蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。被食入的蛋白质在体内经过消化分解成氨基酸，吸收后在体内主要用于重新按一定比例组合成人体蛋白质，同时新的蛋白质又在不断代谢与分解，时刻处于动态平衡中。因此，食物蛋白质的质和量、各种氨基酸的比例，关系到人体蛋白质合成的量，尤其是青少年的生长发育、孕产妇的优生优育、老年人的健康长寿，都与膳食中蛋白质的量有着密切的关系[编辑本段]蛋白质的生理功能1、构造人的身体：蛋白质是一切生命的物质基础，是肌体细胞的重要组成部分，是人体组织更新和修补的主要原料。人体的每个组织：毛发、皮肤、肌肉、骨骼、内脏、大脑、血液、神经、内分泌等都是由蛋白质组成，所以说饮食造就人本身。蛋白质对人的生长发育非常重要。比如大脑发育的特点是一次性完成细胞增殖，人的大脑细胞的增长有二个高峰期。第一个是胎儿三个月的时候；第二个是出生后到一岁，特别是0---6个月的婴儿是大脑细胞猛烈增长的时期。到一岁大脑细胞增殖基本完成，其数量已达成人的9/10。所以0到1岁儿童对蛋白质的摄入要求很有特色，对儿童的智力发展尤关重要。2、修补人体组织：人的身体由百兆亿个细胞组成，细胞可以说是生命的最小单位，它们处于永不停息的衰老、死亡、新生的新陈代谢过程中。例如年轻人的表皮28天更新一次，而胃黏膜两三天就要全部更新。所以一个人如果蛋白质的摄入、吸收、利用都很好，那么皮肤就是光泽而又有弹性的。反之，人则经常处于亚健康状态。组织受损后，包括外伤，不能得到及时和高质量的修补，便会加速机体衰退。3、维持肌体正常的新陈代谢和各类物质在体内的输送。载体蛋白对维持人体的正常生命活动是至关重要的。可以在体内运载各种物质。比如血红蛋白—输送氧（红血球更新速率250万/秒）、脂蛋白—输送脂肪、细胞膜上的受体还有转运蛋白等。4、白蛋白：维持机体内的渗透压的平衡及体液平衡。5、维持体液的酸碱平衡。6、免疫细胞和免疫蛋白：有白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、抗体（免疫球蛋白）、补体、干扰素等。七天更新一次。当蛋白质充足时，这个部队就很强，在需要时，数小时内可以增加100倍。7、构成人体必需的催化和调节功能的各种酶。我们身体有数千种酶，每一种只能参与一种生化反应。人体细胞里每分钟要进行一百多次生化反应。酶有促进食物的消化、吸收、利用的作用。相应的酶充足，反应就会顺利、快捷的进行，我们就会精力充沛，不易生病。否则，反应就变慢或者被阻断。8、激素的主要原料。具有调节体内各器官的生理活性。胰岛素是由51个氨基酸分子合成。生长素是由191个氨基酸分子合成。7、构成神经递质乙酰胆碱、五羟色氨等。维持神经系统的正常功能：味觉、视觉和记忆。8、胶原蛋白：占身体蛋白质的1/3，生成结缔组织，构成身体骨架。如骨骼、血管、韧带等，决定了皮肤的弹性，保护大脑（在大脑脑细胞中，很大一部分是胶原细胞，并且形成血脑屏障保护大脑）9、提供热能。[编辑本段]蛋白质的作用蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中，起着十分重要的作用。生物的结构和性状都与蛋白质有关。蛋白质还参与基因表达的调节，以及细胞中氧化还原、电子传递、神经传递乃至学习和记忆等多种生命活动过程。在细胞和生物体内各种生物化学反应中起催化作用的酶主要也是蛋白质。许多重要的激素，如胰岛素和胸腺激素等也都是蛋白质。此外，多种蛋白质，如植物种子（豆、花生、小麦等）中的蛋白质和动物蛋白、奶酪等都是供生物营养生长之用的蛋白质。有些蛋白质如蛇毒、蜂毒等是动物攻防的武器。蛋白质和健康蛋白质是荷兰科学家格里特在1838年发现的。他观察到有生命的东西离开了蛋白质就不能生存。蛋白质是生物体内一种极重要的高分子有机物，占人体干重的54%。蛋白质主要由氨基酸组成，因氨基酸的组合排列不同而组成各种类型的蛋白质。人体中估计有10万种以上的蛋白质。生命是物质运动的高级形式，这种运动方式是通过蛋白质来实现的，所以蛋白质有极其重要的生物学意义。人体的生长、发育、运动、遗传、繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。生命运动需要蛋白质，也离不开蛋白质。球状蛋白质(三级结构)人体内的一些生理活性物质如胺类、神经递质、多肽类激素、抗体、酶、核蛋白以及细胞膜上、血液中起“载体”作用的蛋白都离不开蛋白质，它对调节生理功能，维持新陈代谢起着极其重要的作用。人体运动系统中肌肉的成分以及肌肉在收缩、作功、完成动作过程中的代谢无不与蛋白质有关，离开了蛋白质，体育锻炼就无从谈起。在生物学中，蛋白质被解释为是由氨基酸借肽键联接起来形成的多肽，然后由多肽连接起来形成的物质。通俗易懂些说，它就是构成人体组织器官的支架和主要物质，在人体生命活动中，起着重要作用，可以说没有蛋白质就没有生命活动的存在。每天的饮食中蛋白质主要存在于瘦肉、蛋类、豆类及鱼类中。蛋白质缺乏：成年人：肌肉消瘦、肌体免疫力下降、贫血，严重者将产生水肿。未成年人：生长发育停滞、贫血、智力发育差，视觉差。蛋白质过量：蛋白质在体内不能贮存，多了肌体无法吸收，过量摄入蛋白质，将会因代谢障碍产生蛋白质中毒甚至于死亡。[编辑本段]必需氨基酸和非必需氨基酸纤维状蛋白质(二级结构)食物中的蛋白质必须经过肠胃道消化，分解成氨基酸才能被人体吸收利用，人体对蛋白质的需要实际就是对氨基酸的需要。吸收后的氨基酸只有在数量和种类上都能满足人体需要身体才能利用它们合成自身的蛋白质。营养学上将氨基酸分为必需氨基酸和非必需氨基酸两类。必需氨基酸指的是人体自身不能合成或合成速度不能满足人体需要，必须从食物中摄取的氨基酸。对成人来说，这类氨基酸有8种，包括赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸。对婴儿来说，组氨酸和精氨酸也是必需氨基酸。非必需氨基酸并不是说人体不需要这些氨基酸，而是说人体可以自身合成或由其它氨基酸转化而得到，不一定非从食物直接摄取不可。这类氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸等。有些非必需氨基酸如胱氨酸和酪氨酸如果供给充裕还可以节省必需氨基酸中蛋氨酸和苯丙氨酸的需要量。
随着分子生物学的飞速发展，最为世人瞩目的人类基因组计划即将提前完成。人类将向了解自己的生命奥秘这一目标迈进一大步。但是，由于基因是遗传信息的携带者，而生命活动的执行者却是蛋白质，即基因的表达产物。因此，即使得到人类全部基因序列，也只是解决了遗传信息库的问题。人类揭示整个生命活动的规律，就必须研究基因的物产——蛋白质。相对于基因组而言，后者称为蛋白质组。1 蛋白质组概述及其相关研究技术和方法鉴于基因组研究的局限性，1994年澳大利亚Macquaie 大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组（Proteome）这个概念。定义为“蛋白质组指的是一个基因组所表达的蛋白质”，即“PROTEOME”是由蛋白质的”PROTE”和基因组的“OME”字母拼接而成[1].这个新术语很快得到了国际生物学界的认可。目前对蛋白质组的分析工作大两个方面。一方面，通过二维胶电泳等技术得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱，相关数据将作为待测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。另一方面是比较分析在变化了生理条件下蛋白质组所发生的变化。目前蛋白质组研究技术常用以下手段：（1）用于蛋白质分离技术方面的如双向凝胶电泳（2-DE）、双向“高效”柱层析等。（2）用于蛋白质鉴定的技术如质谱技术、凝胶图像分析、蛋白质和多肽的N端、C端测序及氨基酸组成分析等。（3）用于蛋白质相互作用及作用方式研究的双杂交系统。（4）用于分析大量数据的生物工程信息学等[2].。2 蛋白质组在医学研究中的现状和前景自蛋白质组概念提出以来，已发表相关论文及论著数篇。并于是1997年举行了第一届国际性的“蛋白质组学”会议。同年出版式了第一部蛋白质组学的专著。目前蛋白质组在医学方面的研究重点在于对人类疾病的发病机制、早期诊断及治疗，对致病微生物的致病机理、耐药性及发现新的抗生素为主。现将这两方面的进展情况综述如下。 人类疾病的蛋白质组研究 直肠癌 直肠癌的发生是因多个基因的突变，导致肿瘤抑制基因失能所致，但确切机制仍不清楚。为探讨其发病机制，Sanchez等对15例结肠癌和13例正常人的结肠上皮进行2-DE，每个多肽模式用Melanie I12-DE分析软件进行分析。据此建立了包括882和861个斑点的结肠癌及正常人结肠粘膜的标准胶图。结果发现在分子量为13kD和pI值为处的蛋白质仅出现在结肠癌的组织中。15例结肠癌患者中13/蛋白有13例（87%）。此外，发现13/蛋白不仅在中度、低度分化的结肠癌及有24年病史的溃疡性结肠炎过度表达，而且出现在7例分化程度不同的腺瘤的癌前病灶。但对照组则极少出现。这表明该蛋白的出现对检测早期直肠癌有很强提示。通过对该蛋白HPLC及测序等分析后，发现与钙粒蛋白B（calgranulin B）及钙卫蛋白（calprotectin）有很大关系[3]。 肝癌 醛糖还原酶（aldose reductase, ）是醛酮还原酶超家族中的一个成员。它催化葡萄糖还原为山梨醇，通过减少内源或外源性代谢产物而起到解毒作用。Peter R等在用N-甲基-N-亚基脲诱导（N-methly-N-nitrosourea-induced）的小鼠肝癌中，用2-DE及氨基酸微型测序可分辩出一种肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质（35Kd/）。而在小鼠的晶状体中，则发现一种醛糖还原的同工酶，该酶与已知的小鼠醛糖还原酶有98%的同源性，而与肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质截然不同。这表明两种蛋白质是由相关的两条基因编码，在小鼠不同的器官中表达不同。肝癌诱导的醛糖还原酶蛋白质优先表达在肝癌及胎肝中，它们均受到纤维细胞生长因子的刺激，但随小鼠鼠器官的生理及病理环境而表现不同的形式。经免疫组化证实，肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质在成人肝脏中不表达，但在小鼠的肝癌 中又重新表达。同时发现该蛋白在癌前病变及肝癌中表达强烈，而在肝脏周围的正常组织不表达[4]。表明该蛋白可能与肝癌的发病有很大关系。 扩张型心肌病 扩张型心肌病是一种严重的可导致心衰的心脏病，大多数患者需行心脏移植术。目前其发病机理不明，推测可能为多种因素所致。1990年已有两组人员进行该病的蛋白质组分析。其后不久心肌的2-DE数据库建成，并进入国际互联网络。Knecht等采用2-DE取得了3300个心肌蛋白条带，通过氨基酸序列分析、Edman降解法及基质辅助的激光解吸离子化质谱（MALDI-MS）等分析了其中150条。经活检及术后病理证实，有12条为扩张性心肌病特有的蛋白。但具体资料尚在进一步分析之中[5]。Arnott D等对新福林诱导的肥大心肌细胞进行蛋白质组分析，同对照相比亦发现有8种蛋白质的表达水平发现了变化[6]。 膀胱癌 IFN-γ除抗病毒外，还有一项重要的功能即抗肿瘤作用。目前其抗肿瘤作用机制不明。有资料表明，IFN-γ可能通过在相关细胞中增强或抑制有关基因而发挥抗肿瘤作用。重组IFN-γ和IL-2已开始应用于膀胱癌的治疗中。为探明其作用机制，George等将四种分级程度不同的人膀胱癌新鲜活检标本，用50U/ml IFN-γ作用20个小时后，采用2-DE、微型序列分析、等电聚集、蛋白质印迹等方法，对标本进行蛋白质组分析。结果表明有五种蛋白质（色按酸-tRNA合成酶、IFN-γ诱导的r3，超氧化物歧化酶及两种分子量为和的未知蛋白）的表达量增加了75%，而醛糖还原酶表达量则下降。为研究IFN-γ对治疗膀胱癌的作用机制提供了一种方法[7]。此外，由于缺乏对膀胱鳞状细胞癌客观可靠的组织学分级标准，因而很其进行早期诊断。为此，Morten等对150例膀胱癌进行双盲法2-DE，并结合了蛋白质印迹法、微型序列分析及质谱等技术，建立了新鲜膀胱癌标本的2-DE数据库，且发现角蛋白10、14及银屑病相关的脂肪酸结合蛋白（psoriasis-associated fatty acid-binding protein,PA-FABP）等可以作为膀胱癌不同分化程度的标记物[8]。为早期诊断提供了一种新的手段。[ 本帖最后由 snow_white 于 2007-7-20 16:32 编辑 ]查看完整版本请点击这里：蛋白质组学研究〔综述〕05我也来说两句 查看全部回复 最新回复snow_white (2007-7-20 16:31:50) 其它 目前人的各种组织、器官、细胞乃至各种细胞器已被广泛研究。以期为疾病诊治及了解发病机制提供新的手段。在一项利用蛋白质组研究技术进行的酒精对人体毒性的研究中发现，乙醇 会改变血清蛋白糖基化作用，导致许多糖蛋白的糖基缺乏，如转铁蛋白[9]。Jagathpala等对免疫所致的不孕症的男性精子蛋白质进行蛋白质组分析，发现了导致不孕症的6种自体及异体抗 精子抗体[10]。在对肾癌的研究中，发现有4种蛋白质存在于正常肾组织而在肾癌细胞中缺失。其中两种分别是辅酶Q蛋白色素还原酶和线粒体乏醌氧化还原复合物I。这提示线粒体功能低下可能在肿瘤发生过程中起重要作用[11]。Ekkehard Brockstedt等利用2-DE、Edman微型序列法、MALDI-MS等对人BL60-2伯基特淋巴瘤细胞系进行了细胞凋亡机制的研究，结果发现RNA聚合酶转录因子3a（BTF3a）和/或BTF3b与抗IgM抗体介导（anti-IgM antibody-mediated）的细胞凋亡有很大关系[12]。 致病微生物的蛋白质组研究 近年来，WHO越来越重视感染性疾病对人类健康的影响。除结核、多重耐药链球菌感染及机会致病菌外，出现了一些新的感染因素如HIV、博氏疏螺旋体及埃博拉病毒等。因此这些致病微生物的蛋白质组分析，对于了解其毒性因子、抗原及疫苗的制备非常重要，此外对疾病的诊断、治疗和预防也同样重要。现已获得18种微生物的全部基因组序列，另有60余种的基因序列正在研究之中。这些工作的开展为蛋白质组的研究提供了有利条件。 检测博氏疏螺旋体与免疫有关的蛋白质 博氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）是莱姆病的主要病因，表现为环形红斑及流感样症状，大约有50%的未治患者发展为神经系统及关节系统疾病。该螺旋体可分为3种类型： sensu stricto,, 。其诊断需依靠血清学检查，但存在敏感性及特异性变化的缺点。为获得更可靠的血清学检查，Peter等用2-DE从得到217个银染的蛋白斑点。从中国兔多克隆抗体鉴别出6个已知的讥原。将不同临床表现莱姆病患者的血浆用 2-DE图杂交。用抗IgM及抗IgG作为第二抗体，在10例有游走性红斑的患者血浆中，检测出60~80个抗原。同时发现在有关节炎的患者血浆中，包含有抗15种抗原的IgM抗体及抗76种不同抗原的IgG抗体。而晚期有神经系统症状的患者血浆中，则包含有抗33种抗原的IgM抗体及抗76种抗原的IgG抗体。上述3种类型患者的血浆中均包含有抗6种已知抗原的抗体，且被SDSPAGE杂交所证实。这些抗原均是潜在的具有特异性诊断的标志物。 弓形体抗原的检测 弓形体病是由鼠弓形体虫引起的寄生虫病。全球人口大约有30%是携带者，在欧洲是最常见的寄生虫病。如果妊娠者感染，该虫可通过胎盘引起胎儿的感染。且随着妊娠时间的增加，感染的机会也增加。大约50%母体的感染可引起新生儿先天性疾病。因此诊断及治疗越早越好。目前要依靠血清学及PCR，而单独采用血清学如用IgG，IgM,或IgA抗体对疾病活动期敏感性不够，尤其对于妊娠或有免疫抑制的患者。潜在感染常发生在有免疫抑制的患者中。对AIDS患者来说，鼠弓形体虫是最主要的致命性脑损伤的病因。因此，能否早期诊断对治疗来说尤为关键。Jungblut等将鼠弓形体虫RH株在人羊膜细胞系FL521中传代后，用2-DE得到300个银染的斑点。再将其与以下3种患者的血浆进行免疫杂交：（1）患有急性弓形体病的妊娠女性（n=11）; (2)患急性弓形体病的非妊娠者（n=6）(3)有潜在感染的患者（n=9）。结果有9个斑点对各阶段的弓形体感染均反应，这9种斑点被用来当作弓形体感染的标记。其中7种标记可用作区别疾病的不同阶段。但对区别急性期与潜在期仍需联合应用多种抗原[4]。 白色念珠菌 芽管结构是白色念珠菌向菌丝体转变的早期阶段，该结构能增强白色念珠菌对宿主细胞的粘附力、穿透力及破坏性。目前通过蛋白质组分析方法如2-DE、质谱等已检测出在芽管结构所表达的一组特异蛋白如DNA结合蛋白等，为致病提高了一些参考指标[13]。Monkt等发现，在conA反应后的SDS-PAGE图中，在芽管结构的膜上，分子量为80kD复合糖处，出现很淡的考马斯亮蓝染色，而在孢子时则未出现。提示膜的整合、出现未与ConA结合的80kD复合糖可能与芽管结构的发生及生长有关。粘附素（adhesin）是白色念珠菌表面的组成部分，介导其与宿主的结合，是侵入宿主所需的重要蛋白，包含多种成分如白色念珠菌胞壁上的疏水蛋白等，通过增强菌株的粘附性而在其致病机制中发挥一定作用。但由于这些蛋白有很大同源性、多种糖基化作用及与胞壁或胞浆膜上其它成分形成共价结合，故提纯及分析很难。现通过等电聚集、2-DE及洗脱电泳等方法，可使这些蛋白得到很好的纯化、分离及分析[14]。抗真菌药通过改变真菌胞壁组分的生物合成和重组胞壁相关酶的结合位置而发挥作用。抗真菌药远少于抗细菌药就在于对真菌细胞壁蛋白分析了解太少。现在临床上用于抗真菌的药物多为咪唑类（咪康唑、酮康唑）及三唑类（氟康唑、伊曲康唑），但有很多患者出现耐药现象。在白色念珠菌中，目前发现至少有8种CDR家族的基因可产生耐药株的表现型。且有55种基因分别表达ABC及MFS蛋白（菌内药物输出泵）[]。但这些基因、蛋白与耐药之间的关系仍未清楚。应用2-DE、免疫检测蛋白质等技术，对这些蛋白在菌内的表达量进行分析，发现Cdrlp及CaMdrlp蛋白在耐咪唑类菌株中过量表达。在对咪唑类每感及去除CDR1基因的白色念珠菌株CA114中，提取并检测耐氟康唑突变子（FL3）的表达。结果发现FL3对氟康唑的耐是去除CDR1的基因的白色念珠菌株CA114的500倍 ，是CA114的250倍。