灵芝孢子油化学成分研究

　　灵芝隶属于真囷界(KingdomFungO、担子囷门(Basitdiomycota)、担子囷纲(Basitdiomycetes)、非囷權目(Aphyllophorales)、多孔囷科(Polyporaceae)、灵芝属(Ganoderma)'灵芝孢子粉为灵芝子实体成长过程中散发的孢子聚集而成[2]。灵芝孢子油是灵芝孢子粉通过二氧化碳超临界萃取得到的一种混合物，具有良好的抗肿瘤和增强免疫力的作用，在临床上应用于抑制肿瘤和改善肿瘤恶病质症状等方面[3]。本课题组对灵芝孢子油的化学成分进行了分离和结构鉴定，现报道如下。

　　1仪器与试剂

　　BrukerAVANCE-400型核磁共振仪[瑞士Bruker公司，溶剂为氘代氯仿（CDCI3)]；MAT95XPThermo型质谱仪（美国Thermo公司）；FT-IRNICOLET6700型红外光谱仪（美国Nicolet公司）；岛津LC-20A(uv/vis)制备液相色谱仪（曰本岛津公司）；KromacilC18制备色谱柱（美国Kromacil公司，250mmX21.2mm,5|xm)；VoyagerGC/MS气一质联用仪、顶NOWAX毛细管柱(美国Finnigan公司，30mX0.25mm,固定相厚度0.25|xm)；AgilentMSDproductivity化学工作站，配NIST98质谱库（美国惠普公司）。

　　灵芝孢子油为广州汉方现代中药研究开发有限公司提供，批号??110220，为多孔菌科灵芝m(.)Karst.破壁孢子的超临界二氧化碳提取物；柱层析硅胶（200~300目，青岛海洋化工）；GF254高效薄层硅胶板（青岛海洋化工)；SephadexLH-20(瑞士Fluka公司)；液相用试剂为色谱纯，其余试剂为分析纯。

　　2方法与结果

　　2.1提取与分离灵芝孢子油（200g)上硅胶柱(1200g，200~300目），用石油醚一乙酸乙酯(体积比，下同，100:0~0:100)梯度洗脱。利用正相薄层层析，合并主斑点相同流份，得到流份A(90g)和流份B(43g)。流份A(60g)上硅胶柱（1200g，200~300目），用二氯甲烷一乙酸乙酯（100:0~0:100)梯度洗脱。利用正相薄层层析，合并主斑点相同流份得多个流份。用制备液相分离收集各洗脱部分，二氯甲烷一乙酸乙酯（100:

　　洗脱部分（3.9185g)，得到化合物1(200mg);二氯甲烷一乙酸乙酯（50:1)洗脱部分(2.9012g)，得到化合物2(180mg);二氯甲烷一乙酸乙酯（3:1)洗脱部分（2.7962g)，得到化合物3(100mg)；二氯甲烷一乙酸乙酯（0:100)洗脱部分（3.6335g)，得到化合物4(20mg)和化合物5(35mg)。流份B经葡聚糖凝胶层析分离[石油醚一氯仿一甲醇等度洗脱（5:5:0)]，得到化合物6(11mg)。

　　2.2结构鉴定

　　化合物1:白色蜡状固体，易溶于石油醚、乙酸乙酯、氯仿，不溶于甲醇、水。电化学质谱(EI-MS):质荷比（m/z)886[M]+，结合化合物的核磁共振氢谱0HNMR)与核磁共振碳谱（13CNMR)核磁数据与甲酯化后的气相质谱图数据，确定化合物的分子式为C?H106O6，其不饱和度为5，结构中含有3个羰基季碳，5个次甲基（4个双键烯碳，1个连氧叔碳），46个亚甲基（其中2个为连氧的仲碳），3个甲基，数据提示为长链脂肪酸甘油酯类结构。由甘油醇结构部分的^NMR信号S4.29(2H，dd，J=11.8，4.3Hz，1a-H，3a-H)，4.14(2H，dd，J=11.9，5.9Hz，1b-H，3b-H)和5.26(1H，m，2-H)判断，其3个羟基皆被酯化。该推断进一步被13C腿R谱的羰基信号S173.16(2xC)和172.76(1xC)所证实。1HNMR和13CNMR谱进一步表明3个酯化片段为长链脂肪酸酯。在EI-MS中，该化合物裂解片段有m/z267(A)、m/z265(B)，片段A为十八碳烷酰基，片段B为十八碳烯酰基；13CNMR中27.2(邻近双键的碳）的信号可知片段B中双键为士构型，如为trans构型，则相应碳信号出现在32-34[4]。双键的位置通过如下碎片离子推测为位于9〃（10〃)和9苁(10苁)位：m/z113[C8H?]+，m/z139[CmH19]+。化合物1经过NaOH/MeOH水解，BF3(1mol/L)甲酯化，通过气相质谱仪（GC-MS)检测，得到2个水解产物，分别为十八碳烷酰甲酯和9Z-十八碳烯酰甲酯，且峰面积比值约为1:2。2种长链脂肪酸与甘油醇成酯顺序由EI-MS谱的裂解片段峰确定：m/z603为裂解A片段后的片段峰，表明A片段与甘油醇的1-OH成酯。B片段分别与甘油醇的2-OH和3-OH成酯。EI-MS:886[M+]，773，747，605,603，492，466，355，283，281，267，265，147，139，113。^NMR(CDC13，400MHz)Sppm：5.34(m，H-9〃，10〃，9苁，10苁），5.26(m，H-2)，4.29(dd，J=11.8，4.3Hz，H-1a，H-3a)，4.14(dd，J=11.9，5.9Hz，H-1b，H-3b)，2.33(m，H-2'，2〃，2苁），2.11(m，H-8〃，11〃，8苁，11苁），1.51(m，H-3'，3〃，3苁)，1.30-1.25(m，nxH)，0.94(t，Me-18'，18〃，18苁)；13CNMR(CDCI3，100MHz)Sppm：173.16(C-1'，C-1苁），172.76(C-1〃)，130.00，129.99，129.69，129.66(C-9〃，C-10〃，C-9苁，C-10苁），68.94(C-1)，62.10(C-1，C-3)，34.10(C-2'，C-2〃，C-2苁），31.80(C-16'，C-16〃，C-16苁），29.74-29.10(MxC)，27.21，27.18(C-8〃，C-11〃，C-8苁，C-11苁)，24.85(C-3'，C-3〃，C-3苁)，22.64(C-17'，C-17〃，C-17苁)，14.02(C-18'，C-18〃，C-18苁）。化合物1的波谱数据与文献[5]报道一致，同时根据生源合成规律所有植物油脂，饱和脂肪酸集中在sn-1与sn-3位上，不饱和脂肪酸连结在sn-2上[6]。故鉴定为1-0-十八碳烷酰-2-0-(9Z-十八碳烯酰）-3-0-(9Z-十八碳烯酰）甘油酯。

