关于毕业论文参考文献，首先,文献类型不同,其著录方式不同;其次尽管不同的文献类型，著录方式不同 ,但基本上分为三个部分,分别是:(1)参考文献的作者;( 2 )参考文献的名称和文献类型;(3)参考文献的出版信息。第一类专著、论文集、学位论文、报告等文献类型的著录方式:[序号]主要责任者.文献题名[文献类型标识9].出版地:出版者,出版年,起止页码a (任选) 。第二类是期刊文章,其著录格式如下:[序号]主要责任者.文献题名[].刊名,年，卷(期) :起止页码。期刊文章是使用最多的文献类型,它的著录也包括着作者、文献名称及类型、出版信息三部分内容。第三类是会议论文集,其著录格式如下:[序号]析出文献主要责任者.析出文献题名[A].原文献主要责任者(任选) .原文献题名[C].出版地:出版者,出版年.析出文献起止页码。
我们写论文中的“参考文献”又叫参考书目，根据我自己写论文的经历来看它的意思是指我们在撰写毕业论文过程中所查阅参考借鉴过的著作和报刊杂志等等一些资料，然后把它标注在在毕业论文的末尾。
一、那论文的参考文献具体是指什么呢？
二、我们在引用参考文献时需要注意什么呢？
三、我给大家讲一下参考文献格式：
1、参考文献和注释。按论文中所引用文献或注释编号的顺序列在论文正文之后，参考文献之前。图表或数据必须注明来源和出处。
[编号]、作者、文章题目、期刊名(外文可缩写)、年份、卷号、期数、页码。
[编号]、作者、书名、出版单位、年份、版次、页码。
2、附录。包括放在正文内过分冗长的公式推导，以备他人阅读方便所需的辅助性数学工具、重复性数据图表、论文使用的符号意义、单位缩写、程序全文及有关说明等。
[M]——专著,著作
[C]——论文集(一般指会议发表的论文续集，及一些专题论文集，如《xxx大学研究生学术论文集》
[N]—— 报纸文章
[J]——期刊文章：发表在期刊上的论文，尽管有时我们看到的是从网上下载的(如知网)，但它也是发表在期刊上的，你看到的电子期刊仅是其电子版
[D]——学位论文 ：不区分硕士还是博士论文
[R]——报告：一般在标题中会有"关于xxxx的报告"字样
[S]—— 标准
[P]——专利
[A]——文章：很少用，主要是不属于以上类型的文章
[Z]——对于不属于上述的文献类型，可用字 母"Z"标识，但这种情况非常少见
[DB/OL] ——联机网上数据(database online)
[DB/MT] ——磁带数据库(database on magnetic tape)
[M/CD] ——光盘图书(monograph on CDROM)
[CP/DK] ——磁盘软件(computer program on disk)
[J/OL] ——网上期刊(serial online)
[EB/OL] ——网上电子公告(electronic bulletin board online)
很显然，标识的就是该资源的英文缩写，/前面表示类型，/后面表示资源的载体，如OL表示在线资源。
四、经验总结
我们在写论文的时候，尤其是我们的毕业论文，说多了都是泪呀，这都是根据我自己当年写毕业论文的血泪史，总结出来的结论参考文献有三个好处：
参考文献类型及文献类型，根据GB3469-83《文献类型与文献载体代码》规定，以单字母方式标识:
专著M;报纸N;期刊;专利文献P;汇编G;古籍O;技术标准S;
学位论文D;科技报告R;参考工具K;检索工具W;档案B;录音带A;
图表Q;唱片L;产品样本X；录像带V；会议录C；中译文T；
乐谱l;电影片Y;手稿H;微缩胶卷U;幻灯片Z;微缩平片F;其他E。
参考文献(即引文出处)的类型以单字母方式标识，具体如下:
M——专著C——论文集N——报纸文章
J——期刊文章D——学位论文R——报告
