、农业以及环境等多个领域，造就了一批批科研奇迹，尤其是在遗传病的治疗、疾病相关基因的筛查与检测、肿瘤治疗以及动植物的改造、病原微生物防治等领域有着巨大的潜力，也将深远地影响整个世界。

特别感谢：BioArt主编给予的帮助和意见以及吉满生物吴晨提供图1-图5的图片。

|

| |

扒一扒基因编辑技术的“真面目”

自2016年5月2日韩春雨作为通讯作者的“基因编辑技术NgAgo”论文发表引起关注、5月底质疑的声音开始出现，韩春雨实验的可重复争议，不仅科学界议论纷纷，在社会层面也引发了相关讨论。那么，基因编辑技术到底是一项怎么样的技术呢？为什么它这样备受瞩目？今天我们就一起去扒一扒基因编辑技术的“真面目”！

基因编辑技术到底是个什么鬼？

首先我们先介绍一下基因编辑的概念。实际上，“基因编辑”这四个字是比较简化的，严格来说我们应该称它为“基因组定点编辑技术”。这里我们要注意两个关键词，一个是“基因组”，它要在细胞核的基因组里面。

另一个是“定点编辑”，因为在细胞核的基因组里面，不同的基因都有不同的位点。如果我们不是说在特定的基因组位点进行编辑的话，实际上和我们现在讨论的这个技术就大相径庭了。因为有很多其他技术可以改变细胞内的DNA组成。比如线粒体基因替代技术。还有一个就是用重组过的特异性病毒引入外源基因，但是它不能够定点，它是随机放到基因组里面的，这和我们今天要讨论的基因编辑技术都是不一样的。基因编辑技术，也就是“基因组定点编辑技术”，这个技术指的是对特定DNA片段的敲除、加入以及定点突变。

基因编辑技术的历史

实际上，基因编辑技术不是一个新的概念，早在90年代就开始有了。到目前为止，已经经历了三代。

第一代基因编辑技术就是同源重组建立动物基因敲除（knock-out），基因敲入（knock-in）的基因突变模型。顾名思义，基因敲除（knock-out）指的是把原有的动物基因组的某些基因通过一定的技术把它从动物基因组里敲除出去；基因敲入（knock-in）则是在动物基因组某个位点上把原本不存在的基因通过一定的技术把它整合进去。基因敲除（knock-out）和基因敲入（knock-in）是通过DNA同源重组技术来完成的。这是一个非常复杂的技术。如果要做成一个成功的动物基因敲除（knock-out），基因敲入（knock-in）的基因突变模型，大概需要花费2到3年的时间，投入的资金也比较多。另外，这个技术一般来说是用于建立遗传疾病研究的动物模型，很难用于临床或者说大面积应用在农业畜牧业方面。

第二代基因编辑技术是ZFN,TALEN技术。这两个技术的原理都是通过DNA核酸结合蛋白和核酸内切酶结合在一起建立一个系统。因为这些蛋白可以识别一定的核苷酸序列，通过一定设计形成的系统可以对特定的基因进行基因敲除和基因突变。

第三代基因编辑技术就是最近非常火的CRISPR/Cas9 系统。它的原理就是利用核糖体结构来进行基因编辑。CRISPR/Cas9 系统经过一定的设计可以结合到靶基因上，然后对这个靶基因进行敲除、定点突变或者引入新的外源基因，来进行基因编辑。

为什么第三代基因编辑技术备受瞩目？

确切地说，这三代基因编辑技术到目前为止都存在一定的技术局限性。第一个比较明显的局限性就是脱靶效应。那什么是脱靶效应呢？比如原本设计是对某一个DNA靶点进行基因编辑，但是一直找一直找，却没有找到正确的靶点，实际上却跑到这个点组成相似的位点去了，这就出现了脱靶。

第二个我们关注的问题就是编辑效率。任何技术都有一定的编辑效率。第三代基因编辑技术的效率要比第二代基因编辑技术高，这也是我们为什么对这三代基因编辑技术这么感兴趣的原因。

还有一个问题就是基因编辑技术对同一基因可能会造成不同的基因突变类型。不同的基因突变类型混合在一起，会让检测工作变得复杂很多。在这点上，第三代基因编辑技术同样表现不俗，要比这二代基因编辑技术好很多。

总的来说，为什么第三代基因编辑技术这么受大家的关注？主要得益于它以下几个优点：一是它的设计比较简单；二是它的效率比较高；三是它的价格相对便宜些；四是它的应用范围更广泛些，能针对的靶基因是比较多的。

基因编辑技术有什么用?

