地表水系除锰菌株的筛选和除锰能力的异同性分

中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1007-3973（2013）009-142-02
　　锰元素是地球地壳的主要成份之一，在自然界广泛分布，当水中的锰含量超过一定标准时，会对工业、生活及环境产生不利的影响，甚至表现出严重的生理毒性，对人产生慢性毒害。Mn（II）多存在于地下水中，但随着经济的快速发展，厂矿污水的排放，加上全球气候恶化，洪涝灾害频繁发生，大量的含锰物质被冲刷流入河流，导致地表水中的锰含量不断升高。地表水锰污染已成为给水处理中一个亟待解决的问题。
　　目前国内外除锰工艺的研究领域主要针对地下水，已取得丰富的成果，在法国、德国、保加利亚等国家的试验性利用已取得良好的成效。但地表水方面一直未受到特别重视，从而未进行系统理论的研究。近年来世界各地及我国先后发现，众多大小地表水系不同程度地受到锰的污染。由于地表水在含氧量、酸碱度、水系条件等方面与地下水有着很大区别，针对地下水的生物除锰工艺处理地表水时有着很大的局限性。因此筛选适合地表水系的具有除锰能力的菌株，研究其对Mn（II）的氧化去除能力有着巨大的社会经济效益，同时为除锰工艺的理论系统化发展进一步奠定基础。
　　1 实验材料
　　样品为重庆“锰三角”附近厂矿周边地表水中取得水样和淤泥，用无菌瓶保存后带回实验室进行分离鉴定。
　　PYCM液体培养基：蛋白胨0.8g，酵母浸膏0.2g，MnSO4·H2O 0.2g，K2HPO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaNO3 0.2g，CaCl2 0.1g，（NH4）2CO3 0.1g，定容至1000mL，pH值7。
　　PYCM固体培养基：1000mL PYCM液体培养基中加入15g琼脂。
　　Mn（II）母液：MnSO4·H2O 0.614g，定容至200mL，终浓度1000mg/L。
　　TEST培养基：蛋白胨0.2g，酵母浸膏0.1g，NaCl 1.314g，KCl 0.056g，MgSO4·7H2O 0.924g，CaCl2 0.083g，定容至1000mL。加热灭菌，冷却后加入已过滤除菌的10.1mL的1M HEPES母液。
　　2 实验方法
　　2.1 样品的分离纯化
　　取10mL样品悬浮液梯度稀释后涂布PYCM平板，置于25℃下培养15天，挑取棕色菌落，多次划线分离后得到单克隆。用0.5% 盐酸四甲基对苯二胺溶液滴加分离的菌落，初步检测其锰（II）氧化能力。
　　2.2 菌株除锰能力测定
　　利用甲醛肟分光光度法测定。
　　2.2.1 标准曲线绘制
　　配置浓度分别为0mg/L，2 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，40 mg/L，60 mg/L，80 mg/L和100 mg/L的Mn（II）标准液。取1mL标准液，加7mL H2O，0.1mL Na2-EDTA溶液，0.1mL甲醛肟溶液，0.36mL NaOH溶液，摇匀后静置10分钟，加入0.6mL 氨-盐酸羟胺溶液后加水定容至10mL，摇匀后再静置20分钟，随后利用分光光度计以纯水作为对照，于450nm光下测量反应液的OD值，绘制标准曲线。
　　2.2.2 待测菌株样本制备
　　将待测菌株用1mL PYCM液体培养基25℃培养48小时后，利用10mM Tris·HCl缓冲液反复离心清洗，最后悬浮稀释至相同菌体浓度，OD610为1.0。
　　取4.65mL TEST培养基，加入250 L Mn（II）母液，再加入100 L稀释菌液。对照组加入100 L ddH2O。25℃振荡培养48小时。
　　2.2.3 待测菌株除锰能力测定
　　将培养结束的菌株和对照转移至离心管中，3000€譯离心10分钟，取上清液1mL，按照甲醛肟法测定吸光度OD450。
　　3 结果与分析
　　3.1 除锰菌株的分离筛选
　　通过对3处高锰地区地表水系采集的水样和污泥样本的梯度稀释后涂布在PYCM固体培养基上，挑选棕黄色菌落，经多次划线纯化培养获得除锰菌株6株，MBR1，MBR2，MBR3，MBR4、MBR5和MBR6，滴加0.5%盐酸四甲基对苯二胺溶液的对应菌落颜色呈深蓝色。
