甘草酸对酸性环境中变异链球菌生长影响的体外

　　[摘要] 目的 研究酸性环境中甘草酸对体外培养变异链球菌生长的影响。方法 在ph 7.0、ph 5.5和ph 4.0环境中培养变异链球菌，同时在培养基中加入3种浓度（0.78、1.57、3.13 mg·ml-1）的甘草酸，37 ℃下厌氧培养24 h后，测定各组的菌落计数和菌悬液吸光度值，分别以阴性对照组和ph 7.0组细菌生存率为对照，计算各组细菌的生存率。结果 以阴性对照组为对照，0.78、1.57和3.13 mg·ml-1甘草酸组在ph 5.5环境时细菌生存率为60.96%、60.27%和45.58%，在ph 4.0时细菌生存率为68.75%、53.12%和45.83%。以ph 7.0组为对照，0.78、1.57和3.13 mg·ml-1甘草酸组在ph 5.5和ph 4.0时细菌生存率分别为52.25%和39.05%、74.39%和43.11%、86.38%和55.30%。结论 在酸性环境中，甘草酸能够抑制体外变异链球菌的生长，环境酸度降低可使甘草酸的抑菌作用增强。
　　[关键词] 甘草酸； 变异链球菌； 耐酸性
　　[中图分类号] r 780.2 [文献标志码] a [doi] .1000-1182.2012.06.008
　　甘草是一种历史悠久的古老植物，甘草提取物及其主要活性成分甘草酸被广泛应用在食品、烟草和传统植物药中[1]。本课题组前期研究显示，甘草酸
　　（glycyrrhizic acid，ga）对体外中性环境中培养的变异链球菌（streptococcus mutans，s. mutans）的增殖和产酸均具有一定的抑制作用[2]。变异链球菌是一种在
　　牙菌斑中产酸快、耐酸性强的细菌，能够在牙菌斑的酸性环境中生存并产生致龋作用[3]。甘草酸对在酸
　　性环境中生长的变异链球菌有何影响，目前尚未见报道。本研究拟探讨甘草酸对体外酸性环境中培养的变异链球菌生长的影响。
　　1 材料和方法
　　1.1 主要材料与仪器
　　变异链球菌的国际标准株atcc 25175（四川大
　　学口腔疾病研究国家重点实验室提供），甘草酸a
　　（c42h62o16，纯度99%，宝鸡金森制药有限公司），dy-
　　2型厌氧培养箱（浙江义乌冷冻机总厂），hts 7000
　　plus全波长多功能酶标仪（thermo公司，美国），phs-3c精密ph计（上海雷兹仪器厂），millipore纯水仪（mil-lipore公司，美国）。所有实验用水均为去离子水。
　　1.2 细菌培养与菌液制备
　　将-80 ℃保存的变异链球菌接种于tpy琼脂平板，37 ℃厌氧（80%n2，10%h2，10%co2）培养24 h，镜检为纯菌后挑单菌落接种tpy液体培养基，37 ℃厌氧培养24 h，收集菌液，调节菌浓度，使在600 nm处测定的吸光度值a600为2.0，备用。
　　1.3 甘草酸药液配制
　　称取一定量甘草酸a加入tpy液体培养基中，滤过除菌后备用。
　　1.4 酸性环境中甘草酸对变异链球菌生长的影响
　　将实验组分为3组：甘草酸组1（ga1）、甘草酸
　　组2（ga2）、甘草酸组3（ga3），依次为在药液中加
　　入菌悬液（9∶1），使甘草酸的终浓度分别为0.78、1.57、
　　3.13 mg·ml-1。另设阴性对照组（ng），在tpy液体培
　　养基中加入菌悬液（9∶1）。各组的培养基又分为ph
　　7.0、ph 5.5和ph 4.0三种。
　　实验在96孔细胞培养板中进行，每组设6个平行孔，37 ℃厌氧培养24 h后，在600 nm处测定吸光度值a600；同时从每组平行孔中任选3孔，每孔分别取一定体积菌悬液接种于tpy琼脂平板（ph 7.0），37 ℃
　　厌氧培养48 h，进行菌落计数（colony forming unit，
　　cfu），记为n值。
　　各实验组细菌生存率计算如下：以相同酸度中阴性对照组细菌生存率为100%，则药物组细菌生存率s药物=n甘草酸组/n阴性对照组×100%或s药物=a甘草酸组/a阴性对照组×100%。以相同药物组中ph 7.0组细菌生存率为100%，则低酸组的细菌生存率sph=n低酸组/nph 7.0×100%或sph=
　　a低酸组/aph 7.0×100%。
　　1.5 统计分析