且CDR1 mRNA在FL3的量是Ca114的8倍[17]。同时，对敏感性及耐药株蛋白质的2-DE图分析发现，在耐中有25种蛋白质增加，有76种蛋白质减少。推测白色念株菌是通过改变染色体数目或染色体重组来调节基因的表达量，进而产生耐药性[18]。随着蛋白质组技术成熟完善，将对真菌壁及耐药基因分泌的各种蛋白组成分析带来重大突破，并对抗真菌的研制提供重要资料。虽然蛋白质组学还处在一个初期发展研段，但我们相信随着其不断地深入发展，蛋白质组（学）研究在提示诸如生长、发育和代谢调控等生命活动的规律上将会有所突破，对探讨重大疾病的机理、疾病诊断、疾病防治和新药开发将提供重要的理论基础。[ 本帖最后由 snow_white 于 2007-7-20 16:33 编辑 ]snow_white (2007-7-20 16:34:25)二、蛋白质组学的研究进展蛋白质组学强调的是针对蛋白质的一个整体思路。从整体的角度看，蛋白质组研究大致可分为两种类型：一种是针对细胞或组织的全部蛋白质，也就是着眼点是整个蛋白质组；而另一种是以与一个特定的生物学机制或机制相关的全部蛋白质为着眼点，在这里整体是局部性的。针对细胞蛋白质组的完整分析的工作已经比较全面地展开，不仅如大肠杆菌、酵母等低等模式生物的蛋白质组数据库在建立之中，高等生物如水稻和小鼠等的蛋白质研究也已开展，人类一些正常和病变细胞的蛋白质数据库也已在建立之中。与此同时，更多的蛋白质组研究工作则是将着眼点放在蛋白质组的变化或差异上，也就是通过对蛋白质组的比较分析。首先发现并去鉴定在不同生理条件下或不同外界条件下蛋白质组中有差异的蛋白质组分。限于篇幅，本文不对这方面的工作做进一步论述。本文接下来重点介绍近期发表的关于蛋白质组学的几个工作，从中可以看到蛋白质组学的思想方法在蛋白质整体（或局部整体）水平上是如何解决生理学的一些重要问题的。1999年11月《Nature》杂志发表了一篇用蛋白质组学方法研究蛋白质折叠的研究论文[10]。在这篇文章中，Houry等报道了在大肠杆菌胞质中的2500种新生多肽链种只有近300种以GroEL作为分子伴侣来帮助其折叠成正确构象。在以往的相关研究中，通常只是针对某个或某些特定的蛋白质，观察它（们）在折叠过程中是否需要诸如GroEL等分子伴侣的帮助。而在这个工作中，研究是从一个整体的思路出发，首先通过免疫共沉淀的方法获得所有与GroEL结合的肽链，再通过二维电泳和数据库比较等蛋白质研究的手段对这些肽链进行分析鉴定，从而实现了对大肠杆菌近2500条新生多肽链与分子伴侣GroEL的关系的全面分析。在这个工作中，研究者还通过对其中50种与GroEL作用的肽链的鉴定，进一步揭示了决定这些蛋白质能与GroEL相互作用的关键结构特征。应该说，这个工作很好地体现了蛋白质组学的思想方法和技术手段的运用。过去在细胞生物学领域还没有得到过一个主要亚细胞结构的完整的分子图。核孔复合体是一个巨大的跨核膜的八角形结构，是控制大分子在胞质和核质间运输的通道。多年来，很多方法被用来分析这一复合体的组成成分。虽然这些工作取得了很大的进展，但究竟在多大程度上反映了这一复合体的分子原貌仍然是一个未知数。最近通过使用蛋白质组学的手段，Rout等[11]鉴定了完整的酵母核孔复合体所有能检测到的多肽，并系统地对每种可能的蛋白质组分在细胞中定位，结合免疫电镜的方法将各组分在复合体内定位并定量，从而揭示了酵母核孔复合体的完整分子构造，并在此基础上揭示了其工作原理。这个工作可以说是蛋白质组学解决构造生物学问题的一个典范，为揭示其他巨大分子机器的"构造"和工作原理指出了一条新路[12]。通过分析一个蛋白质是否跟功能已知的蛋白质相互作用可得到揭示其功能的线索。因为经验告诉我们，如果两个蛋白质相互作用，那么它们一般参与相同或相关的细胞活动[13]。从近期国际上蛋白质组学研究的发展动向可以看出，揭示蛋白质之间的相互作用关系，建立相互作用关系的网络图，已成为揭示蛋白质组复杂体系与蛋白质功能模式的先导，业已成为蛋白质组学领域的研究热点。2000年初，《Science》登载了一篇应用蛋白质组学的大规模双杂交技术研究线虫生殖器发育的文章[14]。在这个工作中，Walhout等以线虫的生殖发育过程作为研究对象，从已知的27个与线虫发育的蛋白质出发，构造了一个大规模的酵母双杂交系统，得到了100多个相互作用的结果，初步建立了与线虫生殖发育相关的蛋白质相互作用图谱，从而为深入研究和揭示线虫发育的机制等提供了丰富的线索。这个工作不同于一般的应用酵母双杂交进行研究的地方在于，它出于对一个生物学问题的整体思考，尽可能地从所有已知的蛋白质而不只是个别的蛋白质为出发点。这一个工作为以前专注于信号转导过程中单个蛋白质作用的科学家们提供了一个新的思路，即将整个途径的相关蛋白质一起考虑。那么，能否通过酵母双杂交系统来分析一种细胞或特定组织的所有可能的蛋白质之间的相互作用呢？在今年初，《Nature》发表了一篇通过大规模双杂交技术研究酵母近6000个蛋白质之间相互作用的论文[15]。啤酒酵母基因组DNA的全序列业已测定，这为通过双杂交技术来鉴定酵母基因组编码的全部6000种左右的蛋白质间的可能相互作用提供了非常有利的条件。在这个工作中，研究人员采用了两种不同的策略对酵母的蛋白质间的相互作用作了全面分析。一是所谓的列阵筛选法（array screening）。在此方法中，6000株表达不同"猎物"蛋白的酵母单克隆分别加在微滴定板上，带有不同的"诱饵"蛋白的酵母株与前面6000株细胞一一接合形成二倍体细胞，"猎物"蛋白与"诱饵"蛋白的相互作用通过报道基因的表达而被鉴定。这篇文章中报道了192种不同的"诱饵"蛋白与近6000种"猎物"蛋白的相互作用的结果。另一种方法是文库筛选法。该方法与前一种方法的区别是，将表达6000种不同"猎物"蛋白的酵母细胞混在一起构成文库，再将这个文库分别与6000株表达不同"诱饵"蛋白的酵母细胞接合，再进一步筛选鉴定阳性克隆，即"诱饵"与"猎物"发生相互作用的克隆。根据这篇报告，上述两种策略得到了不同的结果，相比之下阵列筛选法更为有效，而文库筛选法的长处是通量大。这一工作的重要意义在于我们已经看到，在基因组序列被了解的基础上，可以利用大规模双杂交技术全面地，当然也是初步地，分析其物种或其细胞、组织的所有蛋白质之间的相互作用关系。相信类似的工作将很快针对其他物种开展，特别是基因组序列已被揭示的物种。由此可见，蛋白质组学已经开始从建立数据库走向解决生命科学的重大问题，成为研究生物学问题或机制的强有力手段。snow_white (2007-7-20 16:37:32)三、蛋白质组学研究进展与趋势曾 嵘 夏其昌（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学研究分析中心 上海 200031）如果在五年前提到蛋白质组学（Proteomics），恐怕知之者甚少，而在略知一二者中，部分人还抱有怀疑态度。但是，2001年的Science杂志已把蛋白质组学列为六大研究热点之一，其“热度”仅次于干细胞研究，名列第二。蛋白质组学的受关注程度如今已令人刮目相看。1．蛋白质组学研究的研究意义和背景随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA mRNA 蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(Transcriptional control )，翻译水平调控(Translational control)，翻译后水平调控(Post-translational control )。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为：(1) 生命现象的发生往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质。(2) 多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联因果。(3) 在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不象基因组那样基本固定不变。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。因此在上世纪90年代中期，国际上产生了一门新兴学科－蛋白质组学（Proteomics），它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。虽然第一次提出蛋白质组概念是在1994年，但相关研究可以追溯到上世纪90年代中期甚至更早，尤其是80年代初，在基因组计划提出之前，就有人提出过类似的蛋白质组计划，当时称为Human Protein Index计划，旨在分析细胞内的所有蛋白质。但由于种种原因，这一计划被搁浅。90年代初期，各种技术已比较成熟，在这样的背景下，经过各国科学家的讨论，才提出蛋白质组这一概念。国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层出不穷。1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心：Australia Proteome Analysis Facility ( APAF )。丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国，各大药厂和公司在巨大财力的支持下，也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。去年在瑞士成立的GeneProt公司，是由以蛋白质组数据库“SWISSPROT” 著称的蛋白质组研究人员成立的，以应用蛋白质组技术开发新药物靶标为目的，建立了配备有上百台质谱仪的高通量技术平台。而当年提出Human Protein Index 的美国科学家Normsn G. Anderson也成立了类似的蛋白质组学公司，继续其多年未实现的梦想。2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（Human Proteome Organization, HUPO）,随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划（Human Proteome Project）。snow_white (2007-7-20 16:37:49)2．蛋白质组学研究的策略和范围蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略。一种可称为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，这种观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组学的本质。但是，由于蛋白质表达随空间和时间不断变化，要分析生物体内所有的蛋白质是一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”，即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式（Expression profile）, 随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。蛋白质-蛋白质相互作用的研究也已被纳入蛋白质组学的研究范畴。而蛋白质高级结构的解析即传统的结构生物学，虽也有人试图将其纳入蛋白质组学研究范围，但目前仍独树一帜。
一、氨基酸和生物资源 Amino Acids and Biotic Resources
本刊是我国唯一一种以生物资源为主题，氨基酸为特色的科技期刊。分为生物资源研究、保护与利用；农副资源研究与利用；生物技术及制品；氨基酸生产技术；氨基酸和生物资源与人类健康；分析检测技术；氨基酸应用；生物产业和生命科学工作者等8个栏目。在生命科学、资源科学、生物工程、饲料科学、食品科学、医药学、营养学等领域深受欢迎。本刊被国内许多文摘和数据库所收录。读者主要为科技工作者、大中专院校师生、技术人员和工人等。
二、基因组蛋白质组与生物信息学报（英文版）Genomics、Proteomics & Bioinformatics
Genomics, Proteomics & Bioinformatics (《基因组蛋白质组与生物信息学报》，简称GPB)创刊于2003年，是由中国科学院北京基因组研究所主办、科学出版社出版的国家级英文学术期刊，由杨焕明教授、于军教授担任主编，汪建教授、贺福初院士担任副主编。本刊主要刊载基因组学、蛋白质组学、生物信息学及其相关领域的研究进展、综述、研究论文、实验技术与方法、研究快讯等高质量的稿件，突出刊物的学术性、前沿性、指导性和实用性。本刊读者对象为基础医学、生命科学、农学、计算机科学领域的科研与教学人员、研究生等，以及数学、物理学领域对生物科学有兴趣的研究者。
三、生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences
本刊以评述、综述、研究简讯（动态）等形式报道国内外生命科学研究的发展趋势、学术动态和研究成果，重点报道生命科学领域的评述性或综述性文章和国家自然科学基金资助的生命科学有关的项目介绍、研究进展、管理经验和问题咨询，同时也报道该领域的研究动态、研究成果、科学家介绍、研究机构介绍和书评等内容。
四、生命科学研究 Life Science Research
本刊是中国以生命科学命名的唯一的全国综合性学术期刊。主要反映世界各国生命科学领域中的最新研究成果，所刊登的论文90%来源于中国国家自然科学基金、国家科技部重大项目基金以及省级科学基金。经过专家评审，论文达到国家先进水平及国内外先进水平的共占85%以上。《生命科学研究》严格执行 ISO8，ISO31，ISO1000，ISO5966等国际标准，遵守国际惯例，逐步实现编排格式国际标准化，1999年被湖南省评定为科技学术类一级期刊，2000年被评为全国CAJ-CD规范执行优秀奖。
五、中国生物工程杂志 China Biotechnology
本刊由中科院文献情报中心和国家科技部中国生物工程开发中心共同主办，是我国生物工程领域全国性学术团体、国家一级学会——中国生物工程学会会刊。《中国生物工程杂志》(月刊)内容涉及医药生物技术、农业生物技术、轻化工生物技术、环境生物技术、海洋生物技术等专业领域。设有学术论文、研究进展、研究报告、专题论述、技术与方法、评论、新闻报道、生物工程领域知识产权研究、市场与商情、会议消息、动态等栏目，还以杂志专集、增刊等的形式出版生物工程专题著述。本刊创刊于1976年，是我国最早创刊的中央级综合性生物工程专业刊物，编辑委员会由国内知名生物工程专家、管理部门领导组成，发行面覆盖全国各省、自治区、直辖市、香港、台湾及海外有关大学、研究机构、图书馆也有相当的订户，和海外建立有广泛的刊物交换联系并被国内外著名检索系统收录。
希望我的回答可以为你提供一些帮助O(∩_∩)O~
GPB一般指基因组蛋白质组与生物信息学报。
《基因组蛋白质组与生物信息学报》是由中国科学院主管，中科院北京基因组研究所与中国遗传学会共同主办的英文版双月刊，创刊于2003年。
刊载内容：
本刊主要刊载：基因组学、蛋白质组学、生物信息学及其相关领域的综述(Reviews)、研究论文(Research articles)、实验技术与方法(Methods)、应用说明(Application Notes)、数据库资料(Datebase Review / Datebase Update)。
评论(Essays / Commentaries / Opinions)、观点(Perspectives)、简报和会议报告(Brief Reports / Meeting Reports)、研究资源(Research Resources)等高质量的稿件，突出刊物的学术性、前沿性、指导性和实用性。
以上内容参考：百度百科-GPB
请参见链接，希望能够对你有所帮助。
中国科学院遗传研究所
说明：此篇笔记系2016-2017年由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂整理而成，侵删。该课程由上海交通大学系统生物医学研究院助理研究员库鑫博士所授。
大伙儿都知道，蛋白质组学（proteomics），是研究一种细胞或者一种生物体所表达的全部蛋白质。虽说现在基因组测序火得一塌糊涂，但是，我们不要忽略了，蛋白质才是执行生命体功能的基本单元，而且蛋白质都是通过形成各种复合物，组成通路网络，去行使各种生物学功能的！所以，有很多生物学问题只能在蛋白质层面上去研究去探索，而且需要站在系统的层面去考察，比如说：蛋白-蛋白相互作用、蛋白的细胞定位、翻译后修饰、信号通路及代谢通路的调控和功能等。这就是为啥蛋白质组学如此重要啦！
既然重要，科学家们自然是想尽办法来研究了！最开始使用的技术就是传说中的双向凝胶电泳（2-DE），由于分辨率低、蛋白质重叠等各种问题，无论是通量还是准确度，都不尽如人意。当质谱技术兴起以后，就迅速被替代了。
说起质谱技术的诞生，估计很多小伙伴都听过那个著名的diao丝逆袭的段子，讲的就是2002年诺贝尔化学奖得主田中耕一，作为蛋白质谱发明人之一，由于一个不小心在实验时错加了甘油，结果神奇地将质谱技术引入到鉴定生物大分子的应用领域。想想，大到整个人类的科技发展史，小到每个个体的人生，都充满了多少不可思议~
当质谱技术与蛋白质组学碰到了一起，真是天雷引了地火，产生出强烈的化学反应，迅速引爆整个学科的发展！也就十几年的时间吧，蛋白质组学的研究目标从细胞模型、动物模型，到人的体液、组织等人体样本，应用范围的生物复杂度越来越高。研究目的呢，也从最初的肽段序列推导，到多肽和蛋白质的定性定量分析，翻译后修饰，再到如今成为新热点的靶向蛋白质组学，总之，势不可挡啊！
说到靶向蛋白质组学，咱们都知道，一直以来蛋白质组学的应用领域主要是针对基础生物学，比如研究通路、蛋白复合物、互作网络，表征细胞和组织的类型，观察细胞周期内蛋白质的表达等。近年来，由于技术的飞速发展，蛋白质组学开始被用于医学研究和药物研究。比如说药物研究，国内可能用得还不多，但在欧美已经开始越来越广泛。以肝毒性为例，蛋白质组学可以为药物研发前期的肝毒性评估提供研究手段。