毕业论文的参考文献格式一般遵循国际通用的APA（American Psychological Association）格式，具体要求如下：1. 文献信息顺序：作者、出版年份、文章题目、期刊名称、卷号、期号、页码。2. 文献类型：包括期刊文章、书籍、会议论文、网站等。3. 作者格式：最多列出7名作者，若超过7名，则列出前6名作者，后跟“et al.”。4. 文章题目格式：仅首字母大写，加上句号。5. 期刊名称格式：仅首字母大写，加上逗号。6. 卷号和期号格式：卷号加上期号，用括号括起来，中间用逗号隔开。7. 页码格式：用pp.表示，不需要加上“页”或“p.”。8. 网络资源：需注明获取日期和URL地址。下面是期刊文章、书籍、会议论文、网站的参考文献格式示例：期刊文章：作者. (出版年份). 文章题目. 期刊名称, 卷号(期号), 页码.书籍：作者. (出版年份). 书名. 出版地点: 出版社.会议论文：作者. (出版年份). 论文题目. 在编者姓名(Eds.), 会议论文集名称(pp. 页码). 出版地点: 出版社.网站：作者. (发布年份). 文章题目. 网站名称. 检索日期, 来源网址.需要注意的是，参考文献格式应该按照规范要求进行，不同类型的文献应该采用不同的格式，同时也要注意参考文献的排序和标点符号的使用。
1、文科专业“参考文献”的表述格式（1）文科专业毕业论文必须列出不少于5种以上的参考文献。该参考文献用以说明论文写作的背景资料。（2）文科专业毕业论文的参考文献置于论文正文之后，单独成页排版。（3）“参考文献”四个字用宋体小三号加黑打印，顶格。其他所列的具体参考文献转行空两格排版，用宋体小四号，不加黑。（4）参考文献的具体表述格式与上述论文注释中的格式一致，只是对于著作，不用列出页码。2、理工科专业毕业论文（设计）参考文献的表述格式（1）按照理工科学术研究的习惯，其毕业论文（设计）参考文献主要用于注明论文（设计）中所参考文献的来源。作者对论文（设计）中某观点或概念的说明，也置于参考文献中进行。统一采用尾注（文末注）的形式。（2）理工科专业毕业论文（设计）参考文献依次采用［1］、［2］、［3］……的序号。（3）理工科毕业论文（设计）参考文献各项内容的表述顺序为(下列各类参考文献的各项内容不得缺省)：a.参考专著的：作者.著作题名.出版地：出版者，出版年:页码号.b.参考期刊文章的：作者.文章题名.刊名，年，卷(期):页码号.c.参考论文集中的论文的：论文作者.论文题名.论文集主编者.论文集题名.出版地：出版者，出版年:页码号.d.参考报纸文章的：作者.文章题名.报纸名，出版日期(版次).e.参考外文版专著、期刊、论文集、报纸等：按照上述顺序用原文表述各项内容，切忌中文与外文混用。
建筑学毕业论文参考文献大全
接地气的大学生活即将结束，毕业论文是每个大学生都必须通过的，毕业论文是一种的检验学生学习成果的形式，怎样写毕业论文才更能吸引眼球呢？以下是我精心整理的建筑学毕业论文参考文献，仅供参考，大家一起来看看吧。
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附 ：建筑学毕业论文选题
1、室内外气温对建筑围护结构吸收太阳能的影响
2、鲁西南地区门墩石造型、纹样初探
3、室外气温和保温层位置对间断供暖房间能耗特征的影响
4、极少主义室内光环境设计研究
5、建筑工程项目成本控制研究
6、老年人建筑的自然光环境设计初探
7、杨凌城市色彩景观规划研究
8、襄城县古城墙遗址保护公园规划设计
9、光导管照明系统的配光及应用研究
10、BIM技术在钢结构工程建设阶段的应用
11、民营建筑企业项目团队核心利益相关者冲突管理研究
12、市政工程项目责任成本管理应用研究
13、长春七天酒店（火车站店）装饰工程的成本管理研究
14、国学中心项目施工成本控制研究
15、黑龙江移动枢纽楼建筑工程项目的成本控制研究
16、呼和浩特市建筑勘察设计研究院发展战略研究
17、包头市A装饰公司发展战略研究
18、南京国际金融中心续建工程项目成本控制研究
