分子生物学技术的应用论文

分子生物学技术的应用论文

分子生物学技术在国内防制虫媒传染病领域的应用
【摘要】　本文综述了国内近年来,分子生物学技术在虫媒病中蚊媒传染病防制的应用情况,以期为蚊媒传
染病的防制、应对突发公共卫生事件中蚊媒传染病的发生提供参考.
【关键词】　分子生物学技术;虫媒;传染病
虫媒病是由节肢动物携带病原体传播的一组疾病.
1992年在国际虫媒病毒中心登记的已达535种,其中128
种对人有致病性[1].我国法定报告的传染病中,虫媒病占
13种,蚊虫作为媒介,除了传播病毒性疾病外,还可传播
寄生虫病.这类疾病大都属于自然疫源性疾病,有一定的
地域性和时间性,发病率低、死亡率高,主要通过媒介的
控制进行防制[2].近年来,随着分子生物学技术的研究和
发展,在医学领域的应用日趋广泛,并取得了重大进展,
作者就近年来分子生物学技术在蚊媒传染病的诊断和防制
等方面的应用综述如下.
1　常用的分子生物学技术[3]
1·1　核酸分子杂交技术
核酸的分子杂交(molecular hybridization)它是利用核
酸分子的碱基互补原则,在特定的条件下,双链解开成两
条单链,与异源的DNA或RNA (单链)复性,若异源
DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列,则在复
性时可形成杂交的核酸分子.杂交的双方是待测核酸序列
及探针.核酸探针可用放射性核素、生物素或其它活性物
质标记.根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探
针、寡核苷酸探针、RNA探针等.
分类:根据被测定的对象,分为Southern杂交和
Northern杂交;根据所用的方法,分为斑点(dot)杂交、
狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交;根据环境条件:分为液
相杂交和固相杂交.
1·2　聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)
是以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板互
补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照
半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合
成.通过不断重复这一过程,可以使目的DNA片段得到扩
增,同时新合成的DNA片段也可以作为模板,使DNA的
合成量呈指数型增长.
PCR各种应用模式:兼并引物( degenerate primer)
pcr、套式引物(nested primer) pcr、复合pcr (multiplex
pcr)、反向pcr ( inverse pcr或reverse pcr)、不对称pcr
(asymmetric pcr)、标记pcr ( lp-pcr)和彩色pcr、加端
pcr、锚定pcr或固定pcr、玻片pcr、反转录pcr方法检测
rna、定量pcr.
1·3　DNA芯片
基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列
(DNA microarray).是采用光导原位合成或显微印刷等方
法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相
应处理的载体上,然后加入标记的待测样品,进行多元杂
交,通过杂交信号的强弱及分布,来分析目的分子的有无、
数量及序列,从而获得受检样品的遗传信.特点:具有通
量大,并行性、微量化与自动化等优点,但在实践中其研
究成本较高;方法标准化不足;配套软件不够完善.
2　分子生物学技术在虫媒病诊断的应用
2·1　疟疾
黄炳成等[4]用pBF2 DNA片断,经标记后作探针,从
多种疟原虫DNA样本中检出恶性疟原虫.基因芯片在疟原
虫的研究内容还有疟原虫新基因发现[5]、转录因子调控网
络[6]、疟原虫适应人体宿主机制[7]、疟原虫比较基因组杂
交分析[8]、恶性疟原虫抗原变异分子机制[9]以及疟原虫攻
击红细胞机制[10]等.
2·2　丝虫病
黄志彪等[11]运用PCR技术检测血液中的班氏丝虫微
丝蚴,可检出lOOul阳性血样中的l条班氏丝虫微丝蚴;用
于检测班氏丝虫监测点540份血液样本结果均为阴性,镜
检血片结果亦为阴性.常规丝虫检测是在夜间采血,有资
料显示[12], SsP/PCR扩增系统可用于检测班氏丝虫病患
者血样中的循环DNA,能用于周期性或夜间周期性丝虫病
的日间血检工作,从根本上改变了丝虫病的诊断、监测和
工作方式.
2·3　登革热病
郑夔等[13]应用多重PCR技术快速鉴定4种血清型登
革病毒,并在同一反应管中进行多重PCR对登革病毒进行
分型鉴定,证实了2004年在广东发生的登革热疫情为I型
登革病毒;也有报道应用寡核苷酸芯片技术能同时确认流
感和登革热病毒[14].长期受这种疾病困扰的地区将有望通
过这种技术的完善,获得有效的治疗和保护.

分子生物学技术在动物营养学上的应用及其发展前景的论文

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分子生物学技术在动物营养学上
的应用及其发展前景(上)
摘要：本文从营养与基因表达调控、基因工
程、转基因等三个方面综述了分子生物学技术在
动物营养学中应用的最新进展，并对动物营养学
的发展前景作了展望。
自从发现双螺旋结构以来，分子生物学取得了飞跃性的发展，
形成了以基因工程为主要内容的的现代分子生物
学技术@在生物学、医学等研究中得到广泛的应用，
几乎渗透到生命科学的每一个领域，成为研究和
揭示生命现象本质和规律的一种重要工具。当前，
世界各国都将分子生物学纳入本国科技发展的重
点，可以预见，"21世纪将是生命科学的世纪，全世
界所共同面临的许多重大问题，诸如饥饿与营养、
疾病、能源与环境污染等问题的根本解决，在很大
程度上将依赖于分子生物学技术的发展和应用。
及时全面的了解和掌握分子生物学理论和技术的
发展动态及研究热点，将具有重要的意义。
就目前来看，我国动物营养学方面的研究工
作基本尚处在机体水平：即在机体水平上研究各
种营养素对机体的作用、在机体内的代谢与平衡、
影响机体吸收营养素的因素等问题。分子水平方
面的研究还刚刚起步，尚处于初级阶段。动物机体
的生理病理变化，如生长发育、新陈代谢、遗传变
异、免疫与疾病等，就本质而言，都是动物基因的
表达调控发生了改变的结果，许多生理现象的彻
底阐明，最终需要在基因水平上进行解释，所以动
物营养学的各方面研究应与分子生物学技术，尤
其是基因工程技术相结合，从分子水平上来解释
各种营养素对机体的作用机制、动物机体的生理
病理变化等问题，这也是动物营养学今后发展的
必然趋势之一。
*营养与基因的表达调控
随着分子生物学技术不断发展，越来越多与
代谢有关的动物基因被克隆和鉴定，人们对营养
与基因调控的关系越来越感兴趣。营养与动物基
因表达调控的研究已成为当今动物营养学研究的
一个热点领域；如何通过改变日粮组成成分来调
节体内相关基因的表达，从而使动物体处于最佳
生长状况已成为现代动物营养学研究的重点；通
过营养对动物基因表达的调控途径及其机制的研
究，将为人们如何更加有效地对某些特定有益基
因的表达提供理论依据。已有大量证据表明，主要
的营养物质如糖、脂肪酸、氨基酸以及一些微量元
素（如锌）对动物体内许多基因的表达都有影响。
!"!营养对磷酸烯醇式丙酮酸激酶
基因表达的调控
PEPCK是动物肝和肾中糖元异生作用的关
键酶，目前较为研究清楚的是日粮中糖含量对
PEPCK基因表达的调控。
糖类对PEPCK的调控主要是通过对其启动
子的作用，当动物进食含有大量糖类的饲料时，
PEPCK的启动了就会关闭，从而导致ABA8C水平
大幅度下降，而当禁食或饲喂高蛋白质低糖的饲
料时，PEPCK的启动子就会处于打开状态，从而
PEPCK水平得到大幅度提高，其具体调控机制大
致如下：?556D4（*0)#）等通过对大鼠ABA8C基因
的分析表明，ABA8C基因启动子位于1 E+.至F
#,之间，其中包含了大多数激素调控基因转录所
必需的组织特异性调控元件。日粮中糖的含量水
平会影响胰岛素、;?GA等激素的相对水平，而胰
岛素与;?GA等激素相对水平又会影响到特异性!"#!