那么，怎么将蛋白质组学应用到临床及药物研发中呢？就是需要靶向蛋白质组学技术了！以前，蛋白质组学技术主要用于发现新的未知物，比如肽段、蛋白复合物、蛋白的翻译后修饰等。这部分的应用很广，技术门槛比较低，方法比较通用。但问题是，这种方法思路没办法应对大量的临床样本，可重复性和准确性达不到要求。
于是，靶向分析开始兴起，就是说，分析之前我们就明确知道需要分析的物质是什么，然后把它挑出来，进行一个精确的定量和分析！我们不需要一次性验证成千上万的蛋白，但我们需要在成百上午的样本中验证十几种或者几十种我们关心的蛋白质，而且这些蛋白质常常都是浓度很低的蛋白，用传统的方法基本上只有被遗漏的命（后面我会详细讲为什么会遗漏）。有了靶向技术，对于研究临床诊断的生物标志物，就有了更大的可能和更强的支撑了！
那么接下来，根据老师讲课的思路，我就从定性检测、定量检测和靶向蛋白质组学三个方面来分享下听课的收获。
无论是定性还是定量检测，样品制备是跑不掉的准备工作。用于质谱的蛋白质样品，来源非常广泛，只要你是包含了蛋白质的东西，都可以作为来源。对于复杂的样品，比如人体体液或组织样本，蛋白质的提取及去高峰度，常常需要复杂的精细的处理，而且处理流程根据样本和研究目的的不同而不同。这部分内容呢，第二讲“样品前处理”会详扒，感兴趣的小伙伴可以期待我的下一篇听课笔记吧~
话说，蛋白质的定性检测有两种思路：Bottom-up和Top down。Top down是指从一个完整的蛋白出发，在质谱中进行碎片化处理，通过对碎片分子的检测，推导出蛋白的序列。而在使用中真正占绝大多数是Bottom-up方法，也就是我们常说的shotgun方法，它充分利用了蛋白质自身的特点：可以被特定的酶在特定的位点切断。基本思路是，先用蛋白酶把蛋白序列进行酶切，再针对酶切后的肽段进行鉴定，所以进入质谱的检测对象永远是肽段，再根据肽段序列再推导出蛋白序列。
1. 样本处理 ：拿到蛋白来源的各种样本，进行前处理和优化。
2. 蛋白分离 ：根据研究需要，用凝胶分离，提取所需的蛋白，或者不分离，全部拿来检测，需要注意去杂质；
3. 酶切 ：用序列特异性的酶，对蛋白进行酶切；
4. 肽段分离 ：酶切后的肽段进入HPLC（高压液相色谱），这也就是我们常说的LC-MS中的LC，肽段会因为在色谱柱填料上的保留时间的不同，得到预分离；
5. 电离 ：分离后的肽段，加电压使其离子化（ESI）；或者用MALDI基质辅助的激光解离，就不需要HPLC的过程；
6. 质谱解析 ：将带上电荷的肽段送入质谱，肽段会在磁场中发生偏转（质谱仪的基本原理），在质谱里收集信号，得到谱图。
7. 搜库 ：用搜索软件对质谱图进行自动化的分析，得到肽段及蛋白序列信息。
换个角度，对Shotgun方法的流程，我们可以这样来总结：
这里面最关键的一个指标，我们叫Peptide-Spectrum matching（PSM），就是指谱图与肽段的匹配。匹配得越好，则反推出的蛋白就越准确。这个匹配的过程，也就是我们常说的搜库。那么接下来我就来分享一下从课程中学习到的搜库背景知识、搜库工具和算法，以及对搜索结果的评估。
质谱，听上去很高大上，无论有多贵重，都是由三部分组成的：离子源+质量分析器+检测器。
一台质谱可以不止一个离子源＼分析器＼检测器，可以把几种串联起来，针对不同分析需要来使用。
离子源
我们先来说说离子源。蛋白质谱所使用的ESI（Electrospray ionization）电喷雾离子化，对蛋白质组学来说是一个标志性的发明！因为是直接从液相进行离子化，使它与LC（液相色谱）的联用变得更加容易了，我们可以先用LC将非常复杂的肽段混合物进行预分离，减少每次分析物的复杂度，然后分离的肽段可以直接进入ESI，形成电离喷雾。
那么，ESI喷雾是怎么形成的呢？简单来说，分离柱前端有一个小开口，被分析物根据质量及电荷的不同，依次通过前端的小开口。小开口处加了电压，刚开始，静电力与表面张力相同，当加大静电力使它大于表面张力的时候，液膜破裂，形成无数带电的小液滴，就形成喷雾了。像现在比较新的nanoESI技术，LC的流速就更加慢，离子化的效果也更好。觉得以上描述还不够形象的童鞋，直接看图吧：
质量分析器
说完了离子源，接下来我们来说质量分析器，这是质谱仪里最重要的一部分。我们通常听到的各种质谱仪的名字，就是根据质量分析器的类型来命名的。我们样品中各组分在离子源中发生电离，并经加速电场的作用后，形成离子束，进入质量分析器中。质量分析器将带电离子根据其质荷比加以分离，记录各种离子的质量数和丰度，用于后续定性与定量的分析。
质量分析器有两个主要的技术参数：质量范围和分辨率。质量范围是指是所能测定的质荷比的范围，它决定了咱们能检测到的离子的范围。比如，ESI离子源能产生许多m/z大于3000的离子，如果你选的质量分析器的上限达不到3000，那么3000以上的离子你就检测不出来了。
然而，另一个更为重要的指标，就是质量分析器的分辨率！先上个公式描述：
分辨率=观测的一个质谱峰的质荷比/半峰高处的峰宽（FWHM）
啥意思呢？比如下图中最左边的那个峰，它的质荷比是1,，峰高一半的地方的峰宽值是，于是：
分辨率=1,
如果这么讲还是不太明白，那你可以简单理解为，质谱分辨率越高，我们将得到越尖越细的谱峰。你可能会问：谱峰又尖又细的好处是什么？这是个好问题！事实上，分辨率可以表征两个相邻的谱峰在质谱中被区分开的能力。大家通过下图感受一下不同分辨率的质谱仪能给我们多么不同的谱峰图。
图中以Glucagon（胰高血糖素）为例，展示了不同分辨率的质谱仪给出的谱峰。当分辨率是1000时，只能看一个很宽的峰（蓝色）；分辨率增加到3000时，峰窄一些（红色），但还感受不到明显的差别；当提高到10000时，很明显能看到，其实这里包含了8个峰（绿色）；再提高到30000的时候，半峰宽更窄，两个相邻的峰可以彻底地被分开（黑色）。显然，我们在分辨率为1000或3000，不能准确的检测被分析肽段的精确分子量， 从而导致谱图无法匹配或者发生错配。
不同的质量分析器有不同的分辨率，通常的顺序是：傅里叶变换质谱分辨率最高，但造价太贵；其次是Orbitrap（轨道阱系列），分辨率远远高于其它质谱；再次是TOF（时间飞行质谱）；然后是离子阱（Ion Trap）；最后是四级杆质谱（Quadrupole）。
这里我多说一句，分辨率高固然好，但价格肯定就贵，选择质谱仪的时候要根据咱们自己的研究目的以及预算范围啦！
二级质谱
然而，要对肽段进行鉴定，一级质谱显然是办不到的，我们没法根据肽段离子m/z的值就推断出这个肽段由哪些氨基酸残基组成（可能的组合非常多），以及序列顺序是怎么样的，对吧？所以，鉴定肽段还需要二级质谱。
什么是二级质谱呢？简单来说，肽段混合物通过一级质谱得到了一级谱图，然后从中选择一个肽段，通过一些方法，比如，与随性气体进行碰撞，把肽段碰碎，得到碎片离子，再形成二级谱图。我们通过观察碎片离子的质量分布来推断肽断的残基组成，最后再反推出蛋白质是什么。上个图，帮助大家理解一下二级质谱是怎么来的。
在上一段，我提到是从一级质谱中“选择”一个肽段进入二级质谱。这里看似讲得云淡风轻，事实上怎么选却是一个很关键的问题！通常选择的方法我们可以叫做“TOP”法（这是我自己起的名字），比如TOP15就是指从一级谱里选前15个高度的峰，每一次分离一个肽段，然后对这个肽段进行扫描，得到二级谱图。
大家发现了没有？如果一个肽段在一级谱图中没有进入TOP15，那它连打二级谱图的资格都没有！原来质谱的世界竞争也是如何残酷！二级质谱能扫描哪些肽段是由一级质谱决定的，所以我们将这种方法称为“数据依赖性采集（DDA, data dependent acquisition）！
明白了吧，DDA这个名字就是这么来的！下次大伙儿再听到有人说DDA，心里不会再一百个问号飞过了吧？
咱们细想一下就不难发现，如果一个蛋白的浓度不够高，也就是说，它的肽段在一级谱图中很难成为那些TOPs，那么它能进入二级质谱的可能性基本上没有。这就是为什么低峰度蛋白很难被鉴定到！这也就是为什么我们在做比如血液这种样品的时候，一定要去除血红蛋白等高峰度蛋白（如果你想鉴定的蛋白不是血红蛋白的话）！
很显然，DDA方法的局限性就摆在那里！这叫想要研究低峰度蛋白的科学家们怎么忍？于是，一种叫做数据非依赖性采集（DIA）的新方法就应运而生了！关于这种方法的原理，下一篇推文会详扒。
我们再通过以下这个图来感受一下一级谱图与二级谱图之间的关系：
比如，第一个时间点，我们先进行MS1扫描，然后选一个峰高的肽段进行MS2扫描，依次类推。在一些扫描速度比较快的质谱仪里，一个MS1谱图可以进行80张MS2的扫描。
鉴定碎片离子
好，我们搞清楚了二级质谱是怎么来的，那么我们怎么根据检测到的离子信息来推测这是什么氨基酸呢？可能你会说，这还不简单么？根据分子量呀！
没错，不同的氨基酸，它的分子量不就是一个简单的值吗？然而，这件事却并没有这么简单，因为这个世界上还存在一个神奇的东西，它的名字叫同位素！
比如说碳元素，最常见的是原子量12的这种，我们叫C12，然而它还有一个同样很稳定的好基友，C13（多一个中子）。于是，我们得考虑到这两种稳定同位素的含量（百度百科说C13占 ，C12占），对于一个氨基酸而言，我们就会得到两个不同的分子量：
为啥说平均呢？因为当肽段分子量越大，含有各种同位素的可能性及不同组合就越多，我们如果把每一种组合都算一遍分子量，这样会得到一个长长的list，到时候做谱图匹配时用哪一个值呢？也没谱。所以干脆用一个平均值来表示。
我们通过下表来感受一下各种不同的氨基酸残基的单同位素分子量与平均分子量有多大的区别：
可能你又会问，这两个不同的分子量分别在什么情况下用呢？这里又要说到分辨率了，如果咱们用的是高分辨率质谱仪，不同的同位素峰会被明显地分开，也就是说，谱图里我们能看几个同位素峰，这时我们就可以使用单同位素分子量，可以与相应的单同位素峰准确对应。但在低分辨率质谱仪里，这些峰很可能混在一起，看上去只是一个峰，这种情况下，也没办法，只能用平均分子量去近似一下了。
下面这个图可以很形象地展示出，单同位素分子量与平均分子量在质谱图上差别有多大。在高分辨质谱看来，这完全就是两种不同的离子了。上面我们也说了，根据平均分子量来计算，结果并不准确，但用单同位素分子量来计算，就可以准确对应了。
除了同位素，还有一个因素我们也需要考虑，那就是肽段碎裂进入二级质谱时，可能会形成三种不同的离子类型，这就是我们通常所说的by离子，ax离子和cz离子。
之所以会形成不同的离子对，是因为不同的碎裂方法，造成肽段断裂的位置不同。大伙儿看看上面这个图就明白了。当我们使用CID（碰撞诱导解离）或HCD（High-energy C-trap Dissociation）碎裂时，与惰性气体碰撞的是C-N键这里，C端生成y离子，N端生成b离子，这是二级质谱产生的最常见的离子对了。当我们使用ETD（电子转移解离）碎裂时，因为有一个电子反应的过程，在加上电子后才产生的碎裂，它的断裂位置可能出现在N-C键这里，形成cz离子，而TOF类仪器可能会产生ax离子。
离子类型的信息需要传递给后续的搜库步骤（通常我们在搜库软件中指定了仪器类型，软件就会自动匹配离子类型），计算机需要模拟最可能的碎裂位置，生成对应的理论谱图，然后拿来与实际谱图比对。我们以by离子为例，来看看对一个肽段来说，它可能碎裂成哪些碎片离子：
那么它可能会生成如下这样的谱图：
从谱图上看，这个肽段所有的by离子都检测到了。通常来说，对于丰度不错，长短合适的肽段，在高精度质谱仪上被完整捕获到的情况是很常见的。通常情况下50%-80%的by离子都能被捕获到。
下篇继续讲定性检测里的搜库工具、结果评估，以及定量检测的各种背景知识。
字数可能有点超,你自己截取吧~~ 分子生物学(molecular biology) 在分子水平上研究生命现象的科学。研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结 构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程如光合作用、发育的分子机制、神经活动的机理、癌的发生等。 从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。自20世纪50年代以来，分子生物学是生物学的前沿与生长点，其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系 (中心是分子遗传学)和蛋白质-脂质体系（即生物膜）。 生物大分子，特别是蛋白质和核酸结构功能的研究，是分子生物学的基础。现代化学和物理学理论、技术和方法的应用推动了生物大分子结构功能的研究，从而出现了近30年来分子生物学的蓬勃发展。分子生物学和生物化学及生物物理学关系十分密切，它们之间的主要区别在于：①生物化学和生物物理学是用化学的和物理学的方法研究在分子水平，细胞水平，整体水平乃至群体水平等不同层次上的生物学问题。而分子生物学则着重在分子（包括多分子体系）水平上研究生命活动的普遍规律；②在分子水平上，分子生物学着重研究的是大分子，主要是蛋白质，核酸，脂质体系以及部分多糖及其复合体系。而一些小分子物质在生物体内的转化则属生物化学的范围；③分子生物学研究的主要目的是在分子水平上阐明整个生物界所共同具有的基本特征，即生命现象的本质；而研究某一特定生物体或某一种生物体内的某一特定器官的物理、化学现象或变化，则属于生物物理学或生物化学的范畴。 发展简史 结构分析和遗传物质的研究在分子生物学的发展中作出了重要的贡献。结构分析的中心内容是通过阐明生物分子的三维结构来解释细胞的生理功能。1912年英国 .布喇格和.布喇格建立了X射线晶体学，成功地测定了一些相当复杂的分子以及蛋白质的结构。以后布喇格的学生.阿斯特伯里和.贝尔纳又分别对毛发、肌肉等纤维蛋白以及胃蛋白酶、烟草花叶病毒等进行了初步的结构分析。他们的工作为后来生物大分子结晶学的形成和发展奠定了基础。50年代是分子生物学作为一门独立的分支学科脱颖而出并迅速发展的年代。首先是在蛋白质结构分析方面，1951年.波林等提出了 α-螺旋结构，描述了蛋白质分子中肽链的一种构象。1955年F.桑格完成了胰岛素的氨基酸序列的测定。接着 .肯德鲁和.佩鲁茨在X射线分析中应用重原子同晶置换技术和计算机技术分别于1957和1959年阐明了鲸肌红蛋白和马血红蛋白的立体结构。1965年中国科学家合成了有生物活性的胰岛素，首先实现了蛋白质的人工合成。 另一方面，M.德尔布吕克小组从1938年起选择噬菌体为对象开始探索基因之谜。噬菌体感染寄主后半小时内就复制出几百个同样的子代噬菌体颗粒，因此是研究生物体自我复制的理想材料。1940年.比德尔和.塔特姆提出了“一个基因，一个酶”的假设，即基因的功能在于决定酶的结构，且一个基因仅决定一个酶的结构。但在当时基因的本质并不清楚。1944年.埃弗里等研究细菌中的转化现象，证明了DNA是遗传物质。1953年.沃森和.克里克提出了DNA的双螺旋结构，开创了分子生物学的新纪元。在此基础上提出的中心法则，描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动。遗传密码的阐明则揭示了生物体内遗传信息的贮存方式。1961年F.雅各布和J.莫诺提出了操纵子的概念，解释了原核基因表达的调控。到20世纪60年代中期，关于DNA自我复制和转录生成RNA的一般性质已基本清楚，基因的奥秘也随之而开始解开了。 仅仅30年左右的时间，分子生物学经历了从大胆的科学假说，到经过大量的实验研究，从而建立了本学科的理论基础。进入70年代，由于重组DNA研究的突破，基因工程已经在实际应用中开花结果，根据人的意愿改造蛋白质结构的蛋白质工程也已经成为现实。 基本内容 蛋白质体系 蛋白质的结构单位是α-氨基酸。常见的氨基酸共20种。它们以不同的顺序排列可以为生命世界提供天文数字的各种各样的蛋白质。 蛋白质分子结构的组织形式可分为 4个主要的层次。一级结构，也叫化学结构，是分子中氨基酸的排列顺序。首尾相连的氨基酸通过氨基与羧基的缩合形成链状结构，称为肽链。肽链主链原子的局部空间排列为二级结构。二级结构在空间的各种盘绕和卷曲为三级结构。有些蛋白质分子是由相同的或不同的亚单位组装成的，亚单位间的相互关系叫四级结构。 蛋白质的特殊性质和生理功能与其分子的特定结构有着密切的关系，这是形形色色的蛋白质所以能表现出丰富多彩的生命活动的分子基础。研究蛋白质的结构与功能的关系是分子生物学研究的一个重要内容。 随着结构分析技术的发展，现在已有几千个蛋白质的化学结构和几百个蛋白质的立体结构得到了阐明。70年代末以来，采用测定互补DNA顺序反推蛋白质化学结构的方法，不仅提高了分析效率，而且使一些氨基酸序列分析条件不易得到满足的蛋白质化学结构分析得以实现。 发现和鉴定具有新功能的蛋白质，仍是蛋白质研究的内容。例如与基因调控和高级神经活动有关的蛋白质的研究现在很受重视。 蛋白质－核酸体系 生物体的遗传特征主要由核酸决定。绝大多数生物的基因都由 DNA构成。简单的病毒，如λ噬菌体的基因组是由 46000个核苷酸按一定顺序组成的一条双股DNA（由于是双股DNA，通常以碱基对计算其长度）。细菌，如大肠杆菌的基因组，含4×106碱基对。人体细胞染色体上所含DNA为3×109碱基对。 遗传信息要在子代的生命活动中表现出来，需要通过复制、转录和转译。复制是以亲代 DNA为模板合成子代 DNA分子。转录是根据DNA的核苷酸序列决定一类RNA分子中的核苷酸序列；后者又进一步决定蛋白质分子中氨基酸的序列，就是转译。因为这一类RNA起着信息传递作用，故称信使核糖核酸(mRNA)。由于构成RNA的核苷酸是4种，而蛋白质中却有20种氨基酸，它们的对应关系是由mRNA分子中以一定顺序相连的 3个核苷酸来决定一种氨基酸，这就是三联体遗传密码。 基因在表达其性状的过程中贯串着核酸与核酸、核酸与蛋白质的相互作用。DNA复制时，双股螺旋在解旋酶的作用下被拆开，然后DNA聚合酶以亲代DNA链为模板，复制出子代 DNA链。转录是在 RNA聚合酶的催化下完成的。转译的场所核糖核蛋白体是核酸和蛋白质的复合体，根据mRNA的编码，在酶的催化下，把氨基酸连接成完整的肽链。基因表达的调节控制也是通过生物大分子的相互作用而实现的。如大肠杆菌乳糖操纵子上的操纵基因通过与阻遏蛋白的相互作用控制基因的开关。真核细胞染色质所含的非组蛋白在转录的调控中具有特殊作用。正常情况下，真核细胞中仅2～15％基因被表达。这种选择性的转录与转译是细胞分化的基础。 蛋白质－脂质体系 生物体内普遍存在的膜结构，统称为生物膜。它包括细胞外周膜和细胞内具有各种特定功能的细胞器膜。从化学组成看，生物膜是由脂质和蛋白质通过非共价键构成的体系。很多膜还含少量糖类，以糖蛋白或糖脂形式存在。 