　　采用spss 16.0软件进行统计分析，多组比较用方差检验，两组比较用t检验，p<0.05为有统计学差异。
　　2 结果
　　2.1 酸性环境中甘草酸对变异链球菌生长的影响
　　各组的菌落计数和吸光度值见表1和2。从表中可以看出，以菌落计数和吸光度值为指标所反映的各组的变化趋势是基本一致的，相对而言菌落计数更准确地反应了活细菌数量，所以以下实验结果主要以菌落计数来分析。
　　同一酸度下不同药物浓度对变异链球菌生存的影响见图1和2。从图1可见，在中性环境（ph 7.0）中，

　0.78 mg·ml-1甘草酸使细菌的生存率降低至49.85%，随着甘草酸浓度的增加细菌的生存率进一步降低，1.57和3.13 mg·ml-1甘草酸组细菌的生存率分别只有35.1%和23.3%；在ph 5.5和ph 4.0时，0.78、1.57和3.13 mg·ml-1甘草酸组中细菌生存率分别为60.96%、60.27%、45.58%及68.75%、53.12%、45.83%。除ph 5.5时的0.78和1.57 mg·ml-1甘草酸组外，在同一酸度下各组细菌的生存率均随着药物浓度的增加而显著降低（p<0.05）。图2中除了在ph 4.0时3个实验组
　　的细菌生存率无统计学差异外，其他均显示了和图1相同的趋势。
　　2.2 酸度对甘草酸作用的影响 　　同一药物浓度下不同酸度对变异链球菌生存的
　　影响见图3和4。
　　从图3可见，在阴性对照组中，ph 5.5和ph 4.0时细菌的生存率分别降低至43.12%和28.35%；在0.78、1.57和3.13 mg·ml-1甘草酸组中，ph 5.5和ph 4.0时细菌的生存率分别为52.25%和39.05%、74.39%和43.11%、86.38%和55.30%。除3.13 mg·ml-1甘草酸组中的ph 7.0和ph 5.5外，同一药物浓度下各组细菌的生存率均随着酸度的降低而显著降低（p<0.05）。图4显示了和图3相同的趋势。
　　3 讨论
　　甘草的有效成分包括皂苷类、黄酮类、异黄酮类和多酚类等[4]，甘草的皂苷类物质包括甘草酸、甘
　　草皂苷g2和乌拉尔甘草皂苷b等[5]。皂苷是由苷元和糖体两部分组成[6]，甘草酸由一个五环三萜苷元（甘草次酸）和一个二葡萄糖醛酸组成，在甘草根中主要以钙盐和钾盐形式存在，是甘草的主要活性成分之一[3]。本实验所用的甘草酸是从新疆甘草的根部提取
　　的天然成分，纯度为99%。
　　甘草酸对体外培养的病毒（如水痘带状疱疹病毒）和细菌（如上皮葡萄糖球菌）等病原菌有抑制作用。有关甘草酸对口腔疾病病原菌的作用，目前仅见有甘草酸抑制体外培养变异链球菌[2]、白色假丝酵母菌[7]、
　　牙龈卟啉单胞菌[8]生长的报道。本课题组前期实验结
　　果显示，在中性环境中，甘草酸对变异链球菌的最小抑菌浓度为1.57 mg·ml-1，0.78 mg·ml-1及以上浓度对变异链球菌的生长和产酸均有一定的抑制作用，且随甘草酸浓度的升高抑制作用逐渐增强[2]。
　　当牙菌斑中的酸度降到ph 5.5～ph 5.4时即可导致釉质脱矿，ph 5.5被称为釉质脱矿的临界ph[9]。研
　　究显示，当摄入蔗糖后，成熟牙菌斑中的ph能够在
　　3 min内从7.0降到4.0以下[1]。因此，本研究以ph 5.5和ph 4.0的培养基分别模拟牙菌斑的酸性环境，探讨甘草酸在临界ph和极酸性环境中对变异链球菌的作用，同时以ph 7.0作为中性环境对照。实验结果显示，在ph 7.0环境中，与阴性对照组相比，0.78、1.57和3.13 mg·ml-1甘草酸组细菌的生存率分别只有49.85%、35.1%和23.3%，与本课题组前期研究结果基本一致[2]。当在ph 5.5和ph 4.0环境中时，0.78～
　　3.13 mg·ml-1的甘草酸能够抑制变异链球菌的生长，且随甘草酸浓度的增加抑制作用增强，提示在酸性环境中甘草酸对变异链球菌的生长也有一定的抑制作用。
　　目前的研究显示，变异链球菌能在酸性环境中生长可能与以下机制有关：1）变异链球菌通过质子移位膜atp酶（membrane-bound proton-translocating
　　atpase，h+-atpase）将质子排出胞外，从而维持胞内ph相对稳定。变异链球菌h+-atpase的活性在酸性环境中增强[10]，高酸耐受的变异链球菌株中h+-
