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不一样的学校答辩制度也不一样.看不看没什么用.我上界的朋友和我说他们答辩的时候进去老师问2问题.问:吃饭了么?他答,吃了.问:想要多少分?他答,85就行.结果拿了85分........轮到我毕业时候答辩.问了将近半小时................哎~~~

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知网下载论文的方法如下:

一、工具/原料:

华为 Matebook 15、Windows 10、Chrome 、知网(网页)。

二、具体步骤:

1、百度检索“中国知网”。

2、打开中国知网后,将搜索方式设置为主题。

3、输入想要搜索的主题,按回车键进行搜索。

4、在显示列表中找到想要下载的文章,点击文章标题打开该网页。

5、在下方显示有两种下载方式,分别是“PDF 下载”和“CAJ 下载”。

6、如果下载 CAJ 文献,则必须在电脑中安装 CAJViewer 这款软件,依据个人电脑软件和喜好选择下载即可。

7、有的文献还支持 HTML 阅读,也就是在线阅读,这样就省去了下载步骤。

1.打开百度搜索引擎,输入“中国知网”进行搜索;2.点击中国知网的官网网站进入,打开网站;3.在首页搜索栏中选择不同的搜索途径,例如:主题、关键词、篇名、作者、单位、摘要等;4.确定搜索后,在搜索框里输入要搜索的内容,点击搜索按键;5.搜索结果出来后,可以在搜索页面进行年份、学科、下载数、作者等进一步缩小搜索范围;6.找到心仪的论文后,可以点击论文,选择论文下方的下载即可。

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幻灯片模板即已定义的幻灯片格式。PowerPoint和Word、Excel等应用软件一样,都是Microsoft公司推出的Office系列产品之一,主要用于设计制作广告宣传、产品演示的电子版幻灯片,制作的演示文稿可以通过计算机屏幕或者投影机播放;利用PowerPoint,不但可以创建演示文稿,还可以在互联网上召开面对面会议、远程会议或在Web上给观众展示演示文稿。随着办公自动化的普及,PowerPoint的应用越来越广

1、首先,PPT封面应该有:毕设题目、答辩人、指导教师以及答辩日期2、其次,需要有一个目录页来清楚的阐述本次答辩的主要内容有哪些;3、接下来,就到了答辩的主要内容了,第一块应该介绍课题的研究背景与意义;4、之后,是对于研究内容的理论基础做一个介绍,这版一部分简略清晰即可;5、重头戏自然是自己的研究内容,这一部分最好可以让不太了解相关方面的老师们也能听出个大概,知道到底都做出了哪些工作,研究成果有哪些,研究成果究竟怎么样;6、最后,是对工作的一个总结和展望。7、结束要感谢一下各位老师的指导与支持。下载精美的毕业论文答辩PPT模板,就到怪人网

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1、论文选题

毕业论文题目的选中并不是一下子就可以明确的.若挑选的毕业论文题目范畴很大,则写出去的论文内容较为裂缝,无法联系实际;而挑选的毕业论文题目范畴过度狭小,又无法搜索有关参考文献,会令人觉得找不到方向.针对毕业论文题目的明确,一般 能够采用先挑选出一个大的研究内容,再紧紧围绕该研究内容搜索参考文献,根据阅读文章、思索、分析材料慢慢把毕业论文题目范畴变小的方式。

2、论文原材料的搜集与梳理

根据搜集获得的原材料一开始没有必需都细读,能够先翻一翻文件目录或数据库索引,找到与论文论文题目相关或密不可分相接的章节目录。根据泛读,大概掌握本观点相关的科学研究现况和市场前景,防止反复他人的工作中。在这种全过程中,有几种事儿必须做:归纳出与毕业论文题目相关的科学研究现况,梳理出毕业论文提纲或大概构思,了解基础的论文格式与创作标准。

3、编写论文

在写论文时,有以下内容必须留意。一是留意语段与章节目录中间的思维逻辑。针对理学层面的论文还理应留意基础理论论述的气密性试验和专业知识的针对性,另外阐述应以观点为关键进行;二是毕业论文的论述宜客观性,一般选用第三人称描述,尽量减少应用第一人称;三是文章的描述要详略恰当,要留意防止反复。针对有创意、有争执的见解,则要讲透,决不能苛责墨笔。

以上给大家讲解的内容就是关于毕业论文写作的基本步骤,更多内容,欢迎关注本平台。

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研究思路、研究方法、技术路线和实施步骤

1、研究什么?——怎样确定研究课题

一切科学研究始于问题——问题即课题;教学即研究(掌握方法很重要,否则就不是研究);进步与成果即成长。

教育科研课题主要来源于两大方面:

A.实践来源——客观存在的或潜在的教育实际问题,教育教学实践本身存在的问题。

教育教学与其外部的矛盾(教师与家长、教师与学校、学校与社会、教育与社会发展)。

B.理论来源——现有教育理论所揭示的问题以及理论体系中的空白和矛盾点(例如《关于“信息技术与课程整合”的冷思考》一文产生的过程)

2、怎样进行研究课题的论证?