转录因子的活性，特异性转录因子与$%$&’启动
子上的相应调控元件结合与否，又会影响$%$&’
基因的表达(，)。现有大量证据表明，$%$&’基因
一系列复杂的调控元件中，有包括胰岛素、甲状腺
激素、糖皮质激素、视黄酸对$%$&’基因转录的
正调控元件和胰岛素对$%$&’基因转录的负控
调元件，在上述调控元件中，*+,$调控元件-&.
%/和$(-0/调控元件是最重要的两种，*+,$对
$%$&’基因的诱导和胰岛素对$%$&’基因的抑
制作用就是通过这两个调控元件来进行调控的。
因此，当进食含大量糖类的饲料时，由于*+,$水
平的急剧下降以及胰岛素水平的急剧上升，从而
抑制$%$&’基因的表达，导致肝中$%$&’水平
大幅度下降，当禁食或饲喂高蛋白低糖的饲料时，
则情况恰好相反。
!"#营养对脂肪酸合成酶（$%&）基因表达的
调控
1+2是脂肪酸合成的主要限制酶，存在于脂
肪、肝脏及肺等组织中，在动物体内起催化丙二酰
&3+连续缩合成长链脂肪酸的反应，其活性高低
将直接控制着体内脂肪合成的强弱，从而影响整
个机体中脂肪的含量。有关营养与1+2基因的表
达调控，2!4!&56789-:;;(/曾报道：糖类能诱导1
+2基因的转录，而脂肪则抑制这种诱导的表达。
&3<=9等（:;;>）试验研究也表明，当给禁食后的
成年鼠饲喂含高糖低脂肪的饲料时，1+2基因的
表达就增强，而且相应的?.@+含量的增加幅度
与碳水化合物的摄入量也成正比。
糖类对1+2基因表达的影响。为区分活体中
激素水平变化的协同作用，13<A9559-:;;B/通过体
外细胞培养的方法研究葡萄糖和胰岛素等激素的
作用效果。研究表明，加入葡萄糖和胰岛素的脂肪
细胞培养组织中，1+2的?$@+水平相对于对照
组提高"#C；单独添加葡萄糖相对于对照组则提
高了DC，而单独添加胰岛素则没有效果。因此我
们可以得出结论，葡萄糖对1+2基因的表达调控
可以通过与胰岛素的协同作用而得到显著提高。
另外，有关研究表明，(E F E甲基葡萄糖（一种葡
萄糖类似物，不能被已糖激酶磷酸化）不能激发1
+2基因的表达，这表明葡萄糖必须通过中间代谢
环节才能对1+2基因的表达调控起作用，因此对
于弄清楚是由葡萄糖哪个代谢产物来作为启动基
因的表达信号尤为重要。13<A9559-:;;"/认为，G E
磷酸E"E脱氧葡萄糖在脂肪组织中有类似葡萄
糖的作用，能激发1+2基因的表达，且:?,的作
用效果等同于">?,葡萄糖的作用效果。最近
H3I73J等-:;;G/试验研究也表明，在成年大鼠肝
细胞培养物中G E磷酸E"E脱氧葡萄糖水平与
1+2的?.@+含量呈正相关。因此G E磷酸E"E
脱氧葡萄糖极有可能是参与1+2基因表达的重
要中间代谢物。
脂肪对1+2基因表达的影响。&56789-:;;(/
的研究表明，脂肪抑制1+2基因表达主要与脂肪
抑制1+2基因转录的能力和脂肪中脂肪酸的碳
链长度、双键位置和双键的数量有关，饱和脂肪酸
和（J E;）族脂肪酸不能抑制1+2基因的表达，多
不饱和脂肪酸（$K1+）中的-J E G/和-J E(/族脂
肪酸是1+2基因的有效抑制剂，研究表明，日粮中
$K1+可使1+2?.@+的水平降低D>C E;>C。
蛋白质对1+2基因表达的影响。,I5LJ97
-:;;:/研究表明，高蛋白饲粮将抑制猪脂肪组织
中1+2基因的表达，脂肪组织中1+2基因的?.M
@+的含量会显著下降：用蛋白质含量分别为:)C、
:#C、")C的日粮饲喂G>E::>8N的肥育猪，其脂
肪组织中1+2?.@+的含量分别下降了#!:)C、
::!D(C和)#!"C。由此可见日粮蛋白质将会影响
脂肪组织中1+2基因的表达，但这种调控具体发
生在哪个水平及其作用机理目前还不清楚。
!"’营养对()*+,*基因表达的影响
长期以来，我国商品猪的瘦肉率较国际优良
品种低，而目前常规的育种方法已很难使之有大
幅度的提高。因此OP6JN等（:;;)）小鼠3Q基因的
克隆成功为这方面的研究提供了新的思路。由于
R9=SIJ基因具有可以大大降低动物体脂含量这一
特性，因此通过营养对R9=SIJ基因表达调控的研
究，将有助于深入了解R9=SIJ对动物体重的调控
机制。王方年等（:;;;）研究表明，浓度从B??35 T
R到:>??35 T R葡萄糖可以显著地促进脂肪细胞
中59=SIJ基因的表达。
!"-营养与神经肽.（/0.）基因表达的影响
@$U是一种含(G个氨基酸残基的生物活性
多肽，在体内具有收缩血管、影响激素分泌、调节
生物节律及摄食行为等多种生物学功能，其中促进动
物采食是@$U最主要的功能之一。试验研究表
广东饲料第;卷第G期">>>年:"月综述广东饲料第#卷第$期"%%%年&"月综述
明，限饲特别是限制能量采食将会显著提高’()
在下丘脑中的表达量，*+,-.等（#/）在限饲、低
碳水化合物、低脂肪、低蛋白质日粮组成的试验条
件下，发现下丘脑中’()0 1’2显著提高345。
!"#微量元素对基因表达的调控
&!4!&锌对基因表达的调控
锌作为动物体的一种必需微量元素，具有增
强机体免疫功能、促进细胞增值分化、参与核酸蛋
白质代谢、维持细胞周期正常进行等生物学功
能。上述作用以前曾被认为主要是由于含锌酶活
性的改变以及对细胞信号传导系统产生影响的结
果，但近年来的研究表明，事实并不如此，锌主要
是通过对基因的转录和表达的影响而产生一系列
的生物学效应。6,7+.89.:;#<=认为，锌离子是
>’2聚合酶的一个重要组成成分，锌对于维持>
’2聚合酶的活性具有相当的重要性；另外锌通过
影响1’2聚合酶活性及转录因子的作用，能够导
致基因转录异常，从而使蛋白质表达也发生变化；
还有饲料中锌的含量，可以通过影响金属调节蛋
白的转录活性而影响金属硫蛋白（6?）基因的表
达，@A88,BC:等（#3）认为可将6?基因的表达量
作为体内锌状况的重要衡量指标。67’C88;#4=
发现低锌日粮限制动物生长的直接原因是由于低
锌抑制了体内DEF G D、EH受体、EH结合蛋白等
基因的表达。
&!4!"其他微量元素对基因表达的调控
镉、铜、汞等元素的增加将显著提高6?基因
的表达量。I+JA;#/=研究表明高铜将显著提高
体内EH基因的表达水平。IC+K,:L.K等（M$）认
为铁可以通过控制01’2的稳定性和翻译过程，
调节铁蛋白的水平。
"基因工程技术
所谓基因工程，就是按照人们的意愿在体外
获得目的基因，再按预先的设计，在体外将目的基
因进行酶切连接，构建成适当的表达裁体，然后导
入细菌或动物细胞或机体内，以研究该目的基因
的结构与功能、表达的调控机制、或者获得该基因
的表达产物。分子生物学技术的核心就是基因工
程，而基因克隆和表达是基因工程的核心技术。下
面就抗菌肽、植酸酶，甜菜碱等，对基因工程技术
在动物营养学领域中的应用作一简单阐述。
$"!抗菌肽基因工程
自从NJ0C:等（M&）首次从美国惜古比天
蚕;HOC8JP+JKC 7.7KJP,:=中成功地分离到两种抗
菌肽蚕素（7.7KJP,:）2和N后，国内外很多科学家
对这一类抗菌肽进行了深入细致的研究，发现在
许多昆虫、植物、哺乳动物中均有这样的多肽存
在，它们由<%多个氨基酸残基组成，不同来源的
多肽的氨基酸序列具有较强的保守性且共同具有
如下特点：（&）’端由碱性氨基酸残基组成；（"）Q
端均酰胺化；（<）绝大多数多肽在第二位均为?KP，
它对杀菌活性至关重要；（/）它们都有较广的杀菌
谱。其抗菌机制大致如下：抗菌肽作用于细菌的细
胞膜，破坏膜的完整性，造成离子通道，最终导致
细胞内含物的泄漏。由于抗菌肽具有广谱杀菌作
用、相对分子量较小、热稳定、水溶性好等优点，更
为重要的是抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，仅
仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，在目
前不少病原菌对原有抗生素逐步产生耐药性，尤
其是肉用动物长期使用抗生素受到严格检查和批
评时，对畜禽体内自然产生的抗菌肽功能的了解
以及设计一种方法来调节动物体内自然抗菌肽的
功能便显得极为重要，其中通过抗菌肽基因的克
隆与表达而大量生产抗菌肽是一种较为直接而有
效的方法。目前昆虫和植物抗菌肽基因工程，在国
内外已有不少成功的报道，但就畜禽抗菌肽基因工
程国内外尚未见报道。因此，运用基因工程技术，通
过对畜禽抗菌肽的研究，对提高畜禽的抗病能力、减
少甚至替代抗生素的使用将起积极的促进作用。
目前，猪抗菌肽（(1 G<#）已被发现（8..等，
M#），它是一个分子量为/3道尔顿的肽，从猪
肠中分离，属于富含(KJ G 2KL的肽家族，不裂解野
生型大肠杆菌，但对突变型R&"有作用，其作用机
制是通过阻断蛋白质和>’2的合成，从而导致这
些成分的降解。(1 G<#在一个单层囊泡中可以诱
导钙的降低和电流的线性增加，此诱导与肽浓度
和膜上甘油磷酸脂（带负电荷）有关。另外在猪小
肠中，还发现另一种抗菌肽7.7KJP,:(&，它是以裂
解细菌来完成杀菌作用的。2:S.K99J:;#4=运用
基因工程技术从猪骨髓1’2中克隆到一种新型
的7>’2，其编码一个3M残基的抗菌肽’R G 8O9,
:，有三个分子内二硫键，这种肽对’R G敏感型的
肿瘤细胞株)2Q G&有裂解活性，但不裂解红血
球细胞。;
!"#!