19、国有施工单位材料采购管理研究
20、基于互联网+的PMIS的运维管理研究
21、建发集团观澜丽景二期项目工程造价管理研究
22、俄侨文化影响下的中东铁路建筑及其历史价值研究
23、建筑艺术表现在房地产经营销售策略中的应用研究
24、吉林鼎鑫路桥建设有限公司发展战略研究
25、湘黔古镇聚居文化和建筑空间形态研究
26、“营改增”对建筑企业税负影响分析
27、BIM在建筑工程管理中的应用研究
28、基于FIDIC合同条件的承包商索赔研究
29、基于分项计量的空调系统能耗诊断的实用研究
30、基于VE工程项目成本控制的研究与应用
31、建筑施工项目安全文化建设研究
32、太阳能-空气源热泵系统在独立式住宅中的应用研究
33、青岛地区农村钢结构住宅热桥的热工分析
34、英谈村历史建筑保护与利用研究
35、我国建筑业营改增相关问题研究
36、延长油田中心化验室项目成本管理研究
37、低气压下噪声环境对人体舒适感影响机理的研究
38、青岛市住宅建筑室内热环境的实测与研究
39、晋鲁地区民居烟囱的建构技术与文化意义研究
40、挣值法在中铁一局二公司项目成本控制中的应用研究
41、我国工程承包企业进入国际市场的对策研究
42、冯坪办公楼项目工程造价管理与控制研究
43、ZHGY集团管道安装项目预算控制研究
44、延长石油南区采油厂办公楼建设项目成本管理研究
45、NK集团土地整理项目的成本管理优化研究
46、延长油田崖里坪住房小区工程项目成本管理研究
47、基于公司战略的建筑企业多项目管理研究
48、注册造价工程师诚信评价体系研究
49、HCE集团项目成本管理研究
50、K公司固定资产质量评价及优化对策研究
51、基于BIM的框架结构参数化设计研究
52、智能型太阳能LED路灯控制器的研究
53、青岛里院建筑保护与改造模式研究
54、基于博弈分析的绿色住宅发展研究
55、青岛市大型公建能耗现状评估与预测研究
56、符合被动式围护结构热工标准的“抬梁式”农村住宅构造方法研究
57、我国新型建筑工业化发展制约因素及对策研究
58、基于可操作性目标的城市色彩设计方法研究
59、基于BIM的规则建立在建筑设计阶段应用研究
60、建设工程网上招投标系统的研究与设计
61、工程招投标中违规行为分析与监督机制完善
62、BIM技术在工程项目全寿命周期成本管理中的应用
63、商品房住宅项目成本管控的研究
64、以“美居购”网为例探析家居软装电子商务经营
65、建筑行业新生代农民工的劳动权益保障问题研究
66、“营改增”对建筑业税负影响分析及对策
67、北方寒冷地区农村住宅保温结构一体化设计研究
68、北戴河新区国家级绿色建筑示范区创建研究
69、河北省建材产业物流指数研究
70、挣值法用于建筑工程成本控制的研究
71、高层住宅小区风环境数值模拟研究
72、绿色建筑运营阶段隐性成本估算模型研究
73、基于系统动力学的工程项目人工成本优化研究
74、工程项目供应链材料采购成本系统动力学仿真研究
75、高温影响的舒适度模型研制及在我国南方城市的应用
76、唐华清宫景区气候适宜性空间格局初探
77、施工现场建筑工人作业疲劳的影响因素研究
78、基于热管置入式墙体的小型建筑能耗数值分析
79、中铁咨询集团公司财务与资本运营子战略研究
80、某公司可持续发展的实践研究
81、ZH公司CM科技园项目成本管理研究
82、风险理论在工程安全监理实践中的应用研究
83、某研发中心与产业基地可行性研究
84、中铁工程设计咨询集团发展战略研究
85、青岛中山路商业街历史建筑保护修复研究
86、某市建筑节能检测平台建立与运行维护研究
87、基于BIM技术的建筑性能辅助商品房定价
88、建筑企业隐性知识转移影响机制研究
89、建筑施工企业工程质量诚信体系建设研究
90、现代建筑空间与水要素研究
91、算量软件在建筑工程上的应用及问题探讨
92、政府项目代建制合同管理体系研究