我们既然已选定了一个课题,我们就必须对这个课题的所有情况进行全面的了解。了解这个课题目前在国外、国内的研究情况,包括研究已取得的成果和存在的问题,了解这一课题所属的理论体系等等。对课题的全面了解,可以使我们在研究过程中少走弯路,确立研究的主攻方向,这就是我们常说的:“知己知彼,百战百胜”。

怎样对一个课题进行论证呢?论证一个课题主要是弄清如下几个问题:

A.所要研究的问题是什么性质和类型的问题?

B.要研究的问题具有什么现实意义?它的理论价值(即在理论上预计有哪些突破?)

C.要研究的问题目前已有哪些研究成果?研究的方向是什么?

D.要研究的问题所应具备的条件分析。

E.课题研究的策略和步骤如何?

F.课题研究的成果及其表现形式有哪些?

教育课题研究的基本方法有:

⑴ 观察法 ⑵ 调查法 ⑶ 测验法 ⑷ 行动研究法 ⑸ 文献法 ⑹ 经验总结法 ⑺ 个案研究法 ⑻ 案例研究法

⑼ 实验法(在一个课题研究过程中,根据不同的研究目的和要求,往往会用到两种以上方法)

观察法:为了了解事实真相,从而发现某种现象的本质和规律。

观察法的步骤:观察法的实施分为以下三个步骤,步骤之一就是进行观察研究的设计,此步骤可分为如下几个方面:

作大略调查和试探性观察。

这一步工作的目的不在于搜集材料,而在于掌握基本情况,以便能正确地计划整个观察过程。例如:要观察某一教师的教学工作,便应当预先到学校大致了解这位教师的工作情况,学生的情况,有关的环境和条件等等。这可以通过跟教师和学校领导人谈话,查阅一些有关的材料,如教案、教学日记、学生作业等,以及听课等方式进行。

确定观察的目的和中心。

根据研究任务和研究对象的特点,考虑弄清楚什么问题,需要什么材料和条件,然后作明确的规定。如果这规定不明确,观察便不能集中,结果就不能深入。观察不能有几个中心,范围不能太广,全部观察要围绕一个中心进行。如果必须要观察几个中心,那就采取小组观察,分工合作。

确定观察对象

一是确定拟观察的的总体范围;

二是确定拟观察的个案对象;

三是确定拟观察的具体项目。

比如,要研究新分配到小学任教的中师或大专毕业生在课余时间进行业务、文化进修的情况,那么,拟观察总体就是教师工作年限达一年或两年的新教师。在这一总体范围内,再定下具体观察哪几所小学,哪几个教研组中的哪些教师。具体观察名单确定以后,再把拟观察的时间、场合、具体观察项目确定下来。

制定观察计划

观察计划除了明确规定观察的目的、中心、范围,以及要了解什么问题、搜集什么材料之外,还应当安排观察过程:观察次数、密度、每次观察持续的时间,如何保证观察现象的常态等。

策划和准备观察手段

观察手段一般包括两种:

一种是获得观察资料的手段;一种是保存观察资料的手段。

获得观察资料的手段主要是人的感觉器官,但有时需要一些专门设置的仪器来帮助观察,如观察屏、计算机终端装置、更高级的如动作反应器等。这些仪器主要起两方面作用:保证观察的客观性与提高观察的精确性。

在保存资料的手段中,人脑是天然器官。但这种与观察主体连在一起的保存手段缺乏精确性和持久性,也不能实现资料的客体化。因此,人们先利用文字、图形等符号手段,进而又利用摄影、录音、录像等技术手段,把观察时瞬间发生的事、物、状况以永久的方式,准确地、全面地记录下来,供研究地反复观察资料和分析资料所用。

无论哪一类手段,都应在观察开始前就准备好,对观察中使用的种仪器也须事先作好功能检查,以保证在使用过程中不出现障碍。对于观察人员来说,必须掌握使用仪器的基本方法,并知道在观察中应做些什么。如要详细、全面拍摄一堂课,一部摄像机是不够的。观察者应准备几部摄像机,并事先作好分工。即使是作观察记录,也需要事先作好设计。在记录纸上印好以一定的格式排列的必须记录的项目,还可以约定一些记录符号,以尽量减少现场记录时书写文字的时间.