分子生物学技术在动物营养学上
的应用及其发展前景$下%
郑家茂赵国芬许梓荣
!"!植酸酶的基因工程
植酸酶的研究已有近.’年的历史，植酸酶作
为一种单胃动物的饲料添加剂，其饲喂效果已在
世界范围内得到广泛的确证，随着饲料工业的发
展和分子生物学的兴起，从(’年代开始的植酸酶
的分子生物学研究，已成为世界性的研究热点之
一。目前国内外研究的主要思路集中在通过基因
工程这一手段解决饲用植酸酶的两个主要问题：
一个是植酸酶在天然材料中表达水平太低，这造
成植酸酶难以大量生产及生产成本过高的问题，
通过基因工程技术，利用生物反应器则有望成百
上千倍地提高它的表达量；另一个问题是天然植
酸酶的一些酶学性质，如耐温性，/0适性、催化活
性等不能完全适合饲料加工业和养殖业的要求，
利用基因工程手段在分子水平上对植酸酶基因进
行改造，从而提高其在饲料中使用的有效性。
#!#!&在微生物中高效表达植酸酶基因
目前，植酸酶基因表达的研究主要集中在来
源于曲霉的植酸酶基因/123和/425上。06789
:;<=>?4@8等$&(("%将来源于3!A:BCDDEFFG"&"-
的/123基因导回原菌株，使/12基因的拷贝数增
加到&-个以上，从而使植酸酶的表达量提高到
,H’’C I D4。J174:B1等（&((-）在3!K72L6?中表达来
源于酵母的植酸酶基因和来源于3!;:<?7,H#的
/125基因，其结果也是使表达量分别提高到M.’
C I D4和,-’C I D4，将植酸酶基因/123置于来源
于3!;:<?7的淀粉葡萄糖甘酶$3N%启动子之下，
信号肽序列分别用3N信号肽的&M个氨基酸序
列、3N信号肽的#.个氨基酸序列及植酸酶原来
的信号肽序列"种构建，将植酸酶基因重组到3
;:<?7基因组中而获得植酸酶基因的阳性克隆子
在这"种构建中其植酸酶在重组菌株中的表达量
分别达到了&!&O’!-O#!M P&’-C I D4，比原植酸酶
产生菌株的表达量高约&’’’Q"’’’倍左右。
#!#!#植酸酶热稳定性
加工饲料都需要一个制粒工艺，在制粒过程
中有一个短暂的高温过程，温度一般在,-
("R，一般植酸酶在此高温下会大幅度地丧失活
性，因此，能在饲料中真正推广利用的植酸酶必须
具有良好的热稳定性；然而另一方面饲料中的植
酸酶最终的作用场所却是动物正常体温（",R）的
肠胃中，植酸酶同时又必须在常温下具有较高活
性，因此，如何解决在制粒高温和在动物正常体温
下同时具有较高酶活性这一对矛盾是目前饲用植
酸酶应用的关键性技术环节，通过基因工程技术
对植酸酶基因在分子水平上进行改造将是一个强
有力的手段。近年来，已从嗜温微生物中发现多种
高温植酸酶，对它们的结构与热稳定性的研究将
为植酸酶基因的分子改造提供理论依据。
#!#!"植酸酶基因工程的一个新突破点
假设在一些植物性饲料$如玉米、大麦、大豆
等%中本身就含有足量的植酸酶，如果在饲喂过程
中，植酸酶在动物的肠胃中释放出来降解饲料中
的植酸磷，这岂不是一举两得，即省去了植酸酶添
加剂的生产，又省去了在饲料中植酸酶的添加，这
无疑是植酸酶应用的最佳方法。随着分子生物学
技术的发展，这一“天方夜谭”的假设将成为现
实。目前，科学家们已经开始尝试这一方面的研究
并取得了阶段性的进展，其主要思维路线如下：将
植酸酶基因通过基因工程技术转化到用作饲料的
玉米、大豆、大麦中，培养出高含植酸酶的大豆、玉
米、大麦。目前国外许多研究机构都在尝试此项工
)中图分类号*SM&H!")文献标识码*5)文章编号*&’’-!MH&"$#’’&%’&!’’"#!’#作，预计近期内会取得突破性进展。
#!"甜菜碱基因工程
甜菜碱$%&’()*&+是广泛存在于动植物体内的
季铵型生物碱。近年的研究表明，甜菜碱是一种高
效、安全的营养再分配剂，添加于饲料中，可以显
著提高畜、禽胴体瘦肉率、减少脂肪沉积，并可改
善肉质，在养殖工业上应用前景广阔。但就甜菜碱
本身而言，目前国内的甜菜碱生产均是通过化工
工艺合成，通过基因工程手段来获得甜菜碱方面
还是空白，国外近年来已开始这方面的研究。
许多细菌和植物中由胆碱经两步氧化而成甜
菜碱，合成代谢途径已经阐明，催化两步反应的酶
蛋白已经分离和纯化，已克隆其基因并测定了碱
基顺序。,-.’/01研究室已完成大肠杆菌的%&’
操纵元全序列分析，发现%&’操纵元由四个基因
组成，其中%&’,编码胆碱脱氢酶（23 4 567(），
%&’%编码甜菜碱醛脱氢酯（8#4 567(），%&’9编
码胆碱转移系统（:8 4;67(），%&’<编码%&’基因
的调节中作为阻遏物的#3!;67(蛋白。
目前已有一些报道认为细菌9&’操纵元和
=&>操纵元能在烟草中表达，因此将.’/01研究室
得到的%&’操纵元;!:?@7A,片段导入烟草，探
讨甜菜碱是否能表达是一个诱人的研究领域。
"转基因技术
转基因技术是指用实验手段，将外源基因导
入动物细胞或动物受精卵中，由此稳定整合到动
物基因组，并能遗传给子代。目前常用的转基因技
术主要有：显微注射法；胚胎多能干细胞虫；精子
裁体法；反转录病毒载体法以及电转移技术等等，
其中显微注射法是最常用、最有效的基因导入技
术。目前培育成功的转基因动物绝大部分是采用
该方法获得的。最早的转基因动物是将疱疹病毒
基因与BCDE早期启动子联在一起，用显微注射
法导入小鼠受精卵获得的转基因小鼠。目前，在动
物营养领域转基因技术的研究主要包括：
"!3提高动物生长性能
生长激素$FG+在动物生产中基本上采用注
射方法，虽然有一定的促生长作用，但程序复杂繁
琐，解决思路之一就是采用转基因技术。G(11&/
等$35;8+人生长激素$HFG+转基猪研究成功，这
种转基因猪的生长速度比对照组高出38I，日增
重可达3#:"J，饲料利用率提高#3I，采食量减少
#EI，陈永福$3553+用自己构建的融合基因
KL9 M NFG获得了转基猪，其生长速度提高
33!;I O 3D!#I，饲料利用率提高3EI。另外，转
基因羊、转基因鸡、转基因兔、转基因牛、转基因鱼
等研究也相继获得成功。
"!#改变动物体内的代谢途径
动物营养研究表明，有些生长发育和维持所
必需的营养物质必须由外界供给，例如赖氨酸，但
是否可以不必由外界供给呢？可行的方案不外乎
这么两种：一种是重建动物体内某些丢失的代谢
途径；另一种是导入目前在动物体内尚未发现的
代谢途径。转基因技术的出现提供了通过改变动
物代谢途径从而让动物自身合成赖氨酸的可能
性。-&&.等$355E+已经清楚大肠杆菌合成赖氨酸
途径中的酶基因编码，运用基因转移技术也证明
了在细胞中施行这些途径的可行性，因此-&&.等
提出设想：把赖氨酸在微生物中生物合成的途径
导入动物体内，使动物自身就能合成赖氨酸。
"!"提高动物产毛性能
由于胱氨酸在羊瘤胃中降解，所以饲料中加
入胱氨酸并不能提高产毛量。因此能够得到一种
自身合成胱氨酸的转基因羊，将会大大提高羊毛
产量。P(/Q$3553+发现某些细菌能将硫固定并转
化为胱氨酸，他们分别在大肠杆菌和沙门氏菌中
分离到了丝氨酸乙酸转移酶基因和K 4乙酰丝氨
硫化氢解酶基因，并且将这两种基因与金属硫蛋
白$L9+基因启动子联接；并在"R端装上FG基因
的序列，然后将这组调控序列通过转基因技术导
入羊体内而得到高产羊毛转基因绵羊。
D展望