我们研究基因编辑技术，那基因编辑技术到底可以应用在哪些方面呢？主要有以下这几个方面：第一个就是可以形成不同基因型的动物模型，这从第一代基因编辑技术就开始做了。建立不同基因型的动物模型的意义在于，对遗传性疾病，这些基因和疾病之间的关系，这些模型可以给出一个比较确切的答案。这对研究遗传性疾病具有重大意义，这也是为什么大家从第一代开始就密切关注基因编辑技术的发展了。

第二个主要是应用在动植物育种。不同的物种的同一个基因上，可能会存在不同的SNP。不同的SNP对正常的生理功能影响是不大的，但是却会影响一定的表型。比如水稻是不是就会更高产一些，动物的瘦肉是不是更多一些等等表型。有了基因编辑技术，在育种的过程中，我们就可以对我们最想要的某一个基因进行单点突出，以实现效益的最大化。目前为止，第三代基因编辑技术效率相比于前两代技术来说是最高的。

还有一个就是对遗传疾病的治疗比较有用。目前来说，基因编辑技术主要是用在人源性的细胞上面，临床还没有用到。我们知道，很多遗传疾病都和细胞的突变有关。如果说利用基因编辑技术，我们能够把致病的基因转换成正常的基因的话，那么对家族有遗传病史的人来说，这将是一个福音。

但是现在的基因编辑技术离临床治疗还远。要应用到临床上需要考虑很多问题，比如这个系统的毒性怎么样？它进去以后会不会引起什么免疫反应？因为现在基因编辑技术还存在脱靶效应，如何对我们要编辑的基因进行准确地定位是个大问题。这些都是需要研究清楚才能上临床的。

（作者：胡昕华，中国科学院神经科学研究所博士。感谢中国科学技术大学化学博士，中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家实验室副研究员，科技与战略风云学会会长袁岚峰的推荐，原创作品，转载请注明出自知识就是力量微信公众号）

（图片来自网络）

编辑：刘伟琼

本文系原创作品，商业合作及转载请联系 投稿请联系 ?

NEPA21-让Crispr-Cas9基因编辑技术与类器官培养研究如虎添翼的利器

类器官

类器官（Organoids），是指利用成体干细胞（ESCs）或诱导式多能干细胞（iPSCs）进行体外三维（3D）培育的具有一定空间结构的组织类似物。类器官能高度模拟体内组织结构及功能并能够长期稳定传代培养。类器官模型是介于细胞系和动物模型之间的一种新型功能化体外模型，可用于解析遗传发育、建立疾病模型、筛选药物和检测毒性以及探索个性化医疗方案。迄今为止世界各国科学家陆续培养出脑、肝、胃、肺、肠、肾脏和胰腺等各种类器官。

2013年，类器官技术被《Science》评为十大科技突破之一，2017年，又被《Nature Methods》评为生命科学领域的年度技术（Method of the Year 2017）。

荷兰科学家Hans Clevers教授是类器官研究领域国际公认的先驱和鼻祖，早在2009年，Hans Clevers就发现Lgr5蛋白是肠道干细胞的标志物，并成功建立了首个肠道干细胞体外3D类器官培养体系，开创了类器官作为疾病模型的研究时代。

目前，类器官在生命科学研究中应用广泛，通过改变不同类器官的基因可以极大地帮助研究生物学过程和疾病建模。然而，由于缺乏简单的基因组工程方法，基因组编辑人类类器官的构建比较困难。