　　化合物2:淡黄色液体，易溶于石油醚、乙酸乙酯、氯仿，不溶于甲醇、水。快惰性原子轰炸质谱（FAB-MS):m/z857[M+1]+，结合化合物的1HNMR与13CNMR核磁数据与甲酯化后的气相质谱图数据，确定化合物的分子式为CsH1mOh其不饱和度为6，结构中含有3个羰基季碳，7个次甲基（6个双键烯碳，1个连氧叔碳），42个亚甲基(其中2个为连氧的仲碳），3个甲基，数据提示为长链脂肪酸甘油酯类结构。由甘油醇结构部分的1HNMR信号S4.30(2H，dd，J=11.9，4.3Hz，1a-H，3a-H)，4.14(2H，dd，J=11.9，5.9Hz，1b-H，3b-H)和5.30(1H，m，2-H)判断，其3个羟基皆被酯化。该推断进一步被13CNMR谱的羰基信号S173.30(2xC)和172.85(1xC)所证实。^NMR和13CNMR谱进一步表明3个酯化片段为长链脂肪酸酯。在FAB-MS中，该化合物裂解片段有m/z239(A)、m/z265(B)、m/z263(C)，片段A为十六碳烷酰基，片段B为十八碳烯酰基，片段C为十八碳二烯酰基；13CNMR中27.2(邻近双键的碳）的信号可知片段B和片段C中双键为cis构型，如为trans构型，则相应碳信号出现在32-34[4]。双键的位置通过如下碎片离子推测为位于9〃（10〃)位：m/z113[C8H?]+，m/z139[CMH19]+;9苁（10苁）位：m/z111[C8Hb]+，m/z137[。孔7]+;12苁（13苁)位：m/z71[C5HU]+，m/z97[C7HB]+;化合物2经过NaOH/MeOH水解，BF3(1mol/L)甲酯化，通过GC-MS检测，得到3个水解产物，分别为十六碳烷酰甲酯、9Z-十八碳烯酰甲酯和9，12Z-十八碳二烯酰甲酯，且峰面积比值约为1:1:1。3种长链脂肪酸与甘油醇成酯顺序由FAB-MS谱的裂解片段峰确定：m/z601为裂解A片段后的片段峰，表明A片段与甘油醇的1-OH成酯。m/z577为裂解C片段后的片段峰，表明C片段与甘油醇的3-OH成酯。B片段与甘油醇的2-OH成酯。FAB-MS(m/z):857[M+1]+，784，759，746，720，601，577，531，504，491，467，355，339，323，281，279，265，263，255，239，147，139，137，113，113，111，97，71；[HNMR(CDCL3，400MHz)Sppm:5.34(m，H-9〃,10〃，9苁，10苁，12苁，13苁），5.30(m，H-2)，4.30(dd，J=11.9，4.3Hz，H-1a，H-3a)，4.14(dd，J=11.9，5.9Hz，H-1b，H-3b)，2.76(m，H-11苁)，2.32(m，H-2'，2〃，2苁)，2.01(m，H-8〃，11〃，8苁，14苁)，1.60(m，H-3'，3〃，3苁),1.26-1.16(m，nxH)，0.88(t，Me-16'，18〃,18苁)；13CNMR(CDCI3，100MHz)Sppm：173.30(C-1'，C-1苁)，172.85(C-1〃)，130.22，129.68,130.02，129.68，128.09，127.92(C-9〃，C-10〃，C-9苁，C-10苁，C-12苁，C-13苁)，68.95(C-2)，62.11(C-1，C-3)，34.05(C-2'，C-2〃，C-2苁)，31.91(C-14'，C-16〃，C-16苁），29.74-29.10(MxC)，27.20(C-8〃，C-11〃，C-8苁，C-14苁)，25.64(C-11苁），24.88(C-3'，C-3〃，C-3苁），22.66(C-15'，C-17〃，C-17苁)，14.06(C-16'，C-18〃，C-18〃'）。化合物2的波谱数据与文献报道一致，故鉴定为1-0-十六碳烷酰-2-0-(9Z-十八碳烯酰）-3-0-(9，12Z-十八碳二烯酰)甘油酯。