综上所述，以基因工程为核心的分子生物学
技术应用于动物营养学研究领域，具有很大的潜
力，它不仅为动物营养学研究提供了一套全新的
技术和方法，而且可在基因水平上解决许多动物
机体生理病理变化、营养素的代谢调节机制以及
其与机体的相互关系等问题。我们可以设想，基因
工程抗菌肽完全可以减少甚至替代抗生素的使
用；随着转基因技术的日益完善，各种生长性能优
越的动物新品种将层出不穷；用转基因动物来大
量生产各种生理活性物质，也将成为现实。无可置
疑，#3世纪是高新技术畜牧业应用大发展的时
期，以基因工程为主导的分子生物学技术将会为
我国的畜牧业的发展开辟广阔前景。

分子生物学论文

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分子生物学(molecular biology)
在分子水平上研究生命现象的科学。研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结 构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程如光合作用、发育的分子机制、神经活动的机理、癌的发生等。
从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。自20世纪50年代以来，分子生物学是生物学的前沿与生长点，其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系 (中心是分子遗传学)和蛋白质-脂质体系（即生物膜）。
生物大分子，特别是蛋白质和核酸结构功能的研究，是分子生物学的基础。现代化学和物理学理论、技术和方法的应用推动了生物大分子结构功能的研究，从而出现了近30年来分子生物学的蓬勃发展。分子生物学和生物化学及生物物理学关系十分密切，它们之间的主要区别在于：①生物化学和生物物理学是用化学的和物理学的方法研究在分子水平，细胞水平，整体水平乃至群体水平等不同层次上的生物学问题。而分子生物学则着重在分子（包括多分子体系）水平上研究生命活动的普遍规律；②在分子水平上，分子生物学着重研究的是大分子，主要是蛋白质，核酸，脂质体系以及部分多糖及其复合体系。而一些小分子物质在生物体内的转化则属生物化学的范围；③分子生物学研究的主要目的是在分子水平上阐明整个生物界所共同具有的基本特征，即生命现象的本质；而研究某一特定生物体或某一种生物体内的某一特定器官的物理、化学现象或变化，则属于生物物理学或生物化学的范畴。
发展简史 结构分析和遗传物质的研究在分子生物学的发展中作出了重要的贡献。结构分析的中心内容是通过阐明生物分子的三维结构来解释细胞的生理功能。1912年英国 W.H.布喇格和W.L.布喇格建立了X射线晶体学，成功地测定了一些相当复杂的分子以及蛋白质的结构。以后布喇格的学生W.T.阿斯特伯里和J.D.贝尔纳又分别对毛发、肌肉等纤维蛋白以及胃蛋白酶、烟草花叶病毒等进行了初步的结构分析。他们的工作为后来生物大分子结晶学的形成和发展奠定了基础。50年代是分子生物学作为一门独立的分支学科脱颖而出并迅速发展的年代。首先是在蛋白质结构分析方面，1951年L.C.波林等提出了 α-螺旋结构，描述了蛋白质分子中肽链的一种构象。1955年F.桑格完成了胰岛素的氨基酸序列的测定。接着 J.C.肯德鲁和M.F.佩鲁茨在X射线分析中应用重原子同晶置换技术和计算机技术分别于1957和1959年阐明了鲸肌红蛋白和马血红蛋白的立体结构。1965年中国科学家合成了有生物活性的胰岛素，首先实现了蛋白质的人工合成。
另一方面，M.德尔布吕克小组从1938年起选择噬菌体为对象开始探索基因之谜。噬菌体感染寄主后半小时内就复制出几百个同样的子代噬菌体颗粒，因此是研究生物体自我复制的理想材料。1940年G.W.比德尔和E.L.塔特姆提出了“一个基因，一个酶”的假设，即基因的功能在于决定酶的结构，且一个基因仅决定一个酶的结构。但在当时基因的本质并不清楚。1944年O.T.埃弗里等研究细菌中的转化现象，证明了DNA是遗传物质。1953年J.D.沃森和F.H.C.克里克提出了DNA的双螺旋结构，开创了分子生物学的新纪元。在此基础上提出的中心法则，描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动。遗传密码的阐明则揭示了生物体内遗传信息的贮存方式。1961年F.雅各布和J.莫诺提出了操纵子的概念，解释了原核基因表达的调控。到20世纪60年代中期，关于DNA自我复制和转录生成RNA的一般性质已基本清楚，基因的奥秘也随之而开始解开了。
仅仅30年左右的时间，分子生物学经历了从大胆的科学假说，到经过大量的实验研究，从而建立了本学科的理论基础。进入70年代，由于重组DNA研究的突破，基因工程已经在实际应用中开花结果，根据人的意愿改造蛋白质结构的蛋白质工程也已经成为现实。
基本内容 蛋白质体系 蛋白质的结构单位是α-氨基酸。常见的氨基酸共20种。它们以不同的顺序排列可以为生命世界提供天文数字的各种各样的蛋白质。
蛋白质分子结构的组织形式可分为 4个主要的层次。一级结构，也叫化学结构，是分子中氨基酸的排列顺序。首尾相连的氨基酸通过氨基与羧基的缩合形成链状结构，称为肽链。肽链主链原子的局部空间排列为二级结构。二级结构在空间的各种盘绕和卷曲为三级结构。有些蛋白质分子是由相同的或不同的亚单位组装成的，亚单位间的相互关系叫四级结构。
蛋白质的特殊性质和生理功能与其分子的特定结构有着密切的关系，这是形形色色的蛋白质所以能表现出丰富多彩的生命活动的分子基础。研究蛋白质的结构与功能的关系是分子生物学研究的一个重要内容。
随着结构分析技术的发展，现在已有几千个蛋白质的化学结构和几百个蛋白质的立体结构得到了阐明。70年代末以来，采用测定互补DNA顺序反推蛋白质化学结构的方法，不仅提高了分析效率，而且使一些氨基酸序列分析条件不易得到满足的蛋白质化学结构分析得以实现。
发现和鉴定具有新功能的蛋白质，仍是蛋白质研究的内容。例如与基因调控和高级神经活动有关的蛋白质的研究现在很受重视。
蛋白质－核酸体系 生物体的遗传特征主要由核酸决定。绝大多数生物的基因都由 DNA构成。简单的病毒，如λ噬菌体的基因组是由 46000个核苷酸按一定顺序组成的一条双股DNA（由于是双股DNA，通常以碱基对计算其长度）。细菌，如大肠杆菌的基因组，含4×106碱基对。人体细胞染色体上所含DNA为3×109碱基对。
遗传信息要在子代的生命活动中表现出来，需要通过复制、转录和转译。复制是以亲代 DNA为模板合成子代 DNA分子。转录是根据DNA的核苷酸序列决定一类RNA分子中的核苷酸序列；后者又进一步决定蛋白质分子中氨基酸的序列，就是转译。因为这一类RNA起着信息传递作用，故称信使核糖核酸(mRNA)。由于构成RNA的核苷酸是4种，而蛋白质中却有20种氨基酸，它们的对应关系是由mRNA分子中以一定顺序相连的 3个核苷酸来决定一种氨基酸，这就是三联体遗传密码。