93、建筑企业工程项目管理信息化探讨
94、建筑供应链环境下的材料联合库存优化研究
95、建筑材料“暴露”手法在建筑空间设计中的应用研究
96、虚实相生对空间意境营造的作用机制研究
97、基于Matlab对DEA工程建设项目评标模型的应用研究
98、西方文艺复兴绘画名作中建筑图景及其历史价值研究
99、房地产开发项目成本控制研究
100、建设工程合同信用对合同管理绩效的影响研究
附：建筑学研究生毕业论文
摘要：在今天的企业施工过程中，为了保证工程的效率性，做好建筑工程质量监督的工作是很有必要的。合理地制定建筑工程质量监督的条约，加大监督的管理力度，将工程的质量问题放在首要位置，保证了建筑本体的安全性，也体现了以人为本的思想。本文针对建筑工程质量方面缺乏的相关法律条例、建筑企业质量监督的态度浅薄以及监督人员的专业素质差异过大进行讨论，根据此情况对提高工程质量的监督能力、加强施工单位的监督作用以及提高管理人员的综合素质提出几点看法和建议，也希望政府能够大力发挥宏观调控的作用，使建筑工程的质量问题得到有效根治。
关键词：建筑工程;质量监督;难题;管理方式
由于我国的经济发展迅猛，刺激了城市化进度的加深，作为城市化标志之一，建筑工程在不断发展的同时，也带来了一些质量监督方面的问题。对此，国家与建筑业相关部门开始对建筑工程的质量问题进行深究。经过一段时间的努力，各方面的尽力配合，积极响应国家的号召，使得建筑工程的一些管理模式得到优化，也成功解决了一部分难题，但是对于日益增多的建筑工程项目来说，这些措施还是远远不够的。所以，在我们保持关注建筑工程质量监督问题的基础上，对于在工程进行中出现的问题进行理解和归纳，总结出一套完善的管理体系，保证建筑工程施工质量的安全性，也对建筑工程的健康发展起到了至关重要的'作用。
一、建筑工程质量监督存在的难题
(一)相关的法律法规不够健全
当前我国建筑工程质量监督的能力还有待提高，是因为没有一个完整的体系去制约建筑工程中出现的质量问题，而一部分的法律政策太过片面，监督力度明显不足以约束一个庞大的建筑工程。所以，在进行建筑工程项目时，如果施工方不遵守规定，在施工质量上大打折扣，那么对于这种情况也没有一个专门细致的惩处管理条例。为了改善这种不良环境，我国应该针对具体情况做出相应措施，完善建筑工程质量监督的相关法律，政府在宏观上加大对工程的监督力度，一个官方的、完整的约束条例对于建筑工程的需要来说，已经是迫在眉睫。
(二)建筑企业质量监督的态度浅薄
建筑工程质量监督的管理之所以疏松，其中一个原因就是负责监督的企业专员对待质量监督没有一个积极的态度，缺乏监督的意识，这样一种不负责任的工作态度对于建筑工程的质量产生了极坏的影响，相关的工作无法进行。同时，企业部门对于这种消极的影响也放任不管，一个工程项目的整体都缺少相关的监督措施，导致监督体制最终只是一个可有可无的形态，使得建筑工程质量监督的管理力度越来越小，也就无法保证工程的效率。
(三)监督人员的素质差异过大
从某个方面来讲，负责质量监督的人员素质也决定了建筑工程质量监督能否有效开展。在今天，一些工程项目中安排了专门的人员进行质量监督，但是这些监督人员的专业素质有高有低，在面对质量问题时，一些人会严把大关，另一些人可能会有所放松，这种情况使得政府的监督工作无法继续进行。所以，如果负责建筑工程质量监督的人员素质过低，不仅难以保证建筑工程的质量，也会使得政府的监督力度大打折扣。
二、建筑工程质量监督的管理方式
(一)制定建筑工程质量监理制
工程质量监理制度的实行，能够大大加强建筑工程质量监督的力度，对于工程的正确实施有着推动作用。所以，政府在大体方向上监督的同时，也要加强建筑工程监理制的规划，使得建筑工程监理制得以健全自己的形势内容，而且把监理制合法化，加强负责建筑工程质量监督工作者的认真态度，使这些工作者负责的工程项目与法律挂钩，一旦玩忽职守就意味着违法。对于建筑工程质量监理的专门人员要进行精挑细选，这些人在工作时一定要遵守工程项目的监理机制，确保工程项目的顺利进行。