我们以中学生课堂行为记录为例,见表5-1。在下面表格中,研究人员根据研究需要,列出他认为在课堂上学生可能发生的行为。但估计所列不会完全,所以留出一些空格,让观察员在需要时使用。研究者如果要请别人帮助观察,必须事先和观察人员讲清楚每一个项目的具体所指,遇到意外情况的处理方法,要求他们熟悉每一个项目的所在位置。为了稳妥起见,还可以在正式观察前先作几次观察练习,帮助观察人员熟悉表格的内容;如发现表格的缺陷,可在正式观察前作出调整。

规定统一性标准

为了增加观察的客观性,为了便于衡量和评价各种现象,为了易于用数量来表达观察的现象,为了使观察结果可以核对、比较、统计和综合,必须事先考虑自己的观察可能涉及到的各种因素,并对每一因素规定出统一的标准。每次观察或观察同一现象的不同观察者,要坚持采用统一的标准去衡量。这主要在于,不同的研究项目常会涉及到不同性质的标准。如:有的涉及到单位问题,如怎样衡量学生表现的知识质量;有的涉及到定义问题,如怎样才算违反纪律;有的涉及计算方式问题,如怎样登记和表达学生之间产生的矛盾的频率,等等。对类似问题,都应事先做好统一规定。

逐段提出观察提纲

在观察计划的基础上,应对每次或每段(几次同一性质上一内容的观察组成一段)观察提出具体提纲,以便使观察者对每一次观察的目的、任务和要获得什么材料非常明确。观察提纲可以包括本次观察要解决的具体问题,并且应当在前一次观察的基础上,经过深思熟虑之后提出来。亦可采用表格的方式,以便于分类统计。

观察实际过程,加以分析研究,得出某种结论。也许可以形成某个研究课题。

调查法 :

同样是为了了解事实情况,分析事实情况,得出结论,证实某种问题,以便改进工作(包括改进研究方法)或形成新的研究课题。

包括问卷调查、访问调查等.。了解事实情况、分析情况、认真研究,得出结论,寻找解决办法或进一步研究的方案。

举例说明调查法的操作过程:

抽样调查的主要步骤

在实际的抽样操作中,整个过程可大致分为如下步骤:

1.确定调查的目的(确定问题,形成假说;通过调查验证假说,使问题明确化,得出结论)。

2.确定抽样总体。要从中进行抽样的总体应与要得到信息的总体(目标总体)一致。从样本得出的结论适用于被抽样总体,超出这个范围结论的适用程度取决于被抽样总体与目标总体的差异程度。

3.确定待收集的数据。一般只收集与调查目的有关的数据,过长的调查表会降低回答的质量。

4.选择抽样方法。这时总体中的哪种单位作为个体基本上可定下来。

5.编制抽样框。如学校名录、学生花名册等。

6.确定需要的精确度。因抽样调查是要由样本推断总体,会带有某些不确定性。一般是对相对误差或绝对误差作出概率水平上的要求。

7.估计样本容量,估计费用。

8.抽样试验,在小范围内试填一下调查表,做些必要的改进。

9.实地调查工作的组织。按抽样方案进行调查。对收回的调查表的质量及时进行检查。对不回答的表要有处理方案。

10.根据所用的抽样方法进行数据分析。

11.可对同样的数据采用其它的分析方法,以作比较。

12.写出调查报告。留存有关总体的信息,它们可能对将来的抽样起指导作用。

对于教育现象,有时难于进行严格意义上的概率抽样,可以考虑采用下列方法抽样:从总体中选出若干有代表性的大单位(群),在群内进行概率抽样;从一个小总体中选出接近于研究者对总体平均数的印象的那些个体;样本限于总体中易于取到的部分;样本是随便选取的;样本由自愿被调查的人员组成;等等。但对这样得到的样本要选择适当的数据分析方法,对结论也要慎重,应充分利用其它信息进行核查、确认。在教育现象的研究中,研究者的智恝、经验和抽样技术的有机结合,是获取好样本的关键。

测验法:

是想描述某些行为的状况,或推论某些行为的状况(包括:能力与成就,个性、兴趣、动机、态度、观念及心理需要等);从而考虑改建的策略或方案,或进一步形成新的研究课题。

在教育学和心理学中,测量被用作定量研究的重要方法。主要功能是评估、诊断和预测。(举例,如XXX老师所做的“学生自学能力测验(试验)”,就是为了了解小学中高年级学生的自学能力究竟能达到何种程度)。