基因在表达其性状的过程中贯串着核酸与核酸、核酸与蛋白质的相互作用。DNA复制时，双股螺旋在解旋酶的作用下被拆开，然后DNA聚合酶以亲代DNA链为模板，复制出子代 DNA链。转录是在 RNA聚合酶的催化下完成的。转译的场所核糖核蛋白体是核酸和蛋白质的复合体，根据mRNA的编码，在酶的催化下，把氨基酸连接成完整的肽链。基因表达的调节控制也是通过生物大分子的相互作用而实现的。如大肠杆菌乳糖操纵子上的操纵基因通过与阻遏蛋白的相互作用控制基因的开关。真核细胞染色质所含的非组蛋白在转录的调控中具有特殊作用。正常情况下，真核细胞中仅2～15％基因被表达。这种选择性的转录与转译是细胞分化的基础。
蛋白质－脂质体系 生物体内普遍存在的膜结构，统称为生物膜。它包括细胞外周膜和细胞内具有各种特定功能的细胞器膜。从化学组成看，生物膜是由脂质和蛋白质通过非共价键构成的体系。很多膜还含少量糖类，以糖蛋白或糖脂形式存在。
1972年提出的流动镶嵌模型概括了生物膜的基本特征：其基本骨架是脂双层结构。膜蛋白分为表在蛋白质和嵌入蛋白质。膜脂和膜蛋白均处于不停的运动状态。
生物膜在结构与功能上都具有两侧不对称性。以物质传送为例，某些物质能以很高速度通过膜，另一些则不能。象海带能从海水中把碘浓缩 3万倍。生物膜的选择性通透使细胞内pH和离子组成相对稳定，保持了产生神经、肌肉兴奋所必需的离子梯度，保证了细胞浓缩营养物和排除废物的功能。
生物体的能量转换主要在膜上进行。生物体取得能量的方式，或是像植物那样利用太阳能在叶绿体膜上进行光合磷酸化反应；或是像动物那样利用食物在线粒体膜上进行氧化磷酸化反应。这二者能量来源虽不同，但基本过程非常相似，最后都合成腺苷三磷酸。对于这两种能量转换的机制，P.米切尔提出的化学渗透学说得到了越来越多的证据。生物体利用食物氧化所释放能量的效率可达70％左右，而从煤或石油的燃烧获取能量的效率通常为20～40％，所以生物力能学的研究很受重视。对生物膜能量转换的深入了解和模拟将会对人类更有效地利用能量作出贡献。
生物膜的另一重要功能是细胞间或细胞膜内外的信息传递。在细胞表面，广泛地存在着一类称为受体的蛋白质。激素和药物的作用都需通过与受体分子的特异性结合而实现。癌变细胞表面受体物质的分布有明显变化。细胞膜的表面性质还对细胞分裂繁殖有重要的调节作用。
对细胞表面性质的研究带动了糖类的研究。糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂等生物大分子结构与功能的研究越来越受到重视。从发展趋势看，寡糖与蛋白质或脂质形成的体系将成为分子生物学研究的一个新的重要的领域。
理论意义和应用 分子生物学的成就说明：生命活动的根本规律在形形色色的生物体中都是统一的。例如，不论在何种生物体中，都由同样的氨基酸和核苷酸分别组成其蛋白质和核酸。遗传物质，除某些病毒外，都是DNA，并且在所有的细胞中都以同样的生化机制进行复制。分子遗传学的中心法则和遗传密码，除个别例外，在绝大多数情况下也都是通用的。
物理学的成就证明，一切物质的原子都由为数不多的基本粒子根据相同的规律所组成，说明了物质世界结构上的高度一致，揭示了物质世界的本质，从而带动了整个物理学科的发展。分子生物学则在分子水平上揭示了生命世界的基本结构和生命活动的根本规律的高度一致，揭示了生命现象的本质。和过去基本粒子的研究带动物理学的发展一样，分子生物学的概念和观点也已经渗入到基础和应用生物学的每一个分支领域，带动了整个生物学的发展，使之提高到一个崭新的水平。
过去生物进化的研究，主要依靠对不同种属间形态和解剖方面的比较来决定亲缘关系。随着蛋白质和核酸结构测定方法的进展，比较不同种属的蛋白质或核酸的化学结构，即可根据差异的程度，来断定它们的亲缘关系。由此得出的系统进化树，与用经典方法得到的是基本符合的。采用分子生物学的方法研究分类与进化有特别的优越性。首先，构成生物体的基本生物大分子的结构反映了生命活动中更为本质的方面。其次，根据结构上的差异程度可以对亲缘关系给出一个定量的，因而也是更准确的概念。第三，对于形态结构非常简单的微生物的进化，则只有用这种方法才能得到可靠结果。
高等动物的高级神经活动是极其复杂的生命现象，过去多是在细胞乃至整体水平上研究，近年来深入到分子水平研究的结果充分说明高级神经活动也同样是以生物大分子的活动为基础的。例如，在高等动物学习与记忆的过程中，大脑中RNA和蛋白质的组成发生明显的变化，并且一些影响生物体合成蛋白质的药物也显著地影响学习与记忆的能力。又如，“生物钟”是一种熟知的生物现象。用鸡进行的实验发现，有一种重要的神经传递介质（5-羟色胺）和一种激素（褪黑激素）以及控制它们变化的一种酶，在鸡脑中的含量呈24小时的周期性变化。正是这种变化构成了鸡的“生物钟”的物质基础。
在应用方面，生物膜能量转换原理的阐明，将有助于解决全球性的能源问题。了解酶的催化原理就能更有针对性地进行酶的人工模拟，设计出化学工业上广泛使用的新催化剂，从而给化学工业带来一场革命。
分子生物学在生物工程技术中也起了巨大的作用，1973年重组DNA技术的成功，为基因工程的发展铺平了道路。80年代以来，已经采用基因工程技术，把高等动物的一些基因引入单细胞生物，用发酵方法生产干扰素、多种多肽激素和疫苗等。基因工程的进一步发展将为定向培育动、植物和微生物良种以及有效地控制和治疗一些人类遗传性疾病提供根本性的解决途径。
从基因调控的角度研究细胞癌变也已经取得不少进展。分子生物学将为人类最终征服癌症做出重要的贡献。
[编辑本段]分子生物学的应用
1，亲子鉴定
近几年来，人类基因组研究的进展日新月异，而分子生物学技术也不断完善，随着基因组研究向各学科的不断渗透，这些学科的进展达到了前所未有的高度。在法医学上，STR位点和单核苷酸（SNP）位点检测分别是第二代、第三代DNA分析技术的核心，是继RFLPs（限制性片段长度多态性）VNTRs（可变数量串联重复序列多态性）研究而发展起来的检测技术。作为最前沿的刑事生物技术，DNA分析为法医物证检验提供了科学、可靠和快捷的手段，使物证鉴定从个体排除过渡到了可以作同一认定的水平，DNA检验能直接认定犯罪、为凶杀案、强奸杀人案、碎尸案、强奸致孕案等重大疑难案件的侦破提供准确可靠的依据。随着DNA技术的发展和应用，DNA标志系统的检测将成为破案的重要手段和途径。此方法作为亲子鉴定已经是非常成熟的，也是国际上公认的最好的一种方法。

生物技术应用大专毕业论文怎么写

分子生物技术在微生物降解环境 污染物中的应用 [摘要〕介绍了与环境微生物关键降解酶基因的筛选、克隆及应用相关的分r生物技术，包括聚合酶链式反应技 术、基因重组技术、荧光原位杂交技术和生物信息学等技术，并对这些技术在污染物降解基因检测、筛选和克隆方 面的应用进行了阐述与探讨、 [关键词]分子生物技术;微生物;基因;环境污染物;降解 随着现代j:\地技术的发展，多环芳烃、含氯有 机物和硝基苯类化合物等人工合成井难以降解的 污染物大量排放，造成世界范围内的环境污染和生 态破坏，严重地威胁人类和其他生物的正常生存和 发展。利用微生物修复技术对受污染的水体及土 壤进行处理，凸显了其重要的意义和可行性。研究 人员发现并筛选到一些微生物，它们不仅对环境有 较高的适应性、对污染物有较高的耐受性，而且对 污染物有较强的降解效率和专一性。然而环境中 存在的大量微生物中仅有少于1%可通过传统的培 养方法进行培养、分离和纯化，绝大多数细菌需要 非常严格的营养条件川。因此，为了对修复环境有 所贡献却难以培养的微生物进行更全面了解，也为 了筛选到更多有利于降解环境污染物的微生物菌 种及其关键酶基因，分子生物技术和手段逐渐被广 泛应用到环境可降解污染物及降解机理方面的研 究中。 