(二)加强对设计单位和设计人员的监督力度
建筑工程里许多的组合因素中，设计方案的可行性有着至关重要的作用。所以建筑工程在正式开工前，对于设计人员的来历要有一个细致的了解，对于指派他的企业或者组织要进行深刻的调查，确保人员的选择没有问题。然后，对于设计人员提交的设计方案进行仔细研究，多次检查其合格性，一旦发现任何不妥之处立刻要求其做出修改，保证设计方案的正确性、完整性，对建筑工程起到决定的作用。
(三)提升管理人员的综合素质
在建筑工程质量监督中，相关的工作者综合素质必须要高，对于工程质量要时刻进行监督，才能使建筑工程质量监督的方针得到有效实行。但是，相当一部分企业只把重点放在怎样获取较高的经济利润上，忽视了建筑工程的质量，使得建筑工程没有得到相应的保护措施，其中产生的许多问题在未来更加难以解决。所以，企业在挑选管理人员时要制定相应的选拔规则与制度，对于施工人员也要仔细选择，确保每一个工作位置都要有任务、有效率地进展，对建筑工程质量监督人员定期开展相关知识方面的工作，加强管理人员的质量监督意识，使他们认识到监督的重要性，提升管理人员的素质，为建筑工程的顺利实施提供有力保障。
三、结语
通过以上几大方面可知，完善建筑工程质量监督的体系对于建筑工程来说是势在必行的，但是在实施的过程中有着较多的阻碍因素，这些因素分散于各个施工单位或者个人，如何集中这些因素并进行妥善处理是建筑工程质量监督的一大难点。所以负责工程质量监督管理的相关工作者要处理好自己的工作重心，对于工程项目中实行的监督管理监制要大力提倡并严格执行，政府在宏观调控的同时，对于单位及个体要及时加大监督力度，在整个过程中起到了推波助澜的作用，这样对于建筑工程的质量将起到良好的监督作用，在良好的监督作风下，建筑工程的质量问题才能得到有效解决，这样的建筑物才能够被安全地放入市场中，人们对于建筑成品的使用才能感到放心如意。
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如何自动生成参考文献
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法律自考论文参考文献的查找方法
法律自考论文的参考文献相当重要，能够表明作者查询、阅读文献的深度和广度。一篇优秀的法律自考毕业论文，必然需要有权威的、丰富的`参考文献作为支撑;相反，如果没有这些权威而丰富的参考文献，那么即使正文写得再好，也是有缺憾的。
那么，自考生朋友们究竟应该怎么查找参考文献呢?
我们从如下3个小点来说明这个问题：
1.网络文献
很多同学喜欢大量援引网络文献，虽然网络上的文献可能比较新，也比较独家，但是不宜大量援引网络上的文献。一般来说，假如学校要求10个参考文献，那么网络文献不能超过2个，超过2个的话就显得文章没有深度，甚至会导致老师误以为学生的论文是从网络上抄袭的。我们接触过很多大学老师，他们一般都比较排斥网络文献。
2.著作类文献
著作类文献需要有所援引，但是不能大量援引教科书的内容或者概念性的内容，应该援引观点、论据等。相关著作可以在图书馆查到，或者在当当网上买到。
3.期刊论文
期刊论文是参考文献的主要内容，同学们应重视期刊论文的援引。在援引期刊论文的过程中，需要注意援引权威的期刊，如法学类核心刊物。一些小杂志、垃圾杂志上的文章，除非真的很有说服力，同学们千万不要援引。期刊文献可以在中国知网、中国万方等网站上下载，需要说明的是，这些网站都是要收费的，同学们可以去淘宝上买点卡，以节约费用。一般来说，为了写好一篇自考论文，花掉200元资料费还是应该的、值得的。
4.英文文献
自考生同学们我们就不建议援引英文文献了，以免老师认为你的文章是抄袭的。
PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!