1972年提出的流动镶嵌模型概括了生物膜的基本特征：其基本骨架是脂双层结构。膜蛋白分为表在蛋白质和嵌入蛋白质。膜脂和膜蛋白均处于不停的运动状态。 生物膜在结构与功能上都具有两侧不对称性。以物质传送为例，某些物质能以很高速度通过膜，另一些则不能。象海带能从海水中把碘浓缩 3万倍。生物膜的选择性通透使细胞内pH和离子组成相对稳定，保持了产生神经、肌肉兴奋所必需的离子梯度，保证了细胞浓缩营养物和排除废物的功能。 生物体的能量转换主要在膜上进行。生物体取得能量的方式，或是像植物那样利用太阳能在叶绿体膜上进行光合磷酸化反应；或是像动物那样利用食物在线粒体膜上进行氧化磷酸化反应。这二者能量来源虽不同，但基本过程非常相似，最后都合成腺苷三磷酸。对于这两种能量转换的机制，P.米切尔提出的化学渗透学说得到了越来越多的证据。生物体利用食物氧化所释放能量的效率可达70％左右，而从煤或石油的燃烧获取能量的效率通常为20～40％，所以生物力能学的研究很受重视。对生物膜能量转换的深入了解和模拟将会对人类更有效地利用能量作出贡献。 生物膜的另一重要功能是细胞间或细胞膜内外的信息传递。在细胞表面，广泛地存在着一类称为受体的蛋白质。激素和药物的作用都需通过与受体分子的特异性结合而实现。癌变细胞表面受体物质的分布有明显变化。细胞膜的表面性质还对细胞分裂繁殖有重要的调节作用。 对细胞表面性质的研究带动了糖类的研究。糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂等生物大分子结构与功能的研究越来越受到重视。从发展趋势看，寡糖与蛋白质或脂质形成的体系将成为分子生物学研究的一个新的重要的领域。 理论意义和应用 分子生物学的成就说明：生命活动的根本规律在形形色色的生物体中都是统一的。例如，不论在何种生物体中，都由同样的氨基酸和核苷酸分别组成其蛋白质和核酸。遗传物质，除某些病毒外，都是DNA，并且在所有的细胞中都以同样的生化机制进行复制。分子遗传学的中心法则和遗传密码，除个别例外，在绝大多数情况下也都是通用的。 物理学的成就证明，一切物质的原子都由为数不多的基本粒子根据相同的规律所组成，说明了物质世界结构上的高度一致，揭示了物质世界的本质，从而带动了整个物理学科的发展。分子生物学则在分子水平上揭示了生命世界的基本结构和生命活动的根本规律的高度一致，揭示了生命现象的本质。和过去基本粒子的研究带动物理学的发展一样，分子生物学的概念和观点也已经渗入到基础和应用生物学的每一个分支领域，带动了整个生物学的发展，使之提高到一个崭新的水平。 过去生物进化的研究，主要依靠对不同种属间形态和解剖方面的比较来决定亲缘关系。随着蛋白质和核酸结构测定方法的进展，比较不同种属的蛋白质或核酸的化学结构，即可根据差异的程度，来断定它们的亲缘关系。由此得出的系统进化树，与用经典方法得到的是基本符合的。采用分子生物学的方法研究分类与进化有特别的优越性。首先，构成生物体的基本生物大分子的结构反映了生命活动中更为本质的方面。其次，根据结构上的差异程度可以对亲缘关系给出一个定量的，因而也是更准确的概念。第三，对于形态结构非常简单的微生物的进化，则只有用这种方法才能得到可靠结果。 高等动物的高级神经活动是极其复杂的生命现象，过去多是在细胞乃至整体水平上研究，近年来深入到分子水平研究的结果充分说明高级神经活动也同样是以生物大分子的活动为基础的。例如，在高等动物学习与记忆的过程中，大脑中RNA和蛋白质的组成发生明显的变化，并且一些影响生物体合成蛋白质的药物也显著地影响学习与记忆的能力。又如，“生物钟”是一种熟知的生物现象。用鸡进行的实验发现，有一种重要的神经传递介质（5-羟色胺）和一种激素（褪黑激素）以及控制它们变化的一种酶，在鸡脑中的含量呈24小时的周期性变化。正是这种变化构成了鸡的“生物钟”的物质基础。 在应用方面，生物膜能量转换原理的阐明，将有助于解决全球性的能源问题。了解酶的催化原理就能更有针对性地进行酶的人工模拟，设计出化学工业上广泛使用的新催化剂，从而给化学工业带来一场革命。 分子生物学在生物工程技术中也起了巨大的作用，1973年重组DNA技术的成功，为基因工程的发展铺平了道路。80年代以来，已经采用基因工程技术，把高等动物的一些基因引入单细胞生物，用发酵方法生产干扰素、多种多肽激素和疫苗等。基因工程的进一步发展将为定向培育动、植物和微生物良种以及有效地控制和治疗一些人类遗传性疾病提供根本性的解决途径。 从基因调控的角度研究细胞癌变也已经取得不少进展。分子生物学将为人类最终征服癌症做出重要的贡献。 [编辑本段]分子生物学的应用 1，亲子鉴定 近几年来，人类基因组研究的进展日新月异，而分子生物学技术也不断完善，随着基因组研究向各学科的不断渗透，这些学科的进展达到了前所未有的高度。在法医学上，STR位点和单核苷酸（SNP）位点检测分别是第二代、第三代DNA分析技术的核心，是继RFLPs（限制性片段长度多态性）VNTRs（可变数量串联重复序列多态性）研究而发展起来的检测技术。作为最前沿的刑事生物技术，DNA分析为法医物证检验提供了科学、可靠和快捷的手段，使物证鉴定从个体排除过渡到了可以作同一认定的水平，DNA检验能直接认定犯罪、为凶杀案、强奸杀人案、碎尸案、强奸致孕案等重大疑难案件的侦破提供准确可靠的依据。随着DNA技术的发展和应用，DNA标志系统的检测将成为破案的重要手段和途径。此方法作为亲子鉴定已经是非常成熟的，也是国际上公认的最好的一种方法。参考资料：蛋白质质谱分析研究进展 摘 要： 随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用，并对其发展前景作出展望。 关键词： 蛋白质，质谱分析，应用 前言： 蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上， 作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。 自约翰.芬恩()和田中耕一()发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。 1．质谱分析的特点 质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。 2．质谱分析的方法 近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。 3．蛋白质的质谱分析 蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。 蛋白质的质谱分析原理 以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。 蛋白质和肽的序列分析 现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrospray ionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI TOF MS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一 [5] 。目前在欧洲分子生物实验室(EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDI TOF MS蛋白质一级结构(序列)谱库，能为解析FAST谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据[6]。 蛋白质质谱分析研究进展 来自: 免费论文网 蛋白质的质谱分析方式 质谱用于肽和蛋白质的序列测定主要可以分为三种方法：一种方法叫蛋白图谱(proteinmapping)，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂.第三种方法与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序(laddersequencing)，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。 蛋白消化 蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的赖氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。 基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(MALDI-TOF MS) [7] 简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比(mass/charge，m/z)来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质(matrix)混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中，样品然后置于激光离子发生器(lasersource)。激光作用于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪(TOFmassanalyzer)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。而此飞行时间同多肽离子的质量/电荷的比值成反比，即质量/电荷之比越高，飞行时间越短。最后，由电脑软件将探测器录得的多肽质量/电荷比值同数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽的质量/电荷比值进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白.此法称为多肽质量指纹分析(peptidemassfin-gerprinting)。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法操作简便，敏感度高，同许多蛋白分离方法相匹配，而且，现有数据库中有充足的关于多肽质量/电荷比值的数据，因此成为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法。 电子喷雾电离质谱测量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)[8 ] 同基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法在固态下完成不同，电子喷雾电离质谱测量法是在液态下完成，而且多肽离子带有多个电荷，由高效液相层析等方法分离的液体多肽混合物，在高压下经过一细针孔。当样本由针孔射出时，喷射成雾状的细小液滴，这些细小液滴包含多肽离子及水份等其他杂质成分。去除这些杂质成分后，多肽离子进入连续质量分析仪(tan- demmassanalyzer)，连续质量分析仪选取某一特定质量/电荷比值的多肽离子，并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离或非电离片段。随后，依质量/电荷比值对电离片段进行分析并汇集成离子谱(ionspectrum)，通过数据库检索，由这些离子谱得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋白鉴定较依据多肽质量指纹进行的蛋白鉴定更准确、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通过蛋白氨基酸序列数据库检索，也可通过核糖核酸数据库检索来进行蛋白鉴定。 蛋白质质谱分析研究进展 来自: 免费论文网 4．蛋白质质谱分析的应用 1981年首先采用FAB双聚焦质谱测定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，质谱中出现准分子离子[M+1]+=1319强峰。分子量小于6kDa肽或小蛋白质合适用FAB质谱分析，更大分子量的多肽和蛋自质可用MALDI质谱或ESI质谱分析。用MALDI-TOF质谱分析蛋自质最早一例是Hillen Kramp等[9]于1988年提出用紫外激光以烟酸为基质在TOF谱仪上测出质量数高达60kDa蛋白质，精确度开始只有，后改进到。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质量，也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究[10,11],三条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。近年来，串联质谱分析仪发展迅猛，其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高，大规模数据库和一些分析软件(如:SEQUEST)的应用使得串联质谱分析仪可以进行更大规模的测序工作。目前，利用2D电泳及MS技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析，已经鉴定出1484种蛋白质，包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质[12]；分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分[13]，并利用质谱进行鉴定磷酸化蛋白研究工作[14]及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白(SDNP)的分子结构[15]等。 结束语： 在蛋白质的质谱分析中，质谱的准确性(accuracy)对测定结果有很大影响，因此质谱测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点，这些都非常适合于现在科学研究的需要。我们相信，随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进，蛋白双向电泳的应用[16]以及质谱技术的不断完善，质谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一。
笨蛋，自己写嘛！！！！！！
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【关键词】 蛋白质组 【关键词】 线粒体；蛋白质组 0引言 线粒体拥有自己的DNA（mtDNA），可以进行转录、翻译和蛋白质合成. 根据人类的基因图谱，估计大约有1000~2000种线粒体蛋白，大约有600多种已经被鉴定出来. 线粒体蛋白质只有2%是线粒体自己合成的，98%的线粒体蛋白质是由细胞核编码、细胞质核糖体合成后运往线粒体的，线粒体是真核细胞非常重要的细胞器，在细胞的整个生命活动中起着非常关键的作用. 线粒体的蛋白质参与机体许多生理、病理过程，如ATP的合成、脂肪酸代谢、三羧酸循环、电子传递和氧化磷酸化过程. 线粒体蛋白质结构与功能的改变与人类许多疾病相关，如退行性疾病、心脏病、衰老和癌症. 尤其是在神经退行性疾病方面，线粒体蛋白质的研究日益受到关注. 蛋白质组研究技术的产生与发展为线粒体蛋白质组的研究提供了有力的支持，使得从整体上研究线粒体蛋白质组在生理、病理过程中的变化成为可能. 1线粒体的结构、功能与人类疾病 线粒体一般呈粒状或杆状，也可呈环形、哑铃形或其他形状，其主要化学成分是蛋白质和脂类. 线粒体由内外两层膜封闭，包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个部分. 线粒体在细胞内的分布一般是不均匀的，根据细胞代谢的需要，线粒体可在细胞质中运动、变形和分裂增殖. 线粒体是细胞进行呼吸的主要场所，在细胞代谢旺盛的需能部位比较集中，其主要功能是进行氧化磷酸化，合成ATP，为细胞生命活动提供直接能量. 催化三羧酸循环、氨基酸代谢、脂肪酸分解、电子传递、能量转换、DNA复制和RNA合成等过程所需要的一百多种酶和辅酶都分布在线粒体中. 这些酶和辅酶的主要功能是参加三羧酸循环中的氧化反应、电子传递和能量转换. 线粒体具有独立的遗传体系，能够进行DNA复制、转录和蛋白质翻译. 线粒体不仅为细胞提供能量，而且还与细胞中氧自由基的生成、细胞凋亡、细胞的信号转导、细胞内离子的跨膜转运及电解质稳态平衡的调控等有关. 许多实验证实，线粒体功能改变与细胞凋亡〔1〕、衰老〔2〕、肿瘤〔3，4〕的发生密切相关；另外，有许多人类疾病的发生与线粒体功能缺陷相关，如线粒体肌病和脑肌病、线粒体眼病，老年性痴呆、帕金森病、2型糖尿病、心肌病及衰老等，有人统称为线粒体疾病〔5〕. 2线粒体蛋白质组学研究现状 线粒体蛋白质组的蛋白质鉴定Rabilloud等〔6〕在1998年，以健康人的胎盘作为组织来源，分离提取线粒体进行蛋白质组研究，试图建立线粒体蛋白质组的数据库，为研究遗传性或获得性线粒体功能障碍时线粒体蛋白质的变化提供依据. 他们使用IPG（pH ）双相电泳技术, 共获得1500个蛋白点. 通过MALDITOFMS和PMF等技术鉴定其中的一些蛋白点，鉴于当时基因组信息的局限性，只有46种蛋白被鉴定出来. 随着人类基因组图谱的完成，应该有更多的蛋白点被鉴定出来. Fountoulakis等〔7〕从大鼠的肝脏中分离线粒体，并分别利用宽范围和窄范围pH梯度IPG对线粒体蛋白质进行双相电泳，通过MALDIMS鉴定出192个基因产物，大约70%的基因产物是具有广谱催化能力的酶，其中8个基因产物首次被检测到并且由一个点构成，而大多数蛋白质都是由多个点构成，平均10~15个点对应于一个基因产物. Mootha等〔8〕从小鼠大脑、心脏、肾脏、肝脏中分离提取线粒体蛋白质，进行线粒体蛋白质组研究，他们参照已有的基因信息共鉴定出591个线粒体蛋白质，其中新发现了163个蛋白质与线粒体有关. 这些蛋白质的表达与RNA丰度的检测在很大程度上是一致的. 不同组织的RNA表达图谱揭示出线粒体基因在功能、调节机制方面形成的网络. 对这些蛋白与基因的整合分析使人们对哺乳动物生物起源的认识更加深入，对理解人类疾病也具有参考价值. 线粒体亚组分的研究线粒体对维持细胞的体内平衡起着关键作用，因此加速了人们对线粒体亚组分的研究. 线粒体内膜不仅包含有呼吸链复合物，它还包含多种离子通道和转运蛋白. 