本文对近年来发展起来的聚合酶链式反应 (PCR)技术、基因重组技术、荧光原位杂交(FISH) 技术和生物信息学等多种分子生物技术进行了介 绍，并总结了它们在污染物降解基因检测、筛选和 克隆方面的应用。 1与环境污染物降解相关的分子生 物技术 1.1PCR及其相关技术 PCR是一种利用脱氧核糖核酸(DNA)半保留 复制原理，在体外扩增位于两段已知序列之间的 DNA区段从而得到大量拷贝的分子生物技术。根 据其模板、引物来源或扩增条件的不同，PcR技术 可分为以下几种:(l)反转录pCR(RT一PeR)技 术，将mRNA反转录为cDNA后再对其进行PCR 扩增，可用来构建cDNA文库，分析不同生长时期 的mRNA表达状况和相关性以及mRNA的定量测 定等;(2)巢式PCR技术，在扩增大片段目的DNA 时，先用非特意性引物扩增再用特意性引物对第一 次扩增产物进行第二次扩增，以获得可供分析的 DNA;(3)竞争PCR技术，是一种定量PCR，向PCR 反应体系中加人人工构建的带有突变的竞争模板， 通过控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度， 对目的模板作定量研究;(4)实时荧光定量PCR技 术，在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析，该法已广泛用于基因表 达研究、转基因研究等方面;(5)扩增的rDNA限制 酶切分析技术，根据原核生物rDNA序列的保守性， 将扩增的rDNA片段进行酶切，通过酶切图谱来分 析菌间的多样性;(6)RNA随机引导PCR技术，基 于任意寡核昔酸引物与RNA之间可能的配对，在 低严谨度条件下经聚合酶催化使链延伸，将细胞总 RNA或InRNA作为反转录反应的模板，此技术结 合单链构象多态性，用非变性胶分辨大小相同而构 象不同的片段，可用于诊断遗传突变及分析污染条 件下序列的多态性;(7)随机扩增多态DNA (RAPD)技术，是一种基于PCR检测PCR引物结合 位点序列改变的方法，通常以10bp的寡核昔酸序 列为引物，对基因组DNA随机扩增，电泳分离染色 扩‘增产物，再分析多态性。 1.2FISH技术 FISH技术利用荧光标记的探针在细胞内与特 异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光 来检测信号。荧光探针比放射性探针更安全，具有 较好的分辨力，不需要额外的检测步骤。近年来， 由于FISH技术具有灵敏、便捷等优点，迅速发展完 善成为研究环境微生物的有力工具。此外，可用不 同激发和散射波长的荧光染料标记探针，在一步反 应中同时检测几个靶序列。该技术主要包括试样 固定、预处理、预杂交、探针和试样变性、杂交、漂洗 去除未结合的探针、检测杂交信号等步骤。由于 165rRNA具有遗传稳定性，因此成为FISH技术检 测最常用的靶序列。 1.3基因重组技术 基因重组技术是从供体生物的基因组中通过 酶切扩增等手段获取目的基因，与载体连接形成重 组DNA分子，再导入到受体细胞中，让外源基因得 以表达。在已经分离出的许多菌株中，与降解能力 有关的基因多在质粒体上。由于质粒很容易在细 菌的繁殖过程中遗失，对细菌降解能力的长期稳定 非常不利，可将其与污染物降解有关的酶基因重组 到大肠杆菌等微生物中进行表达，以此构建的各种 生物降解特性增强的重组菌可用于污染环境的治 理修复或发酵某些废弃物。 1.4生物信息学 20世纪后期，生物学的迅猛发展，从数量上和 质量上极大地丰富了基因组数据库、蛋白质数据 库、酶数据库和文献数据库等许多生物科学的数据 资源。已有多个国家和国际科研组织建立了生物 信息数据库，如欧洲分子生物学实验室(Eur叩ean MolecularBiologyLaboratory)核酸序列数据库和美 国国家生物技术情报中心(Nationaleente:fo:Bio- technologyInformation，NCBI)基因序列数据库等。 科学家利用计算机及生物信息分析软件分析这些 数据资源，确定大分子序列、结构、表达模式和生化 途径与生物数据之间的关系，区分生物个体间遗传 差异，揭示DNA多样性。例如，基本局部比对搜索 工具(BasieLoealAlignmentSearehTool，BLAST)， 是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似 性比较的分析工具。它基于Altschul等的方法「2〕， 在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。 BLAST程序可对一条或多条、任何数量、任何形式的 序列在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对，甚 至将有缺口的比对序列也考虑在内，利用比较结果中 的得分对序列进行相似性说明。基因的序列分析可 揭示出生物物种之间的关系，在污染治理研究中可用 于生物基因组特殊区域或特异基因的测序。 2分子生物技术在环境污染物降解 中的应用 2.1土壤试样总DNA的提取 用适当方法直接从土壤中提取DNA并纯化， 是从分子生物学角度对土壤微生物进行研究的前 提条件，而后可进行酶切、PCR扩增、核酸分子杂交 等分子生物学技术操作。从土壤中提取微生物 DNA主要分为汽接法和间接法}’{。直接法是在 ogram等的方法基础卜发展起来的，其主要包括2 个步骤:(l)原位细胞裂解;(2)DNA提取和纯化。 直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60%且省 力，但提取的DNA常常有折断、腐殖酸污染、甚至 提取物中还夹杂有未知的胞外DNA和真核生物的 DNA。最先报道间接法的是Faegri等[‘〕，其主要包 括4个步骤:(l)分散土壤;(2)分离细胞与土壤; (3)细胞裂解;(4)DNA纯化。间接法提取DNA 产量低且费力，但纯度较高、DNA损伤小，提取的 大片段DNA可用来构建cos而d和细菌人工染色体 文库等。 2.2采用PCR及相关技术扩增分析DNA片段 可降解污染物的微生物必然能产生分解代谢 该污染物的酶。selvaratnam等L’l用编码苯酚单加 氧酶dmpN摹因的RT一PCR技术来检测序列间歇 式活性污泥反应器‘{一，降解酚的假单胞菌。检测结 果表明，RT一PCR技术不仅能检测微生物降解酚的 能力，还能测量dmpN基因的转录水平，从而确定假 单胞菌特殊的分解活性，发现了在转录水平下，酚 浓度与通气时间之问存在正相关关系。 将PCR技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)结 合起来，在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基 对，分辨率较高。染色后的凝胶用成像系统进行分 析，可在一定程度l几反应试样的复杂性。条带的多 少能反应试样「 一 }1微生物组成的差异，条带的亮度能 反应试样中微生物的多少。基于以上优点，日前该 技术在微生物群落结构的分析和动态研究方面得 到了厂‘泛应用。