技术的研究进展
摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。
关键词 PCR技术;研究进展;应用
中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02
PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。
1 PCR技术原理
PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。
2 PCR技术的分类
在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。
实时荧光定量PCR技术
1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。
荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。
多重PCR技术
多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。
在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。
单分子PCR技术(SM-PCR)
单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。
单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。
3 PCR技术的应用
PCR技术在水产上的应用
基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。
PCR技术在微生物检测上的应用
1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。
4 展望
传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。
5 参考文献
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pcr实验步骤如下：
1.初始化步骤。这仅对热启动PCR必不可少。此步骤将溶液加热至94-98°C，以激活DNA聚合酶。该步骤的时间取决于所使用的聚合酶。
2.变性步骤。DNA是双链分子，DNA扩增需要引物与单链DNA模板相互作用。在此步骤中，将反应混合物加热至94-98°C并保持20-30秒，以破坏两条链之间的氢键并生成单链DNA分子。此时进入PCR循环。
3.退火步骤。变性后，反应混合物中的DNA模板是单链的。由于引物与DNA模板互补，当反应温度降低到50-65℃时，引物会与模板序列匹配，互补碱基之间形成氢键。退火温度取决于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。该步骤将持续约20-40秒以完全退火，然后聚合酶将定位到引物-模板杂交体以开始DNA组装。
4.伸长步骤。在此步骤中，DNA聚合酶开始合成DNA，因此温度应为DNA聚合酶的最适温度。一般选择72°C，但有些酶在68°C时效果更好。
这一步与体内DNA复制非常相似，DNA聚合酶将dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向与模板互补，最终产生新的双链DNA片段。延伸时间取决于目标DNA片段的长度和DNA聚合酶的能力。一般来说，DNA聚合酶每60秒产生一千个碱基。
步称为一个循环，每循环一次，目标片段量翻倍。一个PCR过程使用30-35个循环。在PCR循环的早期，PCR产物以指数速率积累，而在PCR循环的后期，随着dNTPs、引物的减少和DNA聚合酶在变性温度下的失活，反应减慢，PCR速率逐渐下降。
6.最终伸长率。30-35个循环结束后，在68-74℃的温度下最终延伸约5-10分钟，以充分延伸剩余的单链DNA。
7.贮存。最终产品可以在PCR机器中维持温度在4-10°C。
最早接触PCR是在做科创和本科毕业论文相关实验的时候，通过扩增野生型菌株和突变体菌株的某个基因，然后通过AS-PCR方法，设置温度梯度，筛选一对能够区别S和M菌株的特异性引物。
那个时候对PCR有一个大概的影响，其实在操作方面是没什么问题的。但是仔细想起来，和其他实验一样，都是一知半解，对PCR亦是如此。因此，我觉得有必要重新学习一下PCR相关的各种技术和原理。
【进入正题】
PCR (polymerase chain reaction)聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术，在1985年由美国Cetus公司的Kary Mullis首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。Kary Mullis本人因此获1993年诺贝尔化学奖。
前面分享过PCR之歌，这里在系统整理PCR相关知识之前，重温一下。
一、PCR的原理
在 DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