对线粒体发挥正常的功能起着重要作用. Cruz等〔9〕专注于线粒体内膜蛋白质的研究，他们通过二维液相色谱串联质谱技术鉴定出182个蛋白质，pI（），MW（Mr 6000~527 000），这些蛋白与许多生化过程相关，比如电子传递、蛋白质运输、蛋白质合成、脂类代谢和离子运输. 线粒体蛋白质复合物的研究线粒体内膜上嵌有很多蛋白质复合物，对于线粒体的功能具有重要作用，应用常规的双相电泳很难将这些蛋白质复合物完整地分离出来. Devreese等〔10〕采用Bluenative polyacrylamide gel electrophoresis（BNPAGE）分离线粒体内膜上的五个氧化磷酸化复合物，结合肽质量指纹图谱，成功地鉴定出氧化磷酸化复合物中60%的已知蛋白质. BNPAGE在分离蛋白质复合物时可以保持它们的完整性，因此这项技术可以用于研究在不同的生理病理状态下蛋白质复合物的变化及临床诊断等. 线粒体蛋白质组数据库目前人们查询最多的线粒体蛋白质组数据库有MITOP, MitoP2和SWISSPROT三种. MITOP〔11〕是有关线粒体、核编码的基因和相应的线粒体蛋白质的综合性数据库，收录了1150种线粒体相关的基因和对应的蛋白质，人们可依据基因、蛋白质、同源性、通道与代谢、人类疾病分类查询相关的信息.MitoP2〔12〕数据库中主要为核编码的线粒体蛋白质组的数据，MitoP2数据库将不同来源的线粒体蛋白质的信息整合在一起，人们可以根据不同的参数进行查询. MitoP2数据库既包括最新的数据也包括最初的MITOP〔11〕数据库中的数据. 目前数据库中主要为酵母和人的线粒体蛋白质组的数据，以后还将收录小鼠、线虫等的数据. 数据库旨在为人们提供线粒体蛋白质的综合性数据. SWISSPROT数据库包含269种人类线粒体蛋白质，其中与人类疾病相关的蛋白质有225种. 数据库中有相当一部分蛋白质没有明确的定位和功能信息的描述. 随着线粒体研究热潮到来和蛋白质组学技术的发展，将有更多的数据被填充到数据库中. 3线粒体蛋白质组研究中存在的问题 线粒体碱性蛋白质与低分子量蛋白质线粒体蛋白质中，具有碱性等电点的蛋白质占有很大比例，在等电聚焦时难以溶解，一些碱性程度很大的蛋白质如细胞色素C（pH ）在pH 3~10的IPG胶上不能被分离出. 线粒体蛋白质中相当一部分蛋白是低分子量蛋白，因此在SDSPAGE电泳时要分别应用高浓度和低浓度分离胶，以更好地分离低分子量蛋白质和高分子量蛋白质. 线粒体膜蛋白质线粒体是一个具有双层膜结构的细胞器，内膜和外膜上整和有很多膜蛋白质，这些膜蛋白质对于线粒体功能的发挥具有重要作用，但是膜蛋白质具有很强的疏水性，在等电聚焦时，用常规的水化液难以溶解，因此用常规的IPG胶检测不出来. 换用不同的裂解液对膜蛋白的溶解具有帮助. 有研究人员在等电聚焦缓冲液中加入SB310以增加膜蛋白的溶解性. 在等电聚焦前对样品进行有机酸处理也可以增加膜蛋白的溶解性. 在研究中人们发现,不同的样品应该选用不同的裂解液，没有一种裂解液能够适合于所有的膜蛋白质.百事通针对膜蛋白质的难溶和等电聚焦时的沉淀，一些研究人员另辟径，避开双相电泳而进行一维SDSPAGE电泳，如Taylor等〔13〕先通过蔗糖梯度离心将线粒体蛋白质分成不同的组分，而后将每一个组分进行一维电泳，一维电泳中SDS可以很好地溶解疏水性蛋白质和膜整合蛋白质，他们鉴定出600多种线粒体蛋白质，其中有很多蛋白质以前应用双相电泳没有被鉴定出来. 他们鉴定的蛋白质中有很多具有跨膜结构域，如adenine nucleotide translocator（ANT1）和VDACs蛋白质，这些蛋白质对于调节线粒体的功能具有关键作用而且应用常规双相电泳很难被鉴定出来. 提高质谱鉴定的灵敏性对于一维SDSPAGE电泳后蛋白质分析鉴定具有很大的帮助，Pflieger等〔14〕应用液相色谱串联质谱（LCMS/MS）成功地鉴定出179种线粒体蛋白质，其中43%是膜蛋白质而且23%具有跨膜结构域. 液相色谱串联质谱（LCMS/MS）检测灵敏度较高，SDS可以很好地溶解膜蛋白，因此这种方法比传统的双相电泳具有更高的灵敏性而且不受蛋白质等电点、分子量、疏水性的限制. 线粒体样品的纯度线粒体样品的纯度对于蛋白质组分析非常重要，在样品制备的过程中，具有与线粒体相同沉降系数的成分会同线粒体一起沉降下来，如内质网、微粒体、胞浆蛋白的一些成分. 这些蛋白斑点出现在双相电泳胶上，会影响整体蛋白质组分析的结果. 因此提高样品的纯度至关重要. Scheffler等〔15〕采用多步percoll/metrizamide密度梯度离心纯化线粒体样品，双相电泳后鉴定出61个蛋白质，几乎全部是线粒体蛋白质. 4未来展望 随着人类基因组工作草图的完成，生命科学的研究进入后基因组时代，蛋白质组学的研究遂成为重点. 蛋白质组学旨在采用全方位、高通量的技术路线，确认生物体全部蛋白质的表达和功能模式，从一个机体、一个器官组织或一个细胞的蛋白质整体活动来揭示生命规律，并研究疾病的发生机制、建立疾病的早期诊断和防治方法. 抗体技术在线粒体蛋白质组学领域中具有重要的应用价值. 单克隆抗体还具有高度的特异性，应用于亲和层析技术中不仅可以去除组织细胞样品中高表达的蛋白质成分，同样也可以富集表达量极低的组分. 结合蛋白免疫转印、流式细胞术和免疫组织细胞化学，实现对相应蛋白质的定性、定量和细胞（内）定位分析. 与微阵列技术（芯片）结合，可以研制出含有成百上千种抗体的蛋白(抗体)芯片，这种新技术使得研究人员可以在一次实验中比较生物样品中成百上千的蛋白质的相对丰度，能够检测到样品中浓度很低的抗原，以实现蛋白质组学对复杂组分高通量、高效率的检测. 某些抗体可以特异性识别蛋白质翻译后修饰的糖基化或磷酸化位点、降解产物、功能状态和构象变化，成为基因芯片检测不可替代的补充. 抗体捕获组分的分析有助于蛋白质复合物及其相互作用的研究，也在新的蛋白质发现和确认方面提供重要信息和证据. 随着抗体技术的不断提高，抗体数目的不断增多，蛋白质组学的研究也将更加深入. 线粒体不仅参与细胞重要的生命活动，而且对于生物进化的研究也有重要意义. 随着线粒体研究热潮的到来，将有更多的蛋白质被发现，对于蛋白质功能的研究也将更加深入，相信线粒体蛋白质组的研究对于人类疾病的发病机制和早期诊断将做出重要贡献. 【参考文献】 〔1〕 Jiang X, Wang X. Cytochrome Cmediated apoptosis 〔J〕. Annu Rev Biochem, 2004,73: 87-106. 〔2〕 Chen XJ, Wang X, Kaufman BA, et al. Aconitase couples metabolic regulation to mitochondrial DNA maintenance 〔J〕. Science, 2005,307(5710): 714-717. 〔3〕 Petros JA, Baumann AK, RuizPesini E, et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer 〔J〕. PNAS, 2005,102(3):719-724. 〔4〕 Wonsey DR, Zeller KI, Dang CV. The cMyc target gene PRDX3 is required for mitochondrial homeostasis and neoplastic transformation 〔J〕. PNAS, 2002, 99(10): 6649-6654. 〔5〕 Taylor RW, Turnbull DM. Mitochondrial DNA mutations in human disease〔J〕. Nat Rev Genet, 2005,6:389-402. 〔6〕 Rabilloud T, Kieffer S, Procaccio V, et al. Twodimensional electrophoresis of human placental mitochondria and protein identification by mass spectrometry: toward a human mitochondrial proteome 〔J〕. Electrophoresis, 1998,19:1006-1014. 〔7〕 Fountoulakis M, Berndt P, Langen H, et al. The rat liver mitochondrial proteins〔J〕. Electrophoresis, 2002,23:311-328. 〔8〕 Mootha VK, Bunkenborg J, Olsen JV, et al. Integrated analysis of protein composition, tissue diversity, and gene regulation in mouse mitochondria 〔J〕. Cell, 2003,115(5): 629-640. 〔9〕 Cruz SD, Xenarios I, Langridge J, et al. Proteomic analysis of the mouse liver mitochondrial inner membrane 〔J〕. J Biol Chem, 2003, 278(42): 41566-41571. 〔10〕 Devreese B, Vanrobaeys F, Smet J, et al. Mass spectrometric identification of mitochondrial oxidative phosphorylation subunits separated by twodimensional bluenative polyacrylamide gel electrophoresis 〔J〕. Electrophoresis, 2002,23: 2525-2533. 〔11〕 Scharfe C, Zaccaria P, Hoertnagel K, et al. MITOP, the mitochondrial proteome database: 2000 update 〔J〕. Nuc Acid Res, 2000,28(1):155-158. 〔12〕 Andreoli C, Prokisch H, Hortnagel K, et al. MitoP2, an integrated database on mitochondrial proteins in yeast and man 〔J〕. Nuc Acid Res, 2004,32(90001):459-462. 〔13〕 Taylor SW, Warnock DE, Glenn GM, et al. An alternative strategy to determine the mitochondrial proteome using sucrose gradient fractionation and 1D PAGE on highly purified human heart mitochondria 〔J〕. 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期刊：Cell；影响因子： 发表单位：休斯敦贝勒医学院 肿瘤与正常组织之间的蛋白质组差异对于癌症生物标志物的发现至关重要，但尚未在大型结肠癌肿瘤队列中进行系统表征。在这篇《Cell》文章中，报道了110例结肠癌患者的遗传、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的综合信息。通过比较分析和多组学数据的整合，发现了许多新的生物标志物和药物靶标，以推进精确治疗。 这篇文章为我们展现了多维组学服务于临床治疗的巨大潜力，并强调系统整合多组学分析能够揭示仅通过基因组评估无法获得的潜在临床价值。特别是，蛋白质组学能够发现基因组学不能发现的治疗靶点和致病机制，是需要临床疾病研究重要的前进方向。 对前瞻性收集的结肠癌队列进行了首次蛋白质组学研究。对配对的肿瘤和正常相邻组织进行的蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析比较，得出了与结肠癌相关的蛋白质和磷酸位点，包括已知和推定的新生物标记、药物靶标以及癌症/睾丸抗原。蛋白质组整合不仅将基因组推断的靶标（例如拷贝数驱动器和突变衍生的新抗原）确定为优先事项，而且还产生了新发现。磷酸蛋白质组学数据将Rb磷酸化与结肠癌的增殖增加和凋亡减少相关联，这解释了为什么这种经典的抑癌基因在结肠肿瘤中被扩增，并为在结肠癌中靶向Rb磷酸化提供了理论依据。蛋白质组学确定了在高度微卫星不稳定性（MSI-H）肿瘤中CD8 T细胞浸润减少和糖酵解增加之间的关联，这表明糖酵解是克服MSI-H肿瘤对免疫检查点封锁抵抗的潜在目标。蛋白质组学为生物学发现和治疗发展提供了新途径。 结肠癌相关蛋白和磷酸化位点的系统鉴定； 蛋白质组学支持的新抗原和78％的肿瘤中的癌症/睾丸抗原； Rb磷酸化是结肠癌的致癌驱动力和可能的靶标； 糖酵解抑制可能使MSI肿瘤对检查点封锁更敏感。 第一部分是样本整体概述。收集了110例结肠癌患者的肿瘤标本、配对的正常相邻组织（NAT）和血液样本，进行了全外显子测序、拷贝数阵列、RNA-Seq、miRNA-Seq、蛋白质组学和磷酸蛋白组学分析。与TCGA队列结肠肿瘤相比，mRNA表达谱高度相关，蛋白组的主成分分析显示肿瘤和NAT的有效区分。证实蛋白质组学在评估基因功能方面的附加价值。 首先描述了样本的体细胞突变特征和微卫星不稳定性，并根据突变频谱区分患者亚群以及鉴定显著突变基因。随后对基因突变与蛋白组的关联进行了分析，揭示一些高协同的基因。APC中的终止和移码突变导致无义的mRNA衰变或蛋白被截断，TGFBR2中移码突变导致磷酸位点TGFBR2-S553的丰度降低了。高迁移率组（HMG）转录因子SOX9蛋白水平明显过表达，大多数截短突变都发生在HMG-box域的下游和进化保守的泛素靶位点K398的上游，通过截短的突变去除K398泛素化位点可以稳定SOX9蛋白并增加蛋白丰度，支持SOX9在原代CRC细胞中的致癌作用而非肿瘤抑制作用。 该部分主要通过体细胞突变分析寻找并描述结肠癌中显著突变基因的特征，以及联系突变位点和蛋白表达和磷酸化水平的变化提示仅凭突变无法预测蛋白功能复杂性。 进行体细胞拷贝数改变（SCNA）分析，确定了与TCGA队列非常相似的臂级SCNA，包括1q、7p/q、8p/q、13q和20p/q的扩增，以及1p、14q、15q、17p/q、18p/q和22q的缺失。队列中发现了先前大量报道的SCNA，第20号染色体（、、）和第18号染色体（）中分别包含最频繁扩增和缺失的焦点区域，还确定了18q局灶性缺失区域中的著名肿瘤抑制物SMAD4。SCNA与mRNA和蛋白质丰度的相关性比蛋白质丰度更强。SCNA基因和显著突变基因显著富集的术语包括细胞增殖、细胞死亡、Hippo信号通路。位于整个基因组不同局灶性缺失区域的六个基因富集了内吞作用，表明多个缺失事件会收敛以抑制内吞途径，这可能使肿瘤获得生长信号的自给自足。 继续描述基因组全局的拷贝数变异特征，并讨论了拷贝数变异区域中的一些重要基因，及对拷贝数扩增和或缺失水平、mRNA和蛋白丰度作了关联。结合富集分析阐述突变基因或扩增/缺失基因参与的通路激活或抑制是否与肿瘤信号有关。 成视网膜细胞瘤（RB1）基因的蛋白（Rb）是一种肿瘤抑制因子，Rb的丢失会通过消除细胞增殖的阻碍而促进细胞不良行为并促进癌变。然而在结肠癌中，发现Rb的扩增和过度表达与其在其它癌症中的频繁突变和缺失相矛盾，值得深思。通过观察Rb的磷酸化，发现即使细胞中有更多的RB1拷贝或表达水平，但Rb蛋白由于被高度磷酸化而失活，这种构型使其不像肿瘤抑制因子一样起作用。 抑癌基因RB1由于同时的高度磷酸化而失活，因此高拷贝或高丰度并未表现出抑癌功能，蛋白组和磷酸化联合分析颠覆了单一基因组或蛋白组学的一般推论，这是多组学分析优势所在。 作者分析了肿瘤和正常组织之间的差异蛋白，并将分析的重点放在肿瘤中升高了2倍以上的31种蛋白上，这些蛋白被定义为结肠癌相关蛋白。这31种蛋白质与人类分泌蛋白、膜蛋白质组和酶相关联，发现这些蛋白质中有15种具有临床实用性，可作为诊断标志物、结果标志物或治疗靶标，包括临床实践中使用最广泛的CRC标志物CEACAM5。还根据磷酸化位点丰度的差异，定位了与癌症相关的50种蛋白质的63个磷酸位点，其中4种符合与癌症相关的蛋白质的标准。蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据的互补提示可寻找基因组研究中遗漏的结肠癌基因。激酶底物富集分析鉴定了4种激酶，除了已知的药物靶向激酶CDK、MELK和PFKFB3外，激酶PI4KB作为新的候选治疗靶点可能值得进一步研究。 该部分集中在蛋白组，通过传统的差异分析、功能富集等比较并鉴定了结肠癌肿瘤中的标志物蛋白和磷酸位点。通过进一步联系已知的药物研究，提供了潜在的治疗靶点。 综合考虑转录组、蛋白质组以及MSI分型各因素占比，总结得三个新的结肠癌分子亚型特征，并根据其将结肠癌病人分为四个亚型，且对每个亚型的特征展开研究。其中CIN亚型的肿瘤显示出更高的染色体不稳定性。许多miRNA和磷酸位标记与亚型特异性特征具有已知关系，包括在MSI亚型中miR-552、miR-592和miR-181d的表达降低，在间充质亚型中miR-200家族的表达降低， MSI和间充质亚型中STAT1和STAT3的磷酸化水平分别升高。CIN亚型中RB1的拷贝数更高，且Rb-S811和S807显著增加，并进一步表明CDK2抑制在CIN亚型中可能是最有效的。管MSI和间充质亚型均比CIN亚型具有更高的免疫浸润性，但MSI亚型特别富含细胞毒性免疫细胞。MSI亚型中的糖酵解酶广泛增加，揭示了蛋白质水平的适应性在MSI亚型中产生了强烈的Warburg效应，并建议将检查点和糖酵解抑制相结合的治疗可能为治疗对检查点封锁有抵抗力的MSI肿瘤提供有效的策略。 最后是肿瘤分子亚型及其特征分析，这在大规模肿瘤组学研究中是必不可少的，以试图为不同亚型的患者制定更合适的靶向治疗方案提供线索。 本篇研究对人类结肠癌进行了前所未有的分子表征，证实了蛋白质组学整合在揭示新型癌症生物学中的价值，并进一步证明了蛋白质组学在治疗假说产生中的实用性。 除了加强或补充基因组数据外，蛋白质组学整合还可纠正基于基因组数据的不准确推论，并带来意想不到的发现和治疗机会。一个例子是蛋白质组学将SOX9鉴定为致癌基因，而根据体细胞突变数据预测它是一种肿瘤抑制因子。另一个例子是磷酸蛋白质组学数据使Rb磷酸化成为结肠癌的致癌驱动因素，这表明通过CDK2抑制靶向结肠癌中Rb磷酸化的独特机会。 基于多组学的亚型分析提供了基于三种UMS亚型（即MSI、CIN和间充质）的结肠癌分子异质性的统一视图。蛋白质组学数据将MSI肿瘤中CD8浸润减少与糖酵解增加相关联，这支持了新出现的观点，即肿瘤糖酵解增加会损害T细胞功能并增加肿瘤微环境来抑制抗肿瘤免疫力，因此可以考虑通过糖酵解抑制来克服MSI肿瘤对免疫检查点封锁的抵抗力。 综合蛋白质组学表征揭示了靶向结肠癌治疗中信号蛋白、代谢酶和肿瘤抗原的新治疗机会。尽管这些治疗假说的验证不在当前研究的范围之内，但这些新假说最终可能使结肠癌的分子指导精确治疗取得实质性进展。