所谓测量就是根据一定的法则,将某种物体或现象所具有的属性或特征用数字或符号表示出来的过程。测验法是教育和心理学测量的一项主要内容和形式。

测验的客观性是关于测验系统化过程好坏程度的指标。测验的控制,在不同时间对于同一个被试,或同一时间对于不同的被试,其意义都应该是相同的。保持刺激的客观性则要遵照一定的程序予以控制。(如周文琴老师在做这一测试前邀请我去在他们的家长会上的讲话,目的就在于排除和避免人为因素影响,排除测验的随意性和不真实性,实现评测标准的同一性)。

推论的客观性指对同一结果不同的人所做的推论应该一致,同一个人在不同的时间对同一结果的所做解释应该相同。

行动研究法:

行动研究法是一种适应小范围内教育改革的探索性的研究方法,其目的不在于建立理论、归纳规律,而是针对教育活动和教育实践中的问题,在行动研究中不断地探索、改进改进工作,解决教育实际问题。行动研究将改革行动与研究工作相结合,与教育实践的具体改革行动紧密相连。(特点是边执行、边评价、边修改)。

模式基本是:计划——行动——考察——反思(即总结评价)。教师个体比较适用。

另一种模式:预诊——搜集资料初步研究——拟订总体计划——制订具体计划——行动——总结评价

从上述行动研究法的几个步骤中可以发现三个明显的特征:

一是具有动态性,所有的设想、计划、,都处于一个开放的动态系统中,都是可修改的;

二是较强的联合性与参与性,研究者、教师、行政人员的全体小组成员参与行动研究法实施的全过程。

三是在整个研究过程中,诊断性评价、形成性评价、总结性评价贯穿于行动研究法工作流程的始终。

具体说说操作方法:

(一)预诊:这一阶段的任务是发现问题。对教学或学校工作中的问题,进行反思发现问题,并根据实际情况进行诊断,得出行动改变的最初设想。在各步骤中,预诊占有十分重要的地位。

(二)收集资料初步研究:这一阶段成立由教研人员、教师和教育行政人员组成的研究小组对问题进行初步讨论和研究,查找解决问题的有关理论、文献,充分占有资料,参与研究的人员共同讨论,听取各方意见,以便为总体计划的拟定做好诊断性评价。

(三)拟定总体计划:这是最初设想的一个系统化计划。行动研究法是一个动态的开放系统,所以总体计划是可以修订更改的。

(四)制定具体计划:这是实现总体计划的具体措施,它以实际问题解决的需要为前提,有了它,才会导致旨在改变现状的干预行动的出现。

(五)行动:是整个研究工作成败的关键。这一阶段的特点是边执行、边评价、边修改。在实施计划的行动中,注意收集每一步行动的反馈信息,可行的,则可以进入下一步计划和行动。反之,则总体计划甚至基本设想都可能需要作出调整或修改。这里行动的目的,不是为了检验某一设想或计划,而是为了解决实际问题。在行动研究中,过程性资料的搜集、整理也是非常重要的。

(六)总结评价:首先要对研究过程进行考察。考察内容有:一是行动背景因素以及影响行动的因素。二是行动过程,包括什么人以什么方式参与了计划实施,使用了什么材料,安排了什么活动,有无意外的变化、如何排除干扰。三是行动的结果,包括预期的与非预期的,积极和消极的。要注意搜集三方面的资料,背景资料是分析计划设想有效性的基础材料,过程资料是判断行动效果是不是、由方案带来和怎样带来的考察依据;结果资料是分析方案带来的什么样的效果的直接依据。考察要灵活运用各种观察技术以及数据、资料的采集和分析技术,充 分利用录象、录音等现代化手段。

总结评价实际上是对行动研究过程及其结果的“反思”。反思是行动研究第一个循环周期的结束,又是过渡到另一个循环周期的中介。这一环节包括:整理描述,评价解释,写出研究报告。这是对整个研究工作的总结和评价。这一阶段除了要对研究中获得的数据、资料进行科学处理,得到研究所需要的结论外,还应对产生这一课题的实际问题作出解释和评价。

经验总结法:

这是教师可以常用的方法。教育经验总结法是根据教育实践所提供的事实,分析概括教育现象,挖掘现有的经验材料,并使之上升到教育理论的高度,以便更好地指导新的教育实践活动的一种教育科学研究方法。关键是要能够从透过现象看本质,找出实际经验中的规律;从而更好地更加理性地改进自己的教学。进行教育经验总结要遵循以下基本要求:

一、要注意经验的 先 进 性(观念必须更新)

二、要全面考察总结的对象,充分占有原始的事实材料;且做到有“点”有“面”,“点”、“面”结合,防止以偏概全的片面性。

三、要以教育实践活动为依据,不能凭空想当然,那是毫无价值。

四、要善于进行理论分析

文献法:

分类阅读有关文献(包括文字、图形、符号、声频、视频等具有一定历史价值、理论价值和资料价值的材料),得出一般性结论或者发现问题,寻找新的思路。

文献按内容性质分,有零次文献、一次文献、二次文献和三次文献。零次文献是未经发表和有意识处理的最原始的资料。一次文献指直接记录事件经过、研究成果、新知识、新技术的专著、论文、调查报告等文献。二次文献是指对一次文献进行加工整理,包括著录其文献特征、摘录其内容要点,并按照一定方法编排成系统的便于查找的文献。三次文献是指工具书和在二次文献的基础上,又对众多一次文献的综合研究结果。

(这是清华开题报告写作的讲座,看完后有用请赞,收集整理有手打不容易,谢谢!)