聚合酶链式反应用于扩增一小段已知的DNA片段，可能是单个基因，或者仅仅是某个基因的一部分。与活体生物不同的是，PCR只能复制很短的DNA片段，通常不超过10kbp。DNA是双链分子，因此用互补DNA双链的构造单位（核苷酸）来度量其大小，单位为碱基对（base pair, bp）。
二、PCR反应成分
template
过多：
非特异性条带增加。
过少：
PCR产量降低。
primer
预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。
偏高：
非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。
偏低：
产量降低。
polymerase
耐高热
偏高：
引物非特异产物的扩增。
偏低：
产物量降低。
dNTP
dATP、dGTP、dCTP、dTTP
过高：
加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入率和室验成本。
过低：
反应速度下降，可提高实验的精确性。
buffer
Mg2+
Taq酶具有Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量。
过量：
能增加非特异扩增并影响产率。
过低：
则酶活性显著下降。
10~50 mM Tris- Cl ()
维持Taq酶作用环境的偏碱性
25~50 mM KCl
促进引物退火，＞50 mM会抑制Taq酶的活性。
100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)
对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇(DTT)也有类似作用。
三、PCR反应基本步骤
一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：
变性(Denaturation)：
退火或称接合,复性(Annealling)：
延伸(Extension)：
四、PCR反应条件优化
1、变性温度和时间：
保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。
加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。
温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。
复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。
需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。
延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。
这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。
五、PCR延伸技术
由PCR延伸而来的技术很多，这里只介绍日常实验中常用到的几种。
PCR
降落PCR，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。
因此，前面几个循环的起始退火温度设定为比引物的最高熔解温度（Tm）再高几度。前几循环温度逐渐下降至设定的最终Tm。通过较高温度获得特异性匹配较高的模板后，再以较低温度高效率扩增。
逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
PCR/quantitative PCR
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
PCR
先用低特异性引物扩增几个循环以增加模板数量，再用高特异性引物扩增。
PCR
重叠延伸PCR分为2种：用重叠延伸PCR做定点突变 和 用重叠延伸PCR做序列缺失突变，即重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)
用重叠延伸PCR做定点突变（由于原理简单，直接上图）
该步一定要用pfu酶，不能用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR产物末端加A，会造成产物移码突变。
用重叠延伸PCR做序列缺失突变
6.高GC含量PCR
具有高GC含量（>65%）的DNA模板由于G和C碱基间的强氢键影响，比较难以扩增。富含GC的序列同时也涉及二级结构。因此，富含GC的序列可导致DNA聚合酶沿模板扩增时“卡顿”并干扰DNA合成。
为了扩增高GC含量的片段，双链模板必须解离，以便引物与模板结合，并使DNA聚合酶能够读取到序列。为了克服强GC相互作用，最常用的方法是使用DMSO等PCR添加剂或辅助溶剂来帮助DNA变性。然而，这些试剂通常会降低引物的 Tm，所以退火温度也需进行相应的调整。
高合成能力的DNA聚合酶由于与模板的结合能力更强，有利于完成高GC含量PCR。超高热稳定性DNA聚合酶也有利于高GC含量PCR，因为较高的变性温度（如，使用98°C代替95°C）可能会促进双链解离和PCR扩增。
等位基因特异性PCR（ allele specific PCR，AS-PCR ），是指利用引物与模板之间的碱基错配可以有效地抑制PCR反应，进而达到模板区分（等位基因区分）的目的。