CRISPR/Cas9是进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行定点的精确编辑。在向导RNA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组DNA可被看作病毒或外源DNA，得到精确编辑。

在2020年3月份，HansClevers研究团队在《Nature Cell Biology》杂志上发表学术论文《Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR–Cas9 precision genome editing》。

其利用非同源依赖的CRISPR-Cas9技术，可快速高效地对人源类器官进行基因敲入，他们将该技术命名为CRISPR–HOT(CRISPR-Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis)，为人源类器官的内源基因敲入提供了重要的工具平台。

研究人员利用这种新方法分析了肝细胞如何分裂以及DNA过多异常肝细胞是如何出现的，并发现敲除癌症基因TP53，异常肝细胞的非结构化分裂会更频繁。以上发现或有助于深入研究相关癌症的发展过程。

研究者们为了印证CRISPR–HOT技术在人源类器官中进行基因敲入的方法可行，首先在两种难以转染的人源类器官（肝脏导管类器官及肝细胞类器官）进行测试，并对两种不同介导方式的基因敲入技术产生的类器官进行对比分析。

图示： HDR与NHEJ的技术路线以及优劣比较

结果发现，虽然抑制TP53的活性之后，HDR介导的基因敲入方式的效率略有提高，但仍然比NHEJ介导的基因编辑效率要低。Hans Clevers研究组的工作用CRISPR-HOT方法，建立了不依赖于对TP53活性抑制的以NHEJ介导的基因编辑技术，简化了基因敲入的流程，对于肝细胞等成体干细胞来源的类器官可视化研究提供了可靠的基因编辑方式。

2020年11月，Hans Clevers研究团队又在《Nature Protocols》杂志发表学术论文《Establishment of human fetal hepatocyte organoids and CRISPR–Cas9-based gene knockin and knockout in organoid cultures from human liver》，阐述利用CRISPR/Cas9基因编辑技术探究人类胎儿肝细胞作为类器官长期扩增的培养条件。

在文章中，作者提出：针对人类胎儿肝细胞和人类肝导管类器官的基因组编辑需要两种不同的实验程序。对于人类胎儿肝细胞类器官，采用基于电转杯电转染的转染策略。为此，类器官必须分解成单细胞或小块细胞，建议从第5代及以后开始对肝细胞类器官进行基因组工程设计，肝细胞类器官电穿孔的能力通常不会随时间而降低，作者已经成功地对人胎儿肝细胞类器官进行了基因组工程，可以做到至少第50代为止。

图示：人类胎儿肝细胞类器官的基因组 工程技术概略图

(采用电转杯电转染)

相反，对于人肝导管类器官，转染步骤是对完整的类器官进行的，是一种离体组织电转染的方式。

图示：人类肝脏导管类器官的基因组工程技术概略图

(采用离体组织电转染)

另外针对不同的基因编辑方式（Knock in和Knock out），作者也分享了非常详细的应对策略（见下图）。

俗话说，工欲善其事，必先利其器。那么在Hans Clevers研究团队深耕的类器官领域中，属于他们的一把利器是什么呢？我们发现，在大牛们的研究过程当中，对细胞的转染操作贯穿其中。而NEPA GENE的 NEPA21基因高效转染系统 正是他们所选用的高效电转仪。

NEPA21 基本介绍

【1】采用全新设计的电转程序，电压衰减（Voltage Decay）模式；基因导入+反向导入模式。

【2】不需要特殊转染试剂辅助，节省实验成本；电转程序中的各项参数实时可见、可调，特别适用于优化原代细胞、非常见细胞的电转参数。

NEPA21高效基因转染系统独有的电压衰减（Voltage Decay）设计，可在获得高转染效率的同时，提高细胞存活率。专门针对难转染的原代免疫细胞、干细胞、神经细胞、活体动物、受精卵以及宫内胚胎等转染。

得益于NEPA21良好的应用体验，Hans Clevers利用其已在类器官领域取得了丰硕的研究成果。目前已有多篇应用文献，是Crispr/Cas9基因编辑的第一品牌电转系统。NEPE21——让细胞转染更简单、更Free。