你好!!!

科技论文是对创造性的科研成果进行理论分析和总结的科技写作文体。是报道自然科学研究和技术开发创新工作成果的论说文章,它是通过运用概念、判断、推理、证明或反驳等逻辑思维手段,来分析表达自然科学理论和技术开发研究成果的。而《科技论文写作》就是指导学生怎样撰写科技论文一门课程。现就小学完这门课程后的收获及感想作总结如下。关键词:科技论文;写作;规范;毕业论文。一.     课程主要内容科技论文是对创造性的科研成果进行理论分析和总结的科技写作文体。是报道自然科学研究和技术开发创新工作成果的论说文章,它是通过运用概念、判断、推理、证明或反驳等逻辑思维手段,来分析表达自然科学理论和技术开发研究成果的。本课程设置的目的与任务是培养学生科技论文写作能力,帮助大学生掌握即将面临的毕业论文写作规范,进一步引导学生梳理本专业的理论体系,选取自己感兴趣的专业方向,学会如何阅读消化文献、制定研究计划、进行研究结果分析,提高论文的写作水平,帮助学生提高科技论文写作的专业素质。科技论文写作课,主要是针对本科学生开设的一门语言工具课程,主要讲授科技论文的特点、作用,科技论文写作过程中的选题、资料检索、表达方式及语言的运用、科技创新思维以及学术论文的写作与发表,学位论文的写作与答辩等内容。老师给我们讲述的课程共分为科技论文的分类;科技论文的常见结构;科技论文写作的一般性方法;科技论文写作中的一些基本道德规范等几个版块。具体内容为:1.科技论文的概念和分类(学术性论文;技术性论文;学位论文;其他);2.   科技论文写作与发表的方法步骤、注意事项及意义(科技论文基本结构及总体要求;如何突出重点、先进点;科技论文写作程序;标题的写法;作者署名的意义、条件及格式;关键词的意义及写法;摘要的写作方法;英文标题、英文摘要的写作;引言的些技巧;学术类论文正文的层次结构;技术类论文正文的层次结构;针对仿真实验的写作手法;结论写法要求;辅文部分的写法;参考文献的运用及其著录规则;综述类论文的写作思路;自然科学学位论文的写作;插图的处理及技巧;表格的处理及技巧等);3 科技论文的特点和写作要求(科技写作的科学性;科技写作的专业性;科技写作的实用性;科技写作的规范性;科技写作的可读性); 4 科技论文规范表达的概念与作用(数学符号的有关规定;量的有关规定;关于单位与词头的使用方法;关于数字用法的规定;部分下标符号等)。其中,重点讲述了综述格式和写作方法,开题报告的写法,毕业论文的写法,实验结果记录的处理,文献的检索,专利的申请方法等。并对论文中作者署名,作者联系方式,摘要,关键词,前言,正文,总结,参考文献等的规范要求作了详细的讲解。二.     学习心得《科技论文写作》这门课已经结束,在此谈一下个人学习心得。上面已经说到,《科技论文写作》主要是针对本科学生开设的一门语言工具课程,主要讲授科技论文的特点、作用,科技论文写作过程中的选题、资料检索、表达方式及语言的运用、科技创新思维以及学术论文的写作与发表,学位论文的写作与答辩等内容。所以对我们本科生而言是极为实用的,也是极为重要的,正如一位科学工作者所说:"我们为什么需要在写作上如此认真努力 原因很简单.一个研究结果只有在被别人使用时才有意义.而想被别人使用,文章必须能引起其他科学家的兴趣,而且得保证其他人能看懂并可以重复和再现你的结果.只有可以被理解的研究才会被重复,也只有可以被再现的工作才能导致别人的引用和跟踪.而你的论文被引用的数量常常用来衡量研究的影响力.从某种角度看b, 写作就像是把你的工作成果推销给其他的科学家."学习了这门课程,我感觉自己在以下三个方法的水平得到了提高:知识方面:通过本课程的学习,掌握科技论文写作的基本原则及常用方法;掌握将试验研究结果加工整理为符合规范要求的科技论文的方法;掌握论文摘要、正文和参考文献的写作技巧,等等。能力方面:通过课程教学,提高进行科技论文写作的能力;具备将试验研究结果加工整理为符合规范要求的科技论文的能力,以及具备科技论文编辑的基本能力等。素质方面:通过课程教学,培养了严谨求实、理论联系实际的科学态度;培养了独立地获取知识和综合运用知识的能力;培养了分析问题和解决问题的能力;提高了综合素质。以上就是我关于《科技论文写作》这门课程的学习心得。这门课程知识性强但趣味性低,虽然比较沉闷,但我们的任课老师王老师很照顾我们的情绪,时不开点小玩笑,弄点小幽默,总体上来说整个授课过程还不算“痛苦”。在此感谢我们的任课老师王华磊老师!三.     对课程的建议该门课程已经结束,现在就个人想法提一些建议:首先,讲课与讨论相结合。对一般的知识、概念、公式推导过程引导学生自学掌握。采用以学生为主的启发式、交互式、讨论式的教学方法,调动学生主动参与课堂,在课堂上动脑思索、动口表达,培养学生的学习能力和思维方法。其次,随着毕业的临近,这门课程应该有更强的针对性,把主要指导放在学生毕业论文(学位论文)这一块上。比如多讲解一些写论文需要掌握的东西,如何撰写开题报告、制作毕业论文ppt等。展示一些历年毕业生的论文范文,评析优点和不足。给学生一些实验数据作材料,尝试按毕业论文规范要求撰写论文,然后由老师批改。我想这样同学们在写毕业论文时就不会象无头苍蝇一样,无从着手了。