随着分子生物学的飞速发展，最为世人瞩目的人类基因组计划即将提前完成。人类将向了解自己的生命奥秘这一目标迈进一大步。但是，由于基因是遗传信息的携带者，而生命活动的执行者却是蛋白质，即基因的表达产物。因此，即使得到人类全部基因序列，也只是解决了遗传信息库的问题。人类揭示整个生命活动的规律，就必须研究基因的物产——蛋白质。相对于基因组而言，后者称为蛋白质组。1 蛋白质组概述及其相关研究技术和方法鉴于基因组研究的局限性，1994年澳大利亚Macquaie 大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组（Proteome）这个概念。定义为“蛋白质组指的是一个基因组所表达的蛋白质”，即“PROTEOME”是由蛋白质的”PROTE”和基因组的“OME”字母拼接而成[1].这个新术语很快得到了国际生物学界的认可。目前对蛋白质组的分析工作大两个方面。一方面，通过二维胶电泳等技术得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱，相关数据将作为待测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。另一方面是比较分析在变化了生理条件下蛋白质组所发生的变化。目前蛋白质组研究技术常用以下手段：（1）用于蛋白质分离技术方面的如双向凝胶电泳（2-DE）、双向“高效”柱层析等。（2）用于蛋白质鉴定的技术如质谱技术、凝胶图像分析、蛋白质和多肽的N端、C端测序及氨基酸组成分析等。（3）用于蛋白质相互作用及作用方式研究的双杂交系统。（4）用于分析大量数据的生物工程信息学等[2].。2 蛋白质组在医学研究中的现状和前景自蛋白质组概念提出以来，已发表相关论文及论著数篇。并于是1997年举行了第一届国际性的“蛋白质组学”会议。同年出版式了第一部蛋白质组学的专著。目前蛋白质组在医学方面的研究重点在于对人类疾病的发病机制、早期诊断及治疗，对致病微生物的致病机理、耐药性及发现新的抗生素为主。现将这两方面的进展情况综述如下。 人类疾病的蛋白质组研究 直肠癌 直肠癌的发生是因多个基因的突变，导致肿瘤抑制基因失能所致，但确切机制仍不清楚。为探讨其发病机制，Sanchez等对15例结肠癌和13例正常人的结肠上皮进行2-DE，每个多肽模式用Melanie I12-DE分析软件进行分析。据此建立了包括882和861个斑点的结肠癌及正常人结肠粘膜的标准胶图。结果发现在分子量为13kD和pI值为处的蛋白质仅出现在结肠癌的组织中。15例结肠癌患者中13/蛋白有13例（87%）。此外，发现13/蛋白不仅在中度、低度分化的结肠癌及有24年病史的溃疡性结肠炎过度表达，而且出现在7例分化程度不同的腺瘤的癌前病灶。但对照组则极少出现。这表明该蛋白的出现对检测早期直肠癌有很强提示。通过对该蛋白HPLC及测序等分析后，发现与钙粒蛋白B（calgranulin B）及钙卫蛋白（calprotectin）有很大关系[3]。 肝癌 醛糖还原酶（aldose reductase, ）是醛酮还原酶超家族中的一个成员。它催化葡萄糖还原为山梨醇，通过减少内源或外源性代谢产物而起到解毒作用。Peter R等在用N-甲基-N-亚基脲诱导（N-methly-N-nitrosourea-induced）的小鼠肝癌中，用2-DE及氨基酸微型测序可分辩出一种肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质（35Kd/）。而在小鼠的晶状体中，则发现一种醛糖还原的同工酶，该酶与已知的小鼠醛糖还原酶有98%的同源性，而与肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质截然不同。这表明两种蛋白质是由相关的两条基因编码，在小鼠不同的器官中表达不同。肝癌诱导的醛糖还原酶蛋白质优先表达在肝癌及胎肝中，它们均受到纤维细胞生长因子的刺激，但随小鼠鼠器官的生理及病理环境而表现不同的形式。经免疫组化证实，肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质在成人肝脏中不表达，但在小鼠的肝癌 中又重新表达。同时发现该蛋白在癌前病变及肝癌中表达强烈，而在肝脏周围的正常组织不表达[4]。表明该蛋白可能与肝癌的发病有很大关系。 扩张型心肌病 扩张型心肌病是一种严重的可导致心衰的心脏病，大多数患者需行心脏移植术。目前其发病机理不明，推测可能为多种因素所致。1990年已有两组人员进行该病的蛋白质组分析。其后不久心肌的2-DE数据库建成，并进入国际互联网络。Knecht等采用2-DE取得了3300个心肌蛋白条带，通过氨基酸序列分析、Edman降解法及基质辅助的激光解吸离子化质谱（MALDI-MS）等分析了其中150条。经活检及术后病理证实，有12条为扩张性心肌病特有的蛋白。但具体资料尚在进一步分析之中[5]。Arnott D等对新福林诱导的肥大心肌细胞进行蛋白质组分析，同对照相比亦发现有8种蛋白质的表达水平发现了变化[6]。 膀胱癌 IFN-γ除抗病毒外，还有一项重要的功能即抗肿瘤作用。目前其抗肿瘤作用机制不明。有资料表明，IFN-γ可能通过在相关细胞中增强或抑制有关基因而发挥抗肿瘤作用。重组IFN-γ和IL-2已开始应用于膀胱癌的治疗中。为探明其作用机制，George等将四种分级程度不同的人膀胱癌新鲜活检标本，用50U/ml IFN-γ作用20个小时后，采用2-DE、微型序列分析、等电聚集、蛋白质印迹等方法，对标本进行蛋白质组分析。结果表明有五种蛋白质（色按酸-tRNA合成酶、IFN-γ诱导的r3，超氧化物歧化酶及两种分子量为和的未知蛋白）的表达量增加了75%，而醛糖还原酶表达量则下降。为研究IFN-γ对治疗膀胱癌的作用机制提供了一种方法[7]。此外，由于缺乏对膀胱鳞状细胞癌客观可靠的组织学分级标准，因而很其进行早期诊断。为此，Morten等对150例膀胱癌进行双盲法2-DE，并结合了蛋白质印迹法、微型序列分析及质谱等技术，建立了新鲜膀胱癌标本的2-DE数据库，且发现角蛋白10、14及银屑病相关的脂肪酸结合蛋白（psoriasis-associated fatty acid-binding protein,PA-FABP）等可以作为膀胱癌不同分化程度的标记物[8]。为早期诊断提供了一种新的手段。[ 本帖最后由 snow_white 于 2007-7-20 16:32 编辑 ]查看完整版本请点击这里：蛋白质组学研究〔综述〕05我也来说两句 查看全部回复 最新回复snow_white (2007-7-20 16:31:50) 其它 目前人的各种组织、器官、细胞乃至各种细胞器已被广泛研究。以期为疾病诊治及了解发病机制提供新的手段。在一项利用蛋白质组研究技术进行的酒精对人体毒性的研究中发现，乙醇 会改变血清蛋白糖基化作用，导致许多糖蛋白的糖基缺乏，如转铁蛋白[9]。Jagathpala等对免疫所致的不孕症的男性精子蛋白质进行蛋白质组分析，发现了导致不孕症的6种自体及异体抗 精子抗体[10]。在对肾癌的研究中，发现有4种蛋白质存在于正常肾组织而在肾癌细胞中缺失。其中两种分别是辅酶Q蛋白色素还原酶和线粒体乏醌氧化还原复合物I。这提示线粒体功能低下可能在肿瘤发生过程中起重要作用[11]。Ekkehard Brockstedt等利用2-DE、Edman微型序列法、MALDI-MS等对人BL60-2伯基特淋巴瘤细胞系进行了细胞凋亡机制的研究，结果发现RNA聚合酶转录因子3a（BTF3a）和/或BTF3b与抗IgM抗体介导（anti-IgM antibody-mediated）的细胞凋亡有很大关系[12]。 致病微生物的蛋白质组研究 近年来，WHO越来越重视感染性疾病对人类健康的影响。除结核、多重耐药链球菌感染及机会致病菌外，出现了一些新的感染因素如HIV、博氏疏螺旋体及埃博拉病毒等。因此这些致病微生物的蛋白质组分析，对于了解其毒性因子、抗原及疫苗的制备非常重要，此外对疾病的诊断、治疗和预防也同样重要。现已获得18种微生物的全部基因组序列，另有60余种的基因序列正在研究之中。这些工作的开展为蛋白质组的研究提供了有利条件。 检测博氏疏螺旋体与免疫有关的蛋白质 博氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）是莱姆病的主要病因，表现为环形红斑及流感样症状，大约有50%的未治患者发展为神经系统及关节系统疾病。该螺旋体可分为3种类型： sensu stricto,, 。其诊断需依靠血清学检查，但存在敏感性及特异性变化的缺点。为获得更可靠的血清学检查，Peter等用2-DE从得到217个银染的蛋白斑点。从中国兔多克隆抗体鉴别出6个已知的讥原。将不同临床表现莱姆病患者的血浆用 2-DE图杂交。用抗IgM及抗IgG作为第二抗体，在10例有游走性红斑的患者血浆中，检测出60~80个抗原。同时发现在有关节炎的患者血浆中，包含有抗15种抗原的IgM抗体及抗76种不同抗原的IgG抗体。而晚期有神经系统症状的患者血浆中，则包含有抗33种抗原的IgM抗体及抗76种抗原的IgG抗体。上述3种类型患者的血浆中均包含有抗6种已知抗原的抗体，且被SDSPAGE杂交所证实。这些抗原均是潜在的具有特异性诊断的标志物。 弓形体抗原的检测 弓形体病是由鼠弓形体虫引起的寄生虫病。全球人口大约有30%是携带者，在欧洲是最常见的寄生虫病。如果妊娠者感染，该虫可通过胎盘引起胎儿的感染。且随着妊娠时间的增加，感染的机会也增加。大约50%母体的感染可引起新生儿先天性疾病。因此诊断及治疗越早越好。目前要依靠血清学及PCR，而单独采用血清学如用IgG，IgM,或IgA抗体对疾病活动期敏感性不够，尤其对于妊娠或有免疫抑制的患者。潜在感染常发生在有免疫抑制的患者中。对AIDS患者来说，鼠弓形体虫是最主要的致命性脑损伤的病因。因此，能否早期诊断对治疗来说尤为关键。Jungblut等将鼠弓形体虫RH株在人羊膜细胞系FL521中传代后，用2-DE得到300个银染的斑点。再将其与以下3种患者的血浆进行免疫杂交：（1）患有急性弓形体病的妊娠女性（n=11）; (2)患急性弓形体病的非妊娠者（n=6）(3)有潜在感染的患者（n=9）。结果有9个斑点对各阶段的弓形体感染均反应，这9种斑点被用来当作弓形体感染的标记。其中7种标记可用作区别疾病的不同阶段。但对区别急性期与潜在期仍需联合应用多种抗原[4]。 白色念珠菌 芽管结构是白色念珠菌向菌丝体转变的早期阶段，该结构能增强白色念珠菌对宿主细胞的粘附力、穿透力及破坏性。目前通过蛋白质组分析方法如2-DE、质谱等已检测出在芽管结构所表达的一组特异蛋白如DNA结合蛋白等，为致病提高了一些参考指标[13]。Monkt等发现，在conA反应后的SDS-PAGE图中，在芽管结构的膜上，分子量为80kD复合糖处，出现很淡的考马斯亮蓝染色，而在孢子时则未出现。提示膜的整合、出现未与ConA结合的80kD复合糖可能与芽管结构的发生及生长有关。粘附素（adhesin）是白色念珠菌表面的组成部分，介导其与宿主的结合，是侵入宿主所需的重要蛋白，包含多种成分如白色念珠菌胞壁上的疏水蛋白等，通过增强菌株的粘附性而在其致病机制中发挥一定作用。但由于这些蛋白有很大同源性、多种糖基化作用及与胞壁或胞浆膜上其它成分形成共价结合，故提纯及分析很难。现通过等电聚集、2-DE及洗脱电泳等方法，可使这些蛋白得到很好的纯化、分离及分析[14]。抗真菌药通过改变真菌胞壁组分的生物合成和重组胞壁相关酶的结合位置而发挥作用。抗真菌药远少于抗细菌药就在于对真菌细胞壁蛋白分析了解太少。现在临床上用于抗真菌的药物多为咪唑类（咪康唑、酮康唑）及三唑类（氟康唑、伊曲康唑），但有很多患者出现耐药现象。在白色念珠菌中，目前发现至少有8种CDR家族的基因可产生耐药株的表现型。且有55种基因分别表达ABC及MFS蛋白（菌内药物输出泵）[]。但这些基因、蛋白与耐药之间的关系仍未清楚。应用2-DE、免疫检测蛋白质等技术，对这些蛋白在菌内的表达量进行分析，发现Cdrlp及CaMdrlp蛋白在耐咪唑类菌株中过量表达。在对咪唑类每感及去除CDR1基因的白色念珠菌株CA114中，提取并检测耐氟康唑突变子（FL3）的表达。结果发现FL3对氟康唑的耐是去除CDR1的基因的白色念珠菌株CA114的500倍 ，是CA114的250倍。且CDR1 mRNA在FL3的量是Ca114的8倍[17]。同时，对敏感性及耐药株蛋白质的2-DE图分析发现，在耐中有25种蛋白质增加，有76种蛋白质减少。推测白色念株菌是通过改变染色体数目或染色体重组来调节基因的表达量，进而产生耐药性[18]。随着蛋白质组技术成熟完善，将对真菌壁及耐药基因分泌的各种蛋白组成分析带来重大突破，并对抗真菌的研制提供重要资料。虽然蛋白质组学还处在一个初期发展研段，但我们相信随着其不断地深入发展，蛋白质组（学）研究在提示诸如生长、发育和代谢调控等生命活动的规律上将会有所突破，对探讨重大疾病的机理、疾病诊断、疾病防治和新药开发将提供重要的理论基础。[ 本帖最后由 snow_white 于 2007-7-20 16:33 编辑 ]snow_white (2007-7-20 16:34:25)二、蛋白质组学的研究进展蛋白质组学强调的是针对蛋白质的一个整体思路。从整体的角度看，蛋白质组研究大致可分为两种类型：一种是针对细胞或组织的全部蛋白质，也就是着眼点是整个蛋白质组；而另一种是以与一个特定的生物学机制或机制相关的全部蛋白质为着眼点，在这里整体是局部性的。针对细胞蛋白质组的完整分析的工作已经比较全面地展开，不仅如大肠杆菌、酵母等低等模式生物的蛋白质组数据库在建立之中，高等生物如水稻和小鼠等的蛋白质研究也已开展，人类一些正常和病变细胞的蛋白质数据库也已在建立之中。与此同时，更多的蛋白质组研究工作则是将着眼点放在蛋白质组的变化或差异上，也就是通过对蛋白质组的比较分析。首先发现并去鉴定在不同生理条件下或不同外界条件下蛋白质组中有差异的蛋白质组分。限于篇幅，本文不对这方面的工作做进一步论述。本文接下来重点介绍近期发表的关于蛋白质组学的几个工作，从中可以看到蛋白质组学的思想方法在蛋白质整体（或局部整体）水平上是如何解决生理学的一些重要问题的。1999年11月《Nature》杂志发表了一篇用蛋白质组学方法研究蛋白质折叠的研究论文[10]。在这篇文章中，Houry等报道了在大肠杆菌胞质中的2500种新生多肽链种只有近300种以GroEL作为分子伴侣来帮助其折叠成正确构象。在以往的相关研究中，通常只是针对某个或某些特定的蛋白质，观察它（们）在折叠过程中是否需要诸如GroEL等分子伴侣的帮助。而在这个工作中，研究是从一个整体的思路出发，首先通过免疫共沉淀的方法获得所有与GroEL结合的肽链，再通过二维电泳和数据库比较等蛋白质研究的手段对这些肽链进行分析鉴定，从而实现了对大肠杆菌近2500条新生多肽链与分子伴侣GroEL的关系的全面分析。在这个工作中，研究者还通过对其中50种与GroEL作用的肽链的鉴定，进一步揭示了决定这些蛋白质能与GroEL相互作用的关键结构特征。应该说，这个工作很好地体现了蛋白质组学的思想方法和技术手段的运用。过去在细胞生物学领域还没有得到过一个主要亚细胞结构的完整的分子图。核孔复合体是一个巨大的跨核膜的八角形结构，是控制大分子在胞质和核质间运输的通道。多年来，很多方法被用来分析这一复合体的组成成分。虽然这些工作取得了很大的进展，但究竟在多大程度上反映了这一复合体的分子原貌仍然是一个未知数。最近通过使用蛋白质组学的手段，Rout等[11]鉴定了完整的酵母核孔复合体所有能检测到的多肽，并系统地对每种可能的蛋白质组分在细胞中定位，结合免疫电镜的方法将各组分在复合体内定位并定量，从而揭示了酵母核孔复合体的完整分子构造，并在此基础上揭示了其工作原理。这个工作可以说是蛋白质组学解决构造生物学问题的一个典范，为揭示其他巨大分子机器的"构造"和工作原理指出了一条新路[12]。通过分析一个蛋白质是否跟功能已知的蛋白质相互作用可得到揭示其功能的线索。因为经验告诉我们，如果两个蛋白质相互作用，那么它们一般参与相同或相关的细胞活动[13]。从近期国际上蛋白质组学研究的发展动向可以看出，揭示蛋白质之间的相互作用关系，建立相互作用关系的网络图，已成为揭示蛋白质组复杂体系与蛋白质功能模式的先导，业已成为蛋白质组学领域的研究热点。2000年初，《Science》登载了一篇应用蛋白质组学的大规模双杂交技术研究线虫生殖器发育的文章[14]。在这个工作中，Walhout等以线虫的生殖发育过程作为研究对象，从已知的27个与线虫发育的蛋白质出发，构造了一个大规模的酵母双杂交系统，得到了100多个相互作用的结果，初步建立了与线虫生殖发育相关的蛋白质相互作用图谱，从而为深入研究和揭示线虫发育的机制等提供了丰富的线索。这个工作不同于一般的应用酵母双杂交进行研究的地方在于，它出于对一个生物学问题的整体思考，尽可能地从所有已知的蛋白质而不只是个别的蛋白质为出发点。这一个工作为以前专注于信号转导过程中单个蛋白质作用的科学家们提供了一个新的思路，即将整个途径的相关蛋白质一起考虑。那么，能否通过酵母双杂交系统来分析一种细胞或特定组织的所有可能的蛋白质之间的相互作用呢？在今年初，《Nature》发表了一篇通过大规模双杂交技术研究酵母近6000个蛋白质之间相互作用的论文[15]。啤酒酵母基因组DNA的全序列业已测定，这为通过双杂交技术来鉴定酵母基因组编码的全部6000种左右的蛋白质间的可能相互作用提供了非常有利的条件。在这个工作中，研究人员采用了两种不同的策略对酵母的蛋白质间的相互作用作了全面分析。一是所谓的列阵筛选法（array screening）。