　　当具有锰氧化能力的菌株在含有Mn（II）的PYCM培养基中生长时，能将培养基中的Mn（II）氧化为Mn（IV），形成棕色沉淀，使菌落表现出棕黄色。因此挑选棕黄色菌落更易从生态菌群中找到具有锰氧化能力的菌落。微生物的Mn（II）氧化酶可与盐酸四甲基对苯二胺溶液氧化，产生颜色反应。因此利用盐酸四甲基对苯二胺对挑选的6株除锰菌株进行显色反应呈阳性，可以初步鉴定菌落具有氧化酶和对Mn（II）的氧化能力。
　　3.2 甲醛肟标准曲线的确立
　　在实验结果中，我们发现当分析中包括100mg/L Mn（II）标准液的吸光度结果时，Mn（II）浓度与吸光度的标准曲线的R2<0.99，严重偏离线性关系，而当去除100mg/L标准液结果后可得到较好的线性关系。该现象可能由于100mg/L的Mn（II）浓度超出了甲醛肟法的测定范围，反应过程中无法将溶液中的Mn（II）全部转化为Mn（IV），进而导致测量结果偏离线性关系。因此，根据实验所得结果，Mn（II）的浓度与吸光度在0-80mg/L范围内呈线性相关，R2=0.9997。
　3.3 除锰菌株除锰能力的测定
　　将对照ddH2O稀释后的菌液在50mg/L Mn（II）的TEST培养基中培育48小时后的上清液，利用甲醛肟法测的OD450。参照甲醛肟法的标准曲线可得出上清液中残留的Mn（II）浓度，则除锰菌株对Mn（II）的去除能力为：除锰率=（原始Mn（II）浓度-残留Mn（II）浓度）/原始Mn（II）浓度€？00%。
　　通过实验结果发现，MRB系列菌株对对Mn（II）的去除率在10.0～37.2%之间，其中以MBR3、MBR5和MBR6去除Mn（II）的能力较强，除锰率分别为30.9%，35.6%和37.2%，此能力的产生可能与该菌株所处的高锰环境的胁迫选择有关。而MBR1、MBR2和MBR4除锰率分别为23.6%，19.4%和10.0%，均低于30%，这和可能与这类细菌在高锰环境的生存机制有关，它们可能不需要通过氧化Mn（II）来调整所处微环境的Mn（II）浓度，而是更多依靠自身对锰的耐受能力或自然界菌群中其它菌对Mn（II）的协同吸附去除机制。
　　4 结论和讨论
　　目前关于除锰菌株的研究多集中于地下水方面，从地下水相关环境分离具备除锰能力的菌株。但本研究针对的地表水系的环境条件与地下水系的相差很大。（1）地表水的pH值和溶解氧含量均较地下水高，适于地下水低pH值条件下的氧化Mn（II）的细菌不一定适应地表水系环境。（2）地表水中铁离子含量低，对除锰的干扰较地下水小。（3）地表水源的水质较地下水复杂，影响到针对地下水的锰氧化细菌的除锰效果稳定性。因此目前常用的处理地下水的锰氧化细菌在地表水系中无 法稳定的发挥效果，故针对地表水进行生物除锰，需要挑选适合地表水的锰氧化细菌。
　　本研究从高锰地区的地表水系中分离纯化后获得6株具有除锰能力的菌株，其中有3株菌株MBR3、MBR5和MBR6的氧化Mn（II）能力较强，48小时的除锰效率率达到30%以上。从实验结果看出，地表水系中筛选到的除锰菌株氧化去除Mn（II）的效率低于部分文献报道的针对地下水的除锰菌株，其原因可能存在于多方面：（1）地表水由于自然的流动更替，虽然会出现Mn（II）浓度超标，但仍低于地下水的浓度，因此生存在地表水系的微生物只需要进化出适合地表水的氧化除锰能力。（2）地表水系水质复杂，生物群落中微生物的种类远远多于地下水系，其个体虽然除锰能力不强，但群落间可通过协同增强作用，共同对Mn（II）进行氧化，以降低Mn（II）浓度。（3）地表水系中的部分微生物生存依赖对高Mn（II）浓度的耐受性强于氧化去除能力。因此随着对分离到的地表水系除锰菌株的除锰机制，耐锰能力进一步进行研究，与地下水系除锰菌株进行比较，可揭示不同条件下微生物除锰的原理，以便进一步开发投入环保应用。
　　（基金项目：四川省科技厅应用基础项目资助（07JY029-034））
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