希望能够帮助你!!!

先明确写什么题材的论文,然后去查资料,在资料基础上,进行论文章节的提炼,论文一般包括:前言内容,就是对这篇文章的起因、大致内容进行一下概述。然后是正文现状、原理、然后是试验或者详细的论证、如果是有试验的,要有试验结果分析,最后是结论或结束语。 3000字以上才算论文吧,太短了说不清楚问题。 我本身就是负责期刊论文的编审(企业里面兼管这方面的业务)。大侠在线2010年12月2日

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这些论文主要是研究科学的起源,还有宇宙的奥秘,人类的进步,还有一些生物的基因等等。

《激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用》摘要激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图象分析仪器,现已广泛应用于荧光定量测量、共焦图象分析、三维图象重建、活细胞动力学参数监测和胞间通讯研究等方面。其性能为普遍光学显微镜质的飞跃,是电子显微镜的一个补充。本文以美国Meridian公司的ACASULTIMA312为例简要介绍了激光扫描共聚显微镜系统的结构,功能和生物学应用前景。关键词激光;共聚焦显微镜;粘附细胞分析与筛选(ACAS)TheLaserScanningConfocalMicroscopySystemanditsBiologicalApplicationsChenYaowen,LinJielong,LaiXiaoying,MeiPinchao()AhstractTheLaserScanningConfocalMicroscopyisanewmedicalimageanalysisinstrument,(MeridianCo,USA)istakenasanexampletointroducetheprincipleofconfocalmicroscopy,(ACSA)激光扫描共聚焦显微镜(LaserscanningConfocalMicroscopy,简称LSCM)是近代生物医学图象仪器的最重要发展之一,它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置,使用紫外光或可见光激发荧光探针,利用计算机进行图象处理,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象,以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域[1、2、3],对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性,为这些领域新一代强有力的研究工具。创建于1983年的美国Meridian公司,在90年代推出的“激光扫描共聚焦显微镜”这一项具有划时代的义意的高科技产品,曾获得美国“政府新产品奖”和两次“高科技领先技术奖”,它能达到每秒120幅画面的高速扫描激光共聚焦观察,可提供实时,真彩色的激光共聚焦原色图象。我院最近引起的ACASuLTIMA312是Meridian公司最新的高科技产品,为同类仪器中档次最高、功能最全的精密仪器。现以该仪器为例介绍激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用。1、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成有关共聚焦显微镜的某些技术原理,早在1957年就已提出,二十年后由Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜[5],1985年WijnaendtsVanResandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章,到了1987年,才发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。激光扫描共聚焦显微镜成像原理如图1所示,激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜,变成一束直径较大的平行光束,长通分色反射镜使光束偏转90度,经过物镜会聚在物镜的焦点上,样品中的荧光物质在激光的激发下发射沿各个方向的荧光,一部分荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚焦透镜、会聚在聚焦物镜的焦点处,再通过焦点处的针孔,由检测器接收。从图1中可以看出,只有在物镜的焦平面上发出的荧光才够到达检测器,其它位置发出的光均不能过针孔。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上,因而称这种方式成像的显微镜为共聚焦显微镜为共聚显微镜。在成像过程中针孔起着关键作用,针孔直径的大小不仅决定是以共聚焦扫描方式成像还是以普遍学显微镜扫描方式成像,而且对图像的对比度和分辨率有重要的影响。ACASULTIMa312采用快速镜扫描或台阶扫描对样品逐点扫描成像,由于样品中不同的扫描点始终在物镜和会聚透镜的光轴上,因而它以相同的信噪比扫描整个样品,扫描精度达μm,扫描面积最大的为10cm×8cm,当激光逐点扫描样品时,针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像,并将之转化为数字信号传输至计算机,最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚聚焦图像。一个微动步进马达控制栽物台的升降,使焦平面依次位于标本的不同层面上,可以逐层获得标本相应的光学横断面的图像。这称为“光学切片”。再利用计算机的图像处理及三维重建软件。可以得到高清晰度来表现标本的外形剖面,十分灵活、直观地进行形态学观察。2、激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统硬件及参数指标 激光光源:氩离子激光(50mW的紫外光、999mW的可见光),能同时/顺序/分别输出紫外光和可见光,激发波长为351-364nm;488nm;514nm。 计算机系统:80586/133MHzPCI/80MBRAM/2000MBSCSI硬盘/150MBBernoulli盘驱动器/17’’大屏幕显示器。 共聚焦系统:计算机自动控制光路准调节;计算机控制孔径校准;计算机调节孔径大小;自动Z轴调节(最小μm)。 光学探测系统:3个测窗式PMT采集荧光;1个CCD系统;12位的高速A/D转换器。 图像分辨率:图像大小1535×1535;像素最小距离:μm;灰度为4096级。 扫描方式:快速镜扫描DualScan台阶扫描;扫描精度μm;扫描面积最大为10cm×8cm;扫描平面:XY和XZ和独特点、线、面扫描。激光扫描共聚焦显微镜软件系统ACASULTIMa312系统采用独特设计的软件将激光细胞仪与先进的计算机技术结合,产生快速、高效、灵活的操作系统,完备的数据采集、分析与管理功能。基于生物医学研究有如下的软件。ImageAnalyze—对于单色、比色和三色标记的二维荧光图像的定量分析,可产生透射光图像重叠,同时AutoImage可多个区域的自动扫描和荧光定量,以及相同区域的时间顺序扫描。 RatioAnalysis和Kinetics—测定细胞内的离子变化,可有点扫描、线扫描及图像扫描三种测定形式,以监测各种速率的生物反应。 Cell–CellCommunicationandFRAP-相邻细胞的FRAP分析。该软件首先用可光淬灭特异的细胞荧光,然后在多个时间点扫描,此扫描可对单一区域或细胞的多个选择区域,可产生透射光图像并与其它图像重叠。 CellList—储存被选择细胞的位置,即可自动对较大样品进行扫描,又可产生较小样品特异部位的网络位置表,以进行自动的测量、筛选和重复测定。 CellSorting—ACAS具备如下四种分选方式: AblationSort:预选定义一个荧光阈值,然后对特定细胞杀伤。