在此方法中，6000株表达不同"猎物"蛋白的酵母单克隆分别加在微滴定板上，带有不同的"诱饵"蛋白的酵母株与前面6000株细胞一一接合形成二倍体细胞，"猎物"蛋白与"诱饵"蛋白的相互作用通过报道基因的表达而被鉴定。这篇文章中报道了192种不同的"诱饵"蛋白与近6000种"猎物"蛋白的相互作用的结果。另一种方法是文库筛选法。该方法与前一种方法的区别是，将表达6000种不同"猎物"蛋白的酵母细胞混在一起构成文库，再将这个文库分别与6000株表达不同"诱饵"蛋白的酵母细胞接合，再进一步筛选鉴定阳性克隆，即"诱饵"与"猎物"发生相互作用的克隆。根据这篇报告，上述两种策略得到了不同的结果，相比之下阵列筛选法更为有效，而文库筛选法的长处是通量大。这一工作的重要意义在于我们已经看到，在基因组序列被了解的基础上，可以利用大规模双杂交技术全面地，当然也是初步地，分析其物种或其细胞、组织的所有蛋白质之间的相互作用关系。相信类似的工作将很快针对其他物种开展，特别是基因组序列已被揭示的物种。由此可见，蛋白质组学已经开始从建立数据库走向解决生命科学的重大问题，成为研究生物学问题或机制的强有力手段。snow_white (2007-7-20 16:37:32)三、蛋白质组学研究进展与趋势曾 嵘 夏其昌（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学研究分析中心 上海 200031）如果在五年前提到蛋白质组学（Proteomics），恐怕知之者甚少，而在略知一二者中，部分人还抱有怀疑态度。但是，2001年的Science杂志已把蛋白质组学列为六大研究热点之一，其“热度”仅次于干细胞研究，名列第二。蛋白质组学的受关注程度如今已令人刮目相看。1．蛋白质组学研究的研究意义和背景随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA mRNA 蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(Transcriptional control )，翻译水平调控(Translational control)，翻译后水平调控(Post-translational control )。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为：(1) 生命现象的发生往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质。(2) 多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联因果。(3) 在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不象基因组那样基本固定不变。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。因此在上世纪90年代中期，国际上产生了一门新兴学科－蛋白质组学（Proteomics），它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。虽然第一次提出蛋白质组概念是在1994年，但相关研究可以追溯到上世纪90年代中期甚至更早，尤其是80年代初，在基因组计划提出之前，就有人提出过类似的蛋白质组计划，当时称为Human Protein Index计划，旨在分析细胞内的所有蛋白质。但由于种种原因，这一计划被搁浅。90年代初期，各种技术已比较成熟，在这样的背景下，经过各国科学家的讨论，才提出蛋白质组这一概念。国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层出不穷。1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心：Australia Proteome Analysis Facility ( APAF )。丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国，各大药厂和公司在巨大财力的支持下，也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。去年在瑞士成立的GeneProt公司，是由以蛋白质组数据库“SWISSPROT” 著称的蛋白质组研究人员成立的，以应用蛋白质组技术开发新药物靶标为目的，建立了配备有上百台质谱仪的高通量技术平台。而当年提出Human Protein Index 的美国科学家Normsn G. Anderson也成立了类似的蛋白质组学公司，继续其多年未实现的梦想。2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（Human Proteome Organization, HUPO）,随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划（Human Proteome Project）。snow_white (2007-7-20 16:37:49)2．蛋白质组学研究的策略和范围蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略。一种可称为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，这种观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组学的本质。但是，由于蛋白质表达随空间和时间不断变化，要分析生物体内所有的蛋白质是一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”，即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式（Expression profile）, 随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。蛋白质-蛋白质相互作用的研究也已被纳入蛋白质组学的研究范畴。而蛋白质高级结构的解析即传统的结构生物学，虽也有人试图将其纳入蛋白质组学研究范围，但目前仍独树一帜。
生态 的蛋白质我肯定好的
蛋白质提取与制备的原理和方法 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白：溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白：一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白：溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出醇溶蛋白：溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇壳蛋白：在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液精蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀组蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等): 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽然有了不改进，但其主要原理仍不外乎两个方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态分为差速离心、超滤、分子筛及透析等方法；按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法；按电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等；按生物功能专一性有亲合层析法等。由于不同生物大分子结构及理化性质不同，分离方法也不一样。即同一类生物大分子由于选用材料不同，使用方法差别也很大。因此很难有一个统一标准的方法对任何蛋白质均可循用。因此实验前应进行充分调查研究，查阅有关文献资料，对欲分离提纯物质的物理、化学及生物学性质先有一定了解，然后再着手进行实验工作。对于一个未知结构及性质的试样进行创造性的分离提纯时，更需要经过各种方法比较和摸索，才能找到一些工作规律和获得预期结果。其次在分离提纯工作前，常须建立相应的分析鉴定方法，以正确指导整个分离纯化工作的顺利进行。高度提纯某一生物大分子，一般要经过多种方法、步骤及不断变换各种外界条件才能达到目的。因此，整个实验过程方法的优劣，选择条件效果的好坏，均须通过分析鉴定来判明。另一方面，蛋白质常以与其他生物体物质结合形式存在，因此也易与这些物质结合，这给分离精制带来了困难。如极微量的金属和糖对巨大蛋白质的稳定性起决定作用，若被除去则不稳定的蛋白质结晶化的难度也随之增加。如高峰淀粉酶A的Ca2+，胰岛素Zn2+等。此外，高分子蛋白质具有一定的立体构象，相当不稳定，如前所述极易变性、变构，因此限制了分离精制的方法。通常是根据具体对象联用各种方法。为得到天然状态的蛋白质，尽量采用温和的手段，如中性、低温、避免起泡等，并还要注意防腐。注意共存成分的影响。如蝮蛇粗毒的蛋白质水解酶活性很高，在分离纯化中需引起重视。纯化蝮蛇神经毒素时，当室温超过20℃时，几乎得不到神经毒素。蝮蛇毒中的蛋白水解酶能被 EDTA完全抑制，因此在进行柱层析前先将粗毒素溶液处理，即使在室温高于20℃，仍能很好的得到神经毒素。整个制备过程一般可分为5个阶段：①材料的选择和预处理②细胞的破碎（有时需进行细胞器的分离）③提取④纯化（包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、层析、超离心及结晶等）⑤浓缩、干燥及保存。以上5个阶段不是要求每个方案都完整地具备，也不是每一阶段截然分开。不论是哪一阶段使用哪一种方法，均必须在操作中保存生物大分子结构的完整性。保存活性防止变性及降解现象的发生。因空间结构主要依靠氢键、盐键和范德华力的存在，遇酸、遇碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均可导致活性丧失。因此选择的条件应为十分温和。同时应注意防止系统中重金属离子、细胞自身酶系及其他有毒物质的污染。蛋白质提取与制备的注意事宜：一、原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C较马的易结晶，马的血红蛋白 较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白 酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白 、贫血血红蛋白 ）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。二、前处理1、细胞的破碎材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性或pH显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失。⑵物理方法主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。Ⅰ反复冻融法于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白 冻结变性。Ⅱ冷热变替法将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。Ⅲ超声波法暴露于9～10千周声波或10～500千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。Ⅳ加压破碎法加一定气压或水压也可使细胞破碎。⑶化学及生物化学方法Ⅰ有机溶媒法粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。Ⅱ自溶法将待破碎的鲜材料在一定pH和适当的温度下，利用自身的蛋白 酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。利用该法可从胰脏制取羧肽酶。自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。于温室30℃左右较早溶化。自体融解过程中PH显著变化，随时要调节pH。自溶温度选在0～4℃，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。Ⅲ酶法与前述的自体融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。但值得提出的是溶菌酶处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量高，而多易结晶化。1g菌体加1～10mg溶菌酶，～内完全溶菌。于生理食盐水或蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出。除溶菌酶外，蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。表面活性剂处理较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡淀及去氧胆酸钠等。此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。2、细胞器的分离制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，对于制备一些难度较大需求纯度较高的生物大分子是有利的。尤其近年来分子生物学、分子遗传学、遗传工程等学科和技术的发展，对分布在各种细胞器上的核酸和蛋白质的研究工作日益增多，分离各种细胞器上的各类核酸和特异性蛋白质已成为生物大分子制备工作重要内容之一。各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。DNA几乎全部集中在细胞核内。RNA则大部分分布于细胞质。各种酶在细胞内分布也有一定位置。因此制备细胞器上的生物大分子时，预先须对整个细胞结构和各类生物大分子在细胞内分布匹有所了解。以肝细胞为例,蛋白质、酶及核酸在肝细胞内分布情况为: 细胞核: 精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系 RNA占总量10%左右 DNA几乎全部粒线体: 电子传递、氯化磷酸化、三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、脲合成等酶 系RNA占总量5%左右 DNA微量内质网（微粒体）: 蛋白质合成酶系、羟化酶系 RNA占总量50%左右溶酶体：水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、组织蛋白酶及糖苷及糖苷酶等） 高尔基氏体: 糖苷转移酶、粘多糖及类固醇合成酶系 细胞膜：载体与受体蛋白、特异抗蛋、ATP酶、环化腺苷酶、5’-核苷酸酶、琥珀酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸酶等 ,细胞液 嘧啶和嘌呤代谢、氨基酸合成酶系、可溶性蛋白类 RNA（主要为tRNA）占总量30%.细胞器的分离一般采用差速离心法。细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。细胞器的分离制备、介质的选择十分重要。最早使用的介质是生理盐水。因它容易使亚细胞颗粒发生聚集作用结成块状，沉淀分离效果不理想，现一般改用蔗糖、Ficoll（一种蔗糖多聚物）或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。1.水溶液提取大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶剂。以盐溶液及缓冲液提取蛋白质经常注意下面几个因素。盐浓度等渗盐溶液尤以～磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用碳酸氢钠液提取等。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合，也常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低，如脱氧核糖核蛋白质需用1mol/L以上氯化钠液提取。总之，只要能溶解在水溶液中而与细胞颗粒结合不太紧密的蛋白质和酶，细胞破碎后选择适当的盐浓度及PH，一般是不难提取的。只有某些与细胞颗粒上的脂类物质结合较紧的，需采用有机溶剂或加入表面活性剂处理等方法提取。PH值蛋白质提取液的PH值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果。如细胞色素C属碱性蛋白质，常用稀酸提取，肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱提取。某些蛋白质或酶与其分物质结合常以离子键形式存在，选择pH3～6范围对于分离提取是有利的。温度多数酶的提取温度在5℃以下。少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化。如胃蛋白酶等及许多多肽激素类，选择37～50℃条件下提取，效果比低温提取更好。此外提取酶时加入底物或辅酶，改变酶分子表面电荷分布，也能促进提取效果。2.有机溶剂提取有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。但一些和脂结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取。从一些粒线体（Mitochondria）及微粒体（Microsome）等含多量脂质物质中提取蛋白质时，采用Morton的丁醇法效果较好。因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10%，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH及温度选择范围较广（pH3～10，温度-2℃至40℃）。