DGGE可通过分析PCR扩增的基 因点突变来探索微生物的复杂性。徐玉泉等[“〕从 某废水中分离出一株能以苯酚为惟一碳源的菌株 PHEA一2，使用PCR一DGGE技术对该菌165 rDNA进行分析，发现该菌与醋酸钙不动杆菌同源。 M盯sh等r了)利用PcR一DGGE技术获得了活性污泥 中真核微生物的种群变化情况。王峰等下8〕采用 PCR一DGGE技术对城市污水化学生物絮凝处理中 活性污泥和生物膜微生物种群结构进行了分析，结 果表明活性污泥培养前后微生物种群结构发生r 很大改变。 RAPD技术也是一种应用比较广泛的以多态性 引物来扩增某些片段的技术。RAPD技术可用于检 测含有混合微生物种群的各种微生物反应器中微 生物的多样性。用RAPD技术分析检测实验室规 模的油脂淤泥培养料中的细菌菌群发现，用油脂淤 泥改良过的培养料比未改良的更适于不同的微生 物种群生长[9j。vainio等t’。〕从516种孤立的菌落 中提取出165rDNA，经PCR扩增后进行测序，检测 活性污泥中微生物种群的结构。这些组合技术的 应用显著增强r对微生物的检测和鉴定能力，为理 论研究工艺优化及提高生物处理效率提供了条件。 2.3基因重组 基因工程技术应用于环境保护起始于20世纪 80年代。其基本原理是通过基因分离和重组技术， 将目的基因片段，比如可编码降解某种污染物的 酶，转移到受体生物细胞中并表达，使受体生物具 有该目的基因表达显现的特殊性状，从而达到治理 污染的目的。找到特定污染的抗性基因，利用基因 重组技术转基因后也可获得其他抗性植株以及筛 选到可转化污染物的植物，还可开发超量积累植物 进行污染土壤的生物修复。 罗如新等L”〕用放射性同位素标记tfdc基因片 段作探针，Southemblot杂交定位Ll菌株的邻苯二 酚1，2一双加氧酶基因位于Pstl的I片段和BamH I的M、N片段，回收并将其直接克隆至表达载体 pKT230卜，获得的重组子能转化不具开环酶活性 的甲胺磷降解菌P2，得到高于天然宿主21倍的邻 苯二酚1，2一双加氧酶。stingley等{”〕通过构建基 因文库和重组质粒等基因工程方法证实了NidAB 双加氧酶是降解菲的关键酶类，并首次鉴定出此基 因通过磷苯二甲酸实现降解功能。chae等‘”}发现 不能降解苯酚的su如lobusso扣taricu、98/2菌株中 的儿茶酚2，3一双加氧酶基因与能降解苯酚的 sulfolo右u，，o如taricu、咫有[6J源区，分析得知它们 是山共同祖先进化而来。把儿茶酚2，3一双加氧酶 基因克隆到大肠杆菌中表达，可获得有较高降解活 性的双加氧酶。 重金属污染是环境污染的重要方面之一。随 着分子生物学技术的发展，越来越多的修复性蛋白 基因正被从植物、微生物和动物中陆续分离出来， 如汞离子还原酶基因、有机汞裂解酶基因、汞转运 蛋自基因、金属硫蛋白基因、植物络合素合成酶基 因、铁离子还原酶基因和锌转运蛋白基因L’‘〕。这些 基因通过基因工程的改造，重组到合适的受休细胞 中表达相应的蛋白质和酶，达到治理难以降解的有 毒有害污染物的目的。sorsa等〔”〕把MTS插人 LamB序列的153位点，在中表达MTs，解决 r细胞内MTs对金属离子有限的吸附能力。综L 所述，基因重组技术具有快速、高效的特性，已逐渐 成为环境生物技术的研究热点。 2.4FISH技术 FISH技术利用核糖体内长度适中(约1500bp)、 高度保守的165:RNA序列作为理想的基因分类靶 序列，其中使用的165:RNA寡核普酸探针一般是 进行了荧光标记的20bp左右特异性核昔酸片段， 利用该报告分子(如生物素、地高辛)与荧光素标记 的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测系 统对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 FISH技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分 布和原位生理学等信息。 硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧 菌，传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定 步骤，耗时长。HSH技术的引人解决了上述困难。 FlsH技术还被广泛用于活性污泥系统、硝化流化床 反应器和膜生物反应器等废水处理系统}’61。 基因工程微生物越来越多地被用于农业害虫 控制和环境污染的生物修复，对人类健康和环境的 影响引起广泛关注。1994年出现了一种新的标记 系统:绿色荧光蛋白(GFP)，由于GFP基因表达产 物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记 检测卜分方便、简单。在某些被污染的环境中可分 离出降解该污染物的细菌，通过基因重组等手段使 用GFP分子标记，可更容易的分离检测被标记的 细胞叫。 Bastes等[’8]进行了苯酚降解菌染色体GFP基 因标记实验。通过PCR和Southemblot分析，证明 GFP基因已成功整合到宿主细胞的染色体中。对 标记菌与野生型的降解能力比较结果证明，GFP分 子标记的插人并不影响细胞的苯酚降解能力。 用G即标记Pseudomonasputida，研究活性淤 泥中细菌存活情况{’9飞。Pseudomonasputida被转到 活性淤泥2min后，观察到细胞在淤泥絮凝物间自 由游动;培养3d后，发现荧光细胞减少，大部分已 被合并到淤泥絮凝物中，以防止细菌被原生动物捕 食。用oFP标记石.eozi和Serraliamarceseern，考 察菌株附到絮凝物卜的过程{’()j。使用表面荧光显 微镜能将带有GFP标记的细胞从活性污泥中区分 开，井进行观察和记数。而聚焦激光扫描显微镜 (cLsM)可使GFP标记细菌产生三维轮廓，结合表 面荧光显微镜和CLSM观察GFP标记细胞，结果表 明，细胞表面疏水性在细菌附到絮凝物的过程中起 重要作用，两种细菌附在絮凝物上的模式有很大不 同，通过这种方法可更好地理解细菌赫附机理，有 助于提高废水处理效果。 3结语 分子生物技术的应用使研究人员可从微观的 角度更细致深人地了解微生物对污染物降解的具 体生理生化机制，在分子水平 _ _ [揭示生物体吸收、 迁移、积累有害物质最终被毒害，及适应、抗性等生 态问题，从而筛选到更多有利用价值的微生物。随 着越来越多微生物全部基因序列的解码，对各种细 菌体内可降解基因的分布和表达会有更深人的了 解，有关技术的发展和成熟必将对污染物的降解过 程有一个整体的、生态水平上的认识。 参考文献 l李凤，刘世贵 . 分子生物学技术在环境微生物研究中的 应用 . 世界科技研究与发展，2003，25(4):88一92 2AltsehulSF，GishW，MillerW，oealalign- mentsearehtool . 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　　分子细胞基因组的研究

　　随着结构分析技术的发展，现在已有几千个蛋白质的化学结构和几百个蛋白质的立体结构得到了阐明。70年代末以来，采用测定互补DNA顺序反推蛋白质化学结构的方法，不仅提高了分析效率，而且使一些氨基酸序列分析条件不易得到满足的蛋白质化学结构分析得以实现。