由于PCR过程中引物延伸是3'端开始的，所以3'末端的碱基对引物的延伸来说处于至关重要的位置。如果这个碱基与模板互补，则引物能不间断延伸，PCR可以正常进行，得到特定长度扩增带，反之，则不能延伸。所以只要将与正常等位基因所不同的那个突变碱基安排在引物3'最末端，当用某一含突变序列的引物进行PCR时，如果得到特异条带，表明被测基因含有该种突变。没有特异扩增带出现，则表示没有这种突变。
注意：这里由于仅仅利用了引物3'末尾碱基的错配，因此需要摸索一个合适的Tm，才能达到检测目的。
【Reference】
Mullis, Kary B. et al. "Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences" 美国专利第4,683,195号
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2.模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
我们写论文中的“参考文献”又叫参考书目，根据我自己写论文的经历来看它的意思是指我们在撰写毕业论文过程中所查阅参考借鉴过的著作和报刊杂志等等一些资料，然后把它标注在在毕业论文的末尾。
一、那论文的参考文献具体是指什么呢？
二、我们在引用参考文献时需要注意什么呢？
三、我给大家讲一下参考文献格式：
1、参考文献和注释。按论文中所引用文献或注释编号的顺序列在论文正文之后，参考文献之前。图表或数据必须注明来源和出处。
[编号]、作者、文章题目、期刊名(外文可缩写)、年份、卷号、期数、页码。
[编号]、作者、书名、出版单位、年份、版次、页码。
2、附录。包括放在正文内过分冗长的公式推导，以备他人阅读方便所需的辅助性数学工具、重复性数据图表、论文使用的符号意义、单位缩写、程序全文及有关说明等。
[M]——专著,著作
[C]——论文集(一般指会议发表的论文续集，及一些专题论文集，如《xxx大学研究生学术论文集》
[N]—— 报纸文章
[J]——期刊文章：发表在期刊上的论文，尽管有时我们看到的是从网上下载的(如知网)，但它也是发表在期刊上的，你看到的电子期刊仅是其电子版
[D]——学位论文 ：不区分硕士还是博士论文
[R]——报告：一般在标题中会有"关于xxxx的报告"字样
[S]—— 标准
[P]——专利
[A]——文章：很少用，主要是不属于以上类型的文章
[Z]——对于不属于上述的文献类型，可用字 母"Z"标识，但这种情况非常少见
[DB/OL] ——联机网上数据(database online)
[DB/MT] ——磁带数据库(database on magnetic tape)
[M/CD] ——光盘图书(monograph on CDROM)
[CP/DK] ——磁盘软件(computer program on disk)
[J/OL] ——网上期刊(serial online)
[EB/OL] ——网上电子公告(electronic bulletin board online)
很显然，标识的就是该资源的英文缩写，/前面表示类型，/后面表示资源的载体，如OL表示在线资源。
四、经验总结
我们在写论文的时候，尤其是我们的毕业论文，说多了都是泪呀，这都是根据我自己当年写毕业论文的血泪史，总结出来的结论参考文献有三个好处：
具体有以下几种类型：M——专著C——论文集N——报纸文章J——期刊文章D——学位论文R——报告，采用字母“Z”标识。对于英文参考文献，还应注意以下两点：1、作者姓名采用“姓在前名在后”原则，具体格式是：姓，名字的首字母。2、书名、报刊名使用斜体字。
毕业论文的参考文献是指您在论文中引用的各种来源的文献资料，包括书籍、期刊、网站、报纸、研究报告等。在参考文献中，您需要对每篇文献进行详细的描述，包括作者、书名或文章标题、出版信息、出版时间等。这些信息可以帮助读者更好地了解您所引用的资料来源，从而加强您的论文可信度和学术水平。参考文献通常按照一定的格式排列，如APA、MLA、IEEE、Chicago、Harvard等格式。不同学科和不同学校可能对参考文献的格式有所不同，建议您在写作前先了解所在学校或导师对参考文献格式的要求和标准，以免因不符合规范而扣分或被认为是学术不当行为。维护参考文献的准确性和完整性对于毕业论文写作至关重要。建议您在搜索、阅读和引用其他学术文献时，要认真阅读文献，并注意文献的来源和可信度，以免引用错误或不规范的文献资料，从而影响您的学术形象和升学就业前景。另外，在编写参考文献时，还需注意以下几点：1. 格式要求：不同学科和不同学校可能有不同的格式要求。建议您在写作前了解所在学校或导师对参考文献格式的要求和标准，认真阅读相应的格式规范，并按照规范格式编写参考文献。2. 参考文献的数量：毕业论文的参考文献数量应该充分、准确，但不应太少或太多。要根据具体情况确定参考文献的数量，通常以15-50篇之间为宜。3. 引用的准确性：在引用参考文献时，要保证引用信息的准确性。需要仔细核对作者、出版日期、出版社等信息，以免因引用不正确的文献而影响论文质量。4. 参考文献的排序：一般情况下，参考文献按照作者字母顺序排序，如果有多篇同一作者的文献，则按时间顺序排序。总之，参考文献是毕业论文的重要组成部分，它不仅直接反映了您的研究背景和学术水平，也是您的学术诚信的体现。因此，您应该认真对待参考文献的编写，确保每一篇参考文献的准确性和规范性。