②CookieCutterSort在用户定义的中心点四周切割Cookies。③QuickSort:对已定义的细胞表列,用Ablation或CookieCutter作分选。④ManualSort:直接使用鼠标控制载物台位置及激光脉冲,并杀灭和分选细胞,进行细胞显微外科,染色体切割和光隐阱等操作。 ConfocalImaging—共聚焦分析,可实现Z轴定量,三维立体图像分析(包括SFP模拟荧光处理法,DP深度投影法和SP文体投影法),以及视点移动动画。3激光扫描共聚焦显微镜在细胞生物学中的应用定量荧光测量ACAS可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶酶体,线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定,还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外,还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定,这种定量可以准确监测抗原表达,细胞结合和杀伤及定量的形态学特性,以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。定量共聚焦图像分析借助于ACAS激光共焦系统,可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片,从而得到各层面的信息,三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化,如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等,亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。三维重组分析生物结构ACAS使用SFP进行三维图像重组,SFP将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像,并可从任意角度观察,也可以借助改变照明角度来突出其特征,产生更生动逼真的三维效果。动态荧光测定Ca2+、pH及其它细胞内离子测定,利用ACAS能迅速对样品的点,线或二维图像扫描,测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率,使用诸如Indo-1、BCECF、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率,能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应,以及使用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。荧光光漂白恢复(FRAP)--活细胞的动力学参数荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域,从而造成该区域荧光分子的光淬灭,该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散,可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过ACAS可直接测量分子扩散率、恢复速度,并由此而揭示细胞结构及相关的机制。胞间通讯研究动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯,测量由细胞缝隙连接介导的分子转移,研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用,以及胞内Ca2+,PH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。细胞膜流动性测定ACAS设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后,其发射光极性依赖于荧光分子的旋转,而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性,因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点,温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。笼锁—解笼锁测定许多重要的生活物质都有其笼锁化合物,在处于笼锁状态时,其功能被封闭,而一旦被特异波长的瞬间光照射后,光活化解笼锁,使其恢复原有活性和功能,在细胞的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用ACAS可以人为控制这种瞬间光的照射波长和时间,从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。粘附细胞分选ACAS是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学仪器,它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法:(1)Coolie-CutterTM法,它是Meidian公司专利技术,首先将细胞贴壁培养在特制培养皿上,然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何形状,而非选择细胞则因在八角形之外而被去除,该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞,即使百万分之一机率的也非常理想。(2)激光消除法,该方法亦基于细胞形态及荧光特性,用高能量激光自动杀灭不需要的细胞,留下完整活细胞亚群继续培养,此方法特别适于对数量较多细胞的选择。细胞激光显微外科及光陷阱技术借助ACAS可将激光当作“光子刀”使用,借此来完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体、溶酶体等细胞器、染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞外科手术。通过ACAS光陷阱操作来移动细胞的微小颗粒和结构,该新技术广泛用于染色体、细胞器及细胞骨架的移动。4、结语激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图像分析仪器,与传统的光学显微镜相比,大大地提高了分辨率,能得到真正具有三维清晰度的原色图象。并可探测某些低对比度或弱荧光样品,通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量Ca2+、pH值,Na1+、Mg2+等影响细胞代谢的各种生理指标[9],对细胞动力学研究有着重要的意义。同时激光扫描共聚显微镜可以处理活的标本,不会对标本造成物理化学特性的破坏,更接近细胞生活状态参数测定。可见激光扫描共聚焦显微镜是普遍显微镜上的质的飞跃,是电子显微镜的一个补充,现已广泛用于荧光定量测量,共焦图像分析,三维图像重建、活细胞动力学参数分析和胞间通讯研究等方面,在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。ReferencesKingRG,DelancyPM,Confocalmicrodcopyinpharmacologica;Rescsrch,TrendsinPharmacol,Sci,1994,15:(8):(3\4):71-79(inChinese)PloemJs,(3):191-198(inChinese)YuLifang,3-Dimecsionalrestructionofhumanglomerularcellswithlaserscanningconfocalmicroscopy,CHNESEJOURNALOFMEDICAL,TEST,1995:18(4):229-231MinskyM,