　　atpase的最适ph为6.0[11]，但酶活性增强的具体机制尚不清楚[10]；2）变异链球菌具有两个葡萄糖转运系统，即透性酶转运系统和磷酸转移酶系统（phospho-transferase system，pts）。在低ph时pts活性受到抑制，而透性酶转运系统的最适ph为5.5，该系统使
　　细菌在酸性环境下仍能继续转运葡萄糖，维持细菌的正常代谢[12]；3）脱氧核糖核苷酸的糖基键在低ph时易断裂从而使碱基质子化，导致dna脱嘌呤和嘧啶（apurinic and pyrimidine，ap），ap核酸内切酶
　　可启动ap位点的修复。变异链球菌的ap核酸内切酶在低ph环境中比在ph 7.0环境中的活性更高，提示变异链球菌的耐酸性与dna修复酶间存在某种联系[10]；4）轻度耐酸的口腔链球菌具有尿素酶或精氨酸脱
　　亚氨基酶系统（arginine deiminase system，ads），能
　　将尿素或精氨酸分解成co2和氨，对抗低ph时细菌胞浆和外环境的酸化。虽然变异链球菌中无尿素酶

和ads，但在变异链球菌ua159中发现与精氨酸脱亚氨基酶基因类似的一段基因，其编码胍丁胺脱亚氨基酶系统（agmatine deiminase system，agds）的操纵子，胍丁胺是精氨酸脱羧基的衍生物，在低ph环境中agds分解胍丁胺生成氨，提示agds可能在变异链球菌耐酸中发挥作用[10]；5）在酸性环境中，变
　　异链球菌胞膜上短链饱和脂肪酸向长链不饱和单脂肪酸转变。用变蓝菌素（脂肪酸生物合成抑制剂）处理变异链球菌后，细菌无法在酸性环境中生存，提示胞膜脂质的组成改变与其耐酸性有关。胞膜成分的改变可能降低质子的通透性，同时对膜h+-atpase的活性和膜转运蛋白产生较强的影响，从而增强变异链球菌的耐酸性[10]；6）蛋白伴侣groel和dnak是微生物主要的环境应急蛋白，能够抑制蛋白聚集和错折叠，也能够重折叠被酸损伤的蛋白，并将损伤不可修复的多肽提呈给蛋白降解途径。酸休克可迅速诱导变异链球菌的groel和dnak基因表达，同时维持dnak蛋白在酸性环境中的高表达。另外，clpp肽酶也是变异链球菌的一种应急蛋白，当与clppase家族成员联合时，该酶具有丝氨酸蛋白酶作用，能够抑制可能对细菌有毒性的、错误折叠蛋白的聚集，缺乏clpp基因的变异链球菌在低酸环境中的生长受到抑制[10]。
　　在甘草酸与微生物关系研究中发现，肠道中一些细菌包括链球菌属，具有特异性的β-葡萄糖醛酸苷酶，能将甘草酸最终水解成甘草次酸并排至胞外[3]，同时细菌也可摄取胞外环境中的甘草次酸。进入细菌胞内的β-甘草次酸能够抑制细菌dna、rna和蛋白的合成，而甘草酸和α-甘草次酸仅能够抑制细菌rna和蛋白的合成。甘草酸是一种有机弱酸[13]，有 　　机弱酸如吲哚美辛、酮洛芬等对变异链球菌胞膜产生微干扰而使胞膜对质子的通透性增加，进入胞内的质子增多使胞浆酸度降低，从而抑制与糖酵解有关的酶，导致糖酵解过程受到抑制[14]。本实验中，在酸性环境中甘草酸能够抑制变异链球菌的生长，从变异链球菌适应酸性环境生长的众多机制来看，甘草酸对其耐酸性的抑制可能也是通过多方面实现的，但具体机制尚需进一步研究。
　　菌落计数法是检测单位体积中活性微生物数量的传统方法，但操作较为复杂，灵敏度较差，往往低估了活菌的数量；吸光度法也可检测单位体积中微生物数量，且操作简单，灵敏度高，但其测得数据是包括了存在于培养基中的活菌、死菌及细菌生长过程中的代谢产物等，故并不完全是活菌数量的真实反映。本研究采用菌落计数法和吸光度法对同一样本的变异链球菌进行定量检测，结果显示，两种方法总体上具有一定的一致性，但在个别数据中也出现不一致的现象，如图1和图2所示，在ph 4.0组中，采用菌落计数法时ga1和ga2组具有统计学差异，而采用吸光度法时两组无统计学差异。除上述原因外，另外也应考虑在ph 4.0环境中，变异链球菌的生长被显著抑制导致所测得的吸光度值均较低，而数值越低可能存在的误差越大，这些结果提示无论采用何种方法，对结果的评价应慎重。
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