国内用该法曾成功地提取了琥珀酸脱氢酶。丁醇法对提取碱性磷酸脂酶效果也是十分显著的。胰岛素既能溶于稀酸、稀碱又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60―70%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可抑制蛋白质水解酶对胰岛素的破坏，同时也达到大量除去杂蛋白的目的。3.表面活性剂的利用 对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，也有采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷基磺酸钠等处理。表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（Triton X-100 、Tirton X-114、吐温60及吐温80）等。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起酶失活，使用较多。对于膜结构上的脂蛋白和结构，己广泛采用胆酸盐处理，两者形成复合物，并带上净电荷，由于电荷再排斥作用使膜破裂。近年来研究膜蛋白使用表面活性剂的稀溶液提取时，较喜欢用非离子型表面活性剂。4.对提取物的保护在各种细胞中普遍存在着蛋白水解酶，提取时要注意防止由它引起的水解。前面所讲的降低提取温度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多数蛋白水解酶的最适PH在3～5或更高些，因在较低PH条件下可降低蛋白质水解酶引起的破坏程度。低pH可使许多酶的酶原在提取过程中不致激活而保留在酶原状态，不表现水解活力。加蛋白质水解酶的抑制剂也同样起保护作用，如以丝氨酸为活性中心的酶加二异丙基氟磷酸，以巯基为中心的酶加对氯汞苯甲酸等。提取溶液中加有机溶剂时也能产生相类似的作用。蛋白水解酶的性质变化很大，上述条件均视具体对象而变化。有一些蛋白含巯基，这些巯基可能是活性所必需。在提取这种蛋白不要带入金属离子和氧化剂。前者可往提取液中加金属螯合剂如EDTA，后者可加入还原剂如抗坏血酸。有某些蛋白质带一些非共价键结合的配基。提取时要注意保护，不要使酸基丢失。蛋白质提取与制备的方法：1.分离纯化的原则从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后操作。常用有机溶剂提取除去。对于异类物质，提纯蛋白质和酶时常混有核酸或多糖，一般可用专一性酶水解，有机溶剂抽取及选择性部分沉淀等方法处理。小分子物质常在整个制备过程中通过多次液相与固相转化中被分离或最后用透析法除去。而对同类物质如酶与杂蛋白、RNA、DNA以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之间产分离，情况则复杂得多。主要采用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超离心法及柱层析法等。其中盐析法、等电点法及结晶法用于蛋白质和酶的提纯较多，有机溶剂抽提和沉淀用于核提纯较多，柱层析法、梯度离心法对蛋白质和核酸的提纯应用十分广泛。如前所述，蛋白质的分离纯化较难，而且其本身的性质又限制了某些方法的使用，因此要研究目的物的微细特征，巧妙的联用各种方法并进行严密的操作，同时有必要了解精制各过程的精制程度和回收率。具有活性的蛋白质可利用吸收光谱等物理性质或以相当于单位氮活性增加为尺度进行追踪。其他蛋白质可用电泳、超离心、层析、扩散及溶解等测定纯度。如结晶核糖核酸酶经层析分为两个成分。可见对确定蛋白质结晶纯度尚无最终的尺度。根据经验即或纯净的标准品，有极微量的不纯物时，也会给实验带来较大的影响。不稳定的蛋白质，如分离SH-酶时使用试剂及缓冲液等，要确认不含重金属离子（特级试剂也需检定）。蛋白质纯化的操作如脱盐、浓缩干燥等均与低分子化合物不同，必须经过独特的繁琐操作。蛋白质和蛋白质相互分离主要利用它们之间的各种性质的微小差别。诸如分子形状、分子量大小、电离性质、溶解度、生物功能专一性等。蛋白质提取液中，除包含所需要的蛋白质（或酶）外，还含有其它蛋白质、多糖、脂类、核酸及肽类等杂质。杂质除去的方法有：A.核酸沉淀法该法可用核酸沉淀剂和氯化锰、硫酸鱼精蛋白或链霉素等。必要时也可用脱氧核糖核酸酶除去核酸。即在粗匀浆中加入少量DNase,于4℃保温30～60min，可使DNA降解为足够小的碎片，以致不影响以后的纯化。B.醋酸铅沉淀法利用醋酸铅沉淀剂除去杂蛋白。因这些沉淀剂也常常使需要的酶（或蛋白质）缓缓变性而失去活性，所以用这类试剂时应迅速进行盐析，使样品与这类试剂脱离接触。C.调pH值或加热沉淀法利用蛋白质酸碱变性性质的差异除去杂蛋白。利用蛋白质的热变性的温度系数差异，可在一定的PH下将蛋白提取液加热到一定的温度，使对热不稳定的杂蛋白性沉淀而除去。D.选择性变性法利用各种蛋白质稳定性的不同，可用选择性变性法来除去杂蛋白 。例如胰蛋白 酶及细胞色素C等少数特别稳定的酶，甚至可用三氯醋酸处理，此时其它杂蛋白 均变性而沉淀，而胰蛋白 酶和细胞色素C则仍留在溶液中。E.透析法小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互转化中被分离，或最后用透析法除去。F.利用溶解度不同的纯化方法2.盐析法盐析法对于许多非电解质的分离纯化均适合。对蛋白质和酶的提纯应用也最早。至今还广泛使用，一般粗抽提物经常利用盐析法进行粗分。也有反复用盐析法得到纯的蛋白质的例子。其原理是蛋白质在低盐浓度下的溶解度随盐液浓度升高而增加（盐溶，与离子强度10～1间成比例增加）。球蛋白 当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出（盐析）（离子强度I2～10）。这是由于蛋白质分子内和分子间的电荷的极性基团有静电引力。当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子一的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质相互聚集而沉淀析出。盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。盐的选择如上所述，蛋白质在水中溶解度取决于蛋白质分子上离子基团周围的水分子数目，即取决于蛋白质的水合程度。因此，控制水合程度，也就是控制蛋白质的溶解度。控制方法最常用的是加入中性盐。主要有硫酸铵、硫酸镁 、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25℃时饱满和溶解度为,即767g/l;0℃时饱满和溶解度为,即676g/l）。在这一溶解度范围内，许多蛋白质均可盐析出来，且硫酸铵价廉易得，分段效果较其它盐好，不易引起蛋白质变性。应用硫酸铵时对蛋白 氮的测定有干扰，另外缓冲能力较差，故有时也应用硫酸钠，如盐析免疫球蛋白 ，用硫酸钠的效果也不错，硫酸钠的缺点是30℃以下溶解度太低。其它的中性盐如磷酸钠的盐析作用比硫酸铵好，但也由于溶解度太低，受温度影响大，故应用不广。氯化钠的溶解度不如硫酸铵，但在不同温度下它的溶解度变化不大，这是方便之处。它也是便宜不易纯化的试剂。硫酸铵浓溶液的PH常在～之间,市售的硫酸铵还常含有少量游离硫酸,PH值往往降至以下,当用其他PH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节.确定沉淀蛋白质所需硫酸铵浓度的方法将少量样品冷却到0～5℃，然后搅拌加入固体硫酸铵粉末，见蛋白质产生沉淀时，离心除去沉淀，分析上清液确定所要蛋白质的浓度，如它仍在溶液中则弃去沉淀，再加更多的硫酸铵于上清液中，直到产生蛋白质沉淀时止。以所要提取的蛋白质在溶液中的浓度对硫酸铵浓度作图，得沉淀曲线，找出蛋白质开始沉淀的浓度。如不考虑收率，饱和度区间可取得窄一些，使纯度高一些。盐析时注意的几个问题:(1)盐的饱和度: 不同蛋白质盐析时要求盐的饱和度不同。分离几个混合组成的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加。每出现一种蛋白质沉淀进行离心或过滤分离后，再继续增加盐的饱和度，使第2种蛋白质沉淀。例如用硫酸铵盐析分离血浆中的蛋白质饱和度达20%时，纤维蛋白原首先析出；饱和增至28～33%时，优球蛋白 析出；饱和度再增至33～50%时，拟球蛋白 析出；饱和度大于50%以上时清蛋白 析出。用硫酸铵不同饱和度分段盐析法，可从牛胰酸性提取液中分离得到9种以上蛋白质及酶。(2)PH值: pH值在等电点时蛋白质溶解度最小易沉淀析出。因此盐析时除个别特殊情况外，pH值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。由于硫酸铵有弱酸性，它的饱和溶液的pH值低于7，如所要蛋白质遇酸易变性则应在适当缓冲液中进行。(3)蛋白质浓度: 在相同盐析条件下蛋白质浓度愈高愈易沉淀。使用盐的饱和度的极限也愈低。如血清球蛋白 的浓度从增至时,需用中性盐的饱和度的最低极限从29%递减至24%.某一蛋白质欲进行两次盐析时,第1次由于浓度较稀,盐析分段范围较宽,第2次则逐渐变窄.例如胆碱酯酶用硫酸铵盐析进时，第1次硫酸铵饱和度为35%至60%,第2次为40%至60%.蛋白质浓度高些虽然对沉淀有利,但浓度过高也易引起杂蛋白的共沉作用.因此,必须选择适当浓度尽可能避免共沉作用的干扰。(4)温度: 由于浓盐液对蛋白质有一定保护作用，盐析操作一般可在室温下进行。至于某些对热特别敏感的酶，则宜维持低温条件。通常蛋白质盐析时对温度要求不太严格。但在中性盐中结晶纯化时，温度影响则比较明显。================================================
笨蛋，自己写嘛！！！！！！
你的论文准备往什么方向写，选题老师审核通过了没，有没有列个大纲让老师看一下写作方向？ 老师有没有和你说论文往哪个方向写比较好？写论文之前，一定要写个大纲，这样老师，好确定了框架，避免以后论文修改过程中出现大改的情况！！学校的格式要求、写作规范要注意，否则很可能发回来重新改，你要还有什么不明白或不懂可以问我，希望你能够顺利毕业，迈向新的人生。 1，论文应该是单一主题还是面面俱到？大学生碰到的第一个诱惑是想在论文里写很多东西。比如有个学生对文学感兴趣，他第一个念头就是给论文起一个《今日文学》这样的标题。如果迫不得已要缩小范围，他会选择《从战后到70年代的西班牙文学》。这类论文是非常危险的。这种题目会让即使是成熟得多的研究者们也直挠头的。对一个20a多岁的大学生来说这是不可能完成的挑战。它要么会变成各种名字和主流观点的简单罗列，要么对原始材料的引用会有失偏颇（这常常是由于省略了不该省略的东西引起的）。1961年，当代作家冈萨罗·托兰特·巴雷斯特写了一本《当代西班牙文学面面观》（瓜德拉玛版），然而，如果这是一篇博士论文的话，人们是一定会把它毙了的，虽然它厚达几百页。它被指责出于疏忽或者无知而没有提到一些被认为非常重要的人物的名字，或者他有时会花一整个章节来写一些“不怎么样”的作家，而对于一些被认为是“重要人物”的则只给了寥寥数笔。当然，我们知道该作者的历史学识以及批评能力都是得到认可的，所以这些遗漏或者比例失调都是有意为之，对某个人物避而不谈比为他洋洋洒洒地写上一整页更能够说明问题。不过如果同样的事情发生在一个二十二岁的大学生身上，谁又能保证他的沉默背后不是别有用心呢？或者他的避而不谈是因为会在其他地方花上几页纸来讨论这个问题？或者这个作者到底知不知道应该怎样写啊？写这种论文的学生常常会向评审委员会的成员抱怨说他们没看懂自己的意思，但是那些成员实际上“无法”看懂他的意思，所以一篇面面俱到的论文常常被看作是傲慢的表现。并不是说（论文中所体现的）学术上的傲慢就一定要被否定掉，我们甚至可以说但丁是个糟糕的诗人，但必须至少先写个300页，对但丁的文本进行深入的分析之后才能说。而这些在一片面面俱到的论文中是看不到的。正因为这样，对于一个大学生来说，与其写什么《从战后到70年代的西班牙文学》，还不如选一个更切实际的低调一点的题目。我可以很直接地告诉你什么才是好题目，它并不是《阿尔代科阿的小说》，而是《“天堂鸟”的两种不同版本》。听上去是不是有点无趣？可能吧，不过那会是更加有趣的挑战。只要好好想一想你就会看到归根到底这是一个如何讨巧的问题。如果写一篇关于四十年的文学的面面俱到的论文，学生将会面对各种可能的反对声音。如果有个提案人或者评审委员会的成员正好想要标榜自己知道某个不太知名的作家，如果那个学生正好又没有把那个作家包括在论文内，他将如何面对前者的发难呢？只要每个评审委员会的成员在看目录时都发现了三个没有被提到的人，那个学生就将在一顿猛烈的轰炸中变得脸色惨白，他的论文顿时好像变成了屁话连篇。相反的，如果学生认真地选择一个范围很小的题目，他就只需要牢牢把握住一份评审委员会大多数成员都不知道的材料就可以了。我并不是在兜售什么下三滥的伎俩，这的确是一种伎俩，但并不低俗，而且它很管用。只要学位申请人以“专家”的面目出现在不如他专业的公众面前，而且看得出为了成为专家他是花了一番心血的，这样占一点便宜是无可厚非的。在这两种极端之间（也就是写四十年文学史的面面俱到的论文以及两种文本之间区别这样严格的单一主题论文）存在着许多中间形式。比如我们可以写《四十年代先锋派文学家的经历》或者《胡安·贝内特和桑切斯·菲尔罗西奥对地理的文学处理》，甚至《卡洛斯·埃德蒙多·德·奥利，埃杜瓦多·奇恰罗以及格罗里亚·富埃尔特斯：三位后岛屿诗人的异同》。我们来看一下一本小册子上的一段话，虽然那是科学领域的，但它所给出的建议适用于所有学科：比如说，《地质学》这个题目就太宽泛了。《火山学》是地质学的一个分支，但是也太大了。《墨西哥的火山》是个不错的着手点，但是同样不够深入。我们把范围在缩小一点就有可能引出非常有价值的研究了：《波波卡莱佩伊尔火山的历史》（科尔特斯的征服者中的某人可能在1591年登上过那里，直到1702年它都没有猛烈喷发过）。一个范围更小，所涉及年份更少的题目是《帕里库丁火山的诞生和死亡》（它的生命仅仅从1943年2月20日延续到了到1952年3月4日）。好吧，我还是推荐最后一个题目。因为到了这个地步，只要申请人能够对那座不幸的火山知无不言，言无不尽就可以了。很久以前，有个学生跑来跟我说他要写一篇题为《当代思想中的符号》的论文。这样的论文是不可能的。连我也不知道“符号”到底指的是什么，实际上这个词在不同的作者那里具有不同的意思，有时，两个作者会用它来表达意思完全相反的两件东西。我们只要考虑一下形式逻辑学家或者数学家所理解的“符号”，它们是没有意义的，在计算公式中占据特定位置，具有特定功能的东西（比如代数公式中的a,b,x,y神马的）,而其他一些作者则可能把它们看做充满了模棱两可含义的东西，比如梦中出现的那些图像，它们可能指一棵树，或者性器官，或者想要长大的愿望等等。所以，我们怎么能把这个作为论文的题目呢？我们必须分析当代文化中所有关于符号的理论，列出它们的共同点和不同点，在它们的不同点里寻找所有作者和理论共有的基本的单一概念，看一下这些不同在不同理论中是否是不相容的。没有当代的哲学家，语言学家或者心理分析学家能够令人满意地解决这个问题。一个初出茅庐的大学生，即使他早慧也只不过接受了最多六七年的成年人的教育，他又怎么能够完成这样的研究呢？最多又是一个像托兰特·巴雷斯那样有失偏颇的东西了。或者他会提出自己的关于符号的理论，而把前人所说的东西晾在一边，下一节我们还要再来说说这种做法值得商榷的地方。我和这个学生交谈了一会儿，我建议他可以写弗洛伊德和荣格的符号，他需要忘记其他各种观点，专心考虑上面的两个作者。可惜这个学生不懂德语（关于语言的问题我们会在第五节谈到）。最后我们决定将题目定为《皮尔士，弗莱和荣格的符号概念》，论文将讨论这三位分别是哲学家，评论家和心理分析家的不同作者那里的三个用同一个词表示的不同概念。由于他们用了同一个词结果造成了混乱，常常有人把其中一位的概念安到另一个人身上。在文章的最后，作为假设的结论，这个学生试图在这些同名异义的概念间寻找平衡，找出它们的相似点。他还提到了一些自己所知道的其他作者，但表示因为论文篇幅所限就无法对他们更多展开了。这样，虽然他的论文只提到了作者X,Y,Z，但没有人能够指责他没有考虑作者K。也没有人能指摘他对引述的那些其他作者不够详细，因为那是在论文的结尾处顺带说一下的，而论文的主体是讨论题目中所出现的那三位作者。现在我们看到了论文不必非要恪守单一主题，一篇面面俱到的论文也可以变得中规中矩，让所有人都接受。需要指出的是，“单一”这个词的意思比我们在这里所用的要多得多。一篇单一论文只涉及一个主题，与“XXX的历史”或者一本手册或者一本百科全书完全相反。从这个意义上来说，《中世纪作家的“颠倒的世界”这个主题》应该也是一个单一主题。它涉及许多作家，但全都是围绕一个具体的主题（从他们想象的假设到所举的例子，悖论和寓言，比如在天上飞的鱼，在水里游的鸟神马的）。看上去这是一个理想的单一主题。但事实上，为了写这样一篇论文，我们需要讨论所有与这个主题有关的作者，特别是那些没有得到公认的不知名作者。所以这个题目还是要被归在“具有单一主题的面面俱到式论文”中，它是很难写的，需要准备无数的材料。如果有人一定要写的话，我建议把题目改成《卡洛林王朝时期的诗人的“颠倒的世界”这个主题》，范围一缩小，我们就知道该到哪儿不该到哪儿去寻找材料了。当然，面面俱到的论文写起来更加有劲，毕竟花一两年甚至更长的时间研究一位作家显得很无聊。但是我们要明白，写一篇严格意义上的单一主题的论文并不意味着在视角上不能做到面面俱到。写一篇关于阿尔德科阿的小说的论文需要我们深入了解西班牙的现实主义，我们还需要读桑切斯·菲尔罗西奥或者加西亚·奥尔特拉诺，需要研究阿尔德科阿度过的美洲小说以及古典文学。只有把作者放到全景当中我们才能理解和诠释他。但是把全景用作背景和绘出一幅全景的图画是两回事。前者只是以一片田野和一条河流作为背景画了一幅骑士的肖像，后者则要画许多田野，山谷和河流。我们必须要改变技法，或者用摄影的术语来说，改变焦距。从单一作者的角度出发拍摄的全景是有点失焦的，不完整的和劣质的。最后我们要记住下面这个基本结论：范围越小，干起活来就越是省心和安心。单一主题由于面面俱到，论文看起来最好像是随笔，而不是历史或者百科全书。