　　发现和鉴定具有新功能的蛋白质，仍是蛋白质研究的内容。例如与基因调控和高级神经活动有关的蛋白质的研究现在很受重视。
　　蛋白质－核酸体系 生物体的遗传特征主要由核酸决定。绝大多数生物的基因都由 DNA构成。简单的病毒，如λ噬菌体的基因组是由 46000个核苷酸按一定顺序组成的一条双股DNA（由于是双股DNA，通常以碱基对计算其长度）。细菌，如大肠杆菌的基因组，含4×106碱基对。人体细胞染色体上所含DNA为3×109碱基对。
　　遗传信息要在子代的生命活动中表现出来，需要通过复制、转录和转译。复制是以亲代 DNA为模板合成子代 DNA分子。转录是根据DNA的核苷酸序列决定一类RNA分子中的核苷酸序列；后者又进一步决定蛋白质分子中氨基酸的序列，就是转译。因为这一类RNA起着信息传递作用，故称信使核糖核酸(mRNA)。由于构成RNA的核苷酸是4种，而蛋白质中却有20种氨基酸，它们的对应关系是由mRNA分子中以一定顺序相连的 3个核苷酸来决定一种氨基酸，这就是三联体遗传密码。
　　基因在表达其性状的过程中贯串着核酸与核酸、核酸与蛋白质的相互作用。DNA复制时，双股螺旋在解旋酶的作用下被拆开，然后DNA聚合酶以亲代DNA链为模板，复制出子代 DNA链。转录是在 RNA聚合酶的催化下完成的。转译的场所核糖核蛋白体是核酸和蛋白质的复合体，根据mRNA的编码，在酶的催化下，把氨基酸连接成完整的肽链。基因表达的调节控制也是通过生物大分子的相互作用而实现的。如大肠杆菌乳糖操纵子上的操纵基因通过与阻遏蛋白的相互作用控制基因的开关。真核细胞染色质所含的非组蛋白在转录的调控中具有特殊作用。正常情况下，真核细胞中仅2～15％基因被表达。这种选择性的转录与转译是细胞分化的基础。
　　蛋白质－脂质体系 生物体内普遍存在的膜结构，统称为生物膜。它包括细胞外周膜和细胞内具有各种特定功能的细胞器膜。从化学组成看，生物膜是由脂质和蛋白质通过非共价键构成的体系。很多膜还含少量糖类，以糖蛋白或糖脂形式存在。
　　高等植物的性状主要由核基因控制，其遗传遵循孟德尔规律。1900年Coorence和Baut等人就已发现影响质体表型的一些突变不符合孟德尔遗传规律；1962年里斯(Ris)和Plont证明植物叶绿体中存在遗传物质DNA。现已证明，植物细胞质中的叶绿体和线粒体都含有自己的DNA及整套的转录和翻译系统，能够合成蛋白质。高等植物的叶绿体和线粒体基因组，多数在有性杂交过程中表现为母性遗传。其机制有两种解释：一是认为雄配子不含有细胞质，因而没有胞质基因；另一种观点是雄配子含有少量的细胞质，其细胞器在受精前即已解体，失去功能。胞质基因组的母性遗传，大大限制了胞质基因的遗传研究，利用有性杂交方法难以知晓当胞质基因处于杂合状态时的遗传和生理效应及其对表型的影响。近年来发展起来的体细胞杂交技术为胞质基因的研究开辟了一条新途径。本文拟对植物体细胞杂交后代胞质基因重组的多样性，创制胞质杂种的可能途径及胞质基因组的传递等问题加以说明。
　　1 植物体细胞杂交后代胞质基因组重组的多样性
　　体细胞杂交时，核基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组三者均既可以单亲传递又可以双亲传递，因而可以产生许多有性杂交难以产生的核-质基因组的新组合类型。Kumar等人根据已有的实验结果结合理论推导提出，植物体细胞杂交一代理论上可以产生48种类型，而相应的有性杂交一代只能产生两种类型。48种类型可分为亲型、核杂种和胞质杂种3类。胞质杂种即是具有一个亲本的细胞核和双亲细胞质的植株或愈伤组织，它是研究胞质基因组的好材料。
　　2 创制胞质杂种的方法
　　2．1 “供体-受体”原生质体融合技术 这是目前最为可行的方法，由Zelcer等(1987)提出。其原理基于生理代谢互补，利用高于致死剂量的电离辐射处理供体原生质体使其核解或完全失活，细胞质完整无损；再用碘乙酸或碘乙酚胺处理受体原生质体以使其受到暂时抑制而不分裂，这样双亲原生质体融合后，只有融合体能够实现代谢上的补偿，进行持续分裂，形成愈伤组织或再生植株，这些融合体就是各种各样的胞质杂种。此技术的优点是双亲不需任何选择标记，适用范围广，可行性强，缺点是适宜的辐射剂量难以掌握。
　　2．2 “胞质体-原生质体”融合法 所谓胞质体是指去核后的原生质体。该法由Maliga提出。优点是避免了电离辐射可能产生的不利影响，缺点是制备胞质体尚存在一些技术性的困难。最近Lesney等人提出了一种能够从悬浮系原生质体制备大量胞质体的方法。
　　2．3 其它的可能途径
　　(1)根据双亲原生质体形态上的差异或通过荧光染料标记来机械分离融合体，然后进行微培养。(2)利用分别由核基因组和质基因组编码的抗药性状，通过双重抗性选择获得胞质杂种。(3)原生质体直接摄取外缘细胞器。(4)通过显微注射或电激法实现细胞器转移。
　　3 胞质杂种中双亲胞质基因的传递遗传学
　　3．1 叶绿体基因组 胞质杂种中，叶绿体基因组的传递分为单亲传递和双亲传递两种。单亲传递是指胞质杂种愈伤组织及由之再生的植株只含有亲本之一的叶绿体基因组。这种分离机制目前尚不清楚。关于叶绿体基因组的分离是否随机的问题，由于研究者们采用的试验材料不同得出两种结论：一种是叶绿体基因组的随机分离，这在品种间、种间及属间原生质体融合中都被观察到；另一种是叶绿体基因组的非随机分离(即亲本之一的叶绿体基因组优先保留)，如弗利克(Flick)和埃文(Evens，1982)在烟草的研究中表明，所有的N．nesophila和N．tabacum体细胞杂种都只具有N．nesophila叶绿体基因组，类似的例子很多。双亲传递是指胞质杂种中，同时含有双亲的叶绿体基因组，其在体细胞杂种以后的有性繁殖过程中能够保持稳定，既然双亲叶绿体能够共存，理论上二者就有可能发生重组。事实上，叶绿体基因组重组现象已被观察到，但频率很低。
　　3．2 线粒体基因组 胞质杂种中，线粒体基因组的传递方式是双亲传递，且发生活跃的重组，产生丰富的新类型。然而在分析线粒体基因组重组类型时不可忽视由于离体培养而诱发的线粒体基因组分子内重组(突变)的可能性，因为离体培养过程中不仅使核基因组产生大量变异，而且对于某些植物，也可诱发线粒体基因组发生变异。
　　4 植物胞质基因组控制的重要性状
　　目前已基本阐明的由叶绿体基因组编码的性状主要是一些抗药性状。如：链霉素抗性、林肯霉素抗性等。在与线粒体基因组有关的性状中，研究最多的是胞质型雄性不育性状。许多学者在不同植物上研究发现，雄性不育系与其同型保持系之间在线粒体DNA内切图谱或其编码的蛋白上存在明显差异。如在玉米上已发现T型雄性不育植株的线粒体基因组发生了多至7次重组，且主要发生于26s rRAN基因附近，产生一个嵌合基因，因此导致转录时阅读框架发生了改变，如果这个嵌合基因发生了缺失或小段插入，则阅读框架恢复正常，育性也随之恢复。
　　总之，植物体细胞杂交是胞质基因组及其所控制性状研究的有效途径，关于胞质性状的研究对于某些植物已从分子水平上深入到了与雄性不育相关的特异线粒体DNA片段及相应的特殊蛋白，但仍有许多问题有待深入研究。这些问题的阐明将会使得从分子水平上改良雄性不育性状成为可能。