据央视新闻报道,北京时间7月9日凌晨,美国加利福尼亚大学洛杉矶分校(UCLA)副教授吴梦婷获得美国国家科学院年度科学家奖(MNP Grimes),这是该奖项设立以来,首位中国女性获奖者。奖金100万美元,以表彰其在该领域的杰出贡献。获奖人吴梦婷获得一项新的科学成就。据介绍,获奖理由为“她是在利用 DNA序列鉴定疾病机制上做出贡献的女性”。

这些论文主要研究了什么?与我们生活息息相关呢?目前已知的三种肿瘤类型分别为:前列腺癌、乳腺癌)、肺癌。这是因为它们都与人体中的 DNA被翻译后发生改变从而导致疾病。但最近的研究发现:癌症的病理机制仍然不清楚,因为它们会“沉默”。此外,癌症和遗传也有关系。”吴梦婷介绍说,她做过研究发现细胞对人体非常重要。

细胞是由多种类型的细胞组成的,在分化过程中,不同模式的细胞会形成不同样子的膜结构、核质结构和功能,也会发生形态和其他变化。例如干细胞会有一些不一样的形态,有的可以是单核一样多细胞也有多个细胞核。当身体出现问题的时候,肿瘤就会生长。吴梦婷说:“因为你把它想象成一棵树没有叶子、没有花骨朵和果实的样子。

因为在这种环境下不可能长出任何一棵树和树木来帮助生长或为你治病,所以它会影响什么。但现在有一个奇怪的现象,因为每个人的身体中都存在不同大小的细胞,它们共同组成了一个生态系统。如果有错误,那么健康就会受到影响:例如吸烟会影响到肺功能以及心血管系统等等。”从一开始她就意识到需要多个方面保护细胞,它们才能维持正常发育等各个方面。。这是一个细胞分化过程中发生一些改变的问题。

主要研究了剪接体和RNA剪接的分子机理。白蕊是世界上唯一一个捕获全部类型剪接体团队的核心人员,她曾凭借自己的学习和研究发了6篇Science,还有3篇Cell,含金量满满的顶刊论文真令人佩服。

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