　　化合物3:淡黄色液体，易溶于石油醚、乙酸乙酯、氯仿，不溶于甲醇、水。FAB-MS:m/z883[M+1]+，结合化合物的^NMR与13CNMR核磁数据与甲酯化后的气相质谱图数据，确定化合物的分子式为C?H1ffiOe，其不饱和度为7，结构中含有3个羰基季碳，9个次甲基（8个双键烯碳，1个连氧叔碳），42个亚甲基（其中2个为连氧的仲碳），3个甲基，数据提示为长链脂肪酸甘油酯类结构。由甘油醇结构部分的^NMR信号S4.29(2H，dd，J=11.9，4.3Hz，1a-H，3a-H)，4.14(2H，dd，J=11.9，5.9Hz，1b-H，3b-H)和5.26(1H，m，2-H)判断，其3个羟基皆被酯化。该推断进一步被13CNMR谱的羰基信号S173.16(2xC)和172.76(1xC)所证实。^NMR和13CNMR谱进一步表明3个酯化片段为长链脂肪酸酯。在FAB-MS中，该化合物裂解片段有m/z265(A)、m/z263(B)，片段A为十八碳烯酰基，片段B为十八碳二烯酰基；13CNMR中27.2(邻近双键的碳）的信号可知片段A和片段B中双键为cis构型，如为trans构型，则相应碳信号出现在32-34[4]。双键的位置通过如下碎片离子推测为位于9'(10')位和9〃(10〃）位：m/z113[C8H?]+，m/z139[CMH19]+;9〃（10〃)位:m/z111[C8Hb]+，m/z137[CWH?]+；12〃（13〃)位：m/z71[C5HJ+，m/z97[C7HB]+;化合物3经过NaOH/MeOH水解，BF3(1mol/L)甲酯化，通过GC-MS检测，得到2个水解产物，分别为9Z-十八碳烯酰甲酯和9，12Z-十八碳二烯酰甲酯，且峰面积比值约为2:1。2种长链脂肪酸与甘油醇成酯顺序由FAB-MS谱的裂解片段峰确定：m/z603为裂解B片段后的片段峰，表明B片段与甘油醇的3-OH成酯。A片段分别与甘油醇的1-OH和2-OH成酯。FAB-MS(m/z)：883[M+1]+，811，786，771，770，745，743，603，601，535，493，463，355，339，327，281，279，265，263，147，139，137，113，111，97，71。1HNMR(CDCI3，400MHz)Sppm：5.35(m，H-9'，10'，9〃，10〃，9〃，10〃，12〃，13〃），5.26(m，H-2)，4.29(dd，J=11.9，4.3Hz，H-1a，H-3a)，4.14(dd，J=11.9，5.9Hz，H-1b，H-3b)，2.78(m，H-11〃），2.33(m，H-2'，2〃，2〃），2.11(m，H-8'，11'，8〃，11〃，8〃，14〃)，1.51(m，H-3'，3〃，3〃），1.30-1.25(m，nxH)，0.94(t，Me-18'，18〃，18〃)；13CNMR(CDCI3，100MHz)Sppm：173.16(C-1'，C-1〃)，172.76(C-1〃)，130.09，130.03，130.01，129.96，129.61，128.02，127.99(C-9'，C-10'，C-9〃，C-10〃，C-9〃，C-10〃，C-12〃，C-13〃)，68.94(C-2)，62.10(C-1，C-3)，34.10(C-2'，C-2〃，C-2〃），31.80(C-16'，C-16〃，C-16〃)，29.74-29.10(MxC)，27.18(C-8%C-11'，C-8〃，C-11〃，C-8〃，C-14〃)，25.62(C-11〃），24.85(C-3'，C-3〃，C-3〃），22.66(C-17'，C-17〃，C-17〃)，14.02(C-18'，C-18〃，C-18〃）。化合物3的波谱数据与文献[5]报道一致，故鉴定为1-0-(9Z-十八碳烯酰）-2-0-(9Z-十八碳烯酰）-3-0-(9，12Z-十八碳二烯酰）甘油酯。

　　化合物4:淡黄色固体，易溶于石油醚、乙酸乙酯、氯仿，不溶于甲醇、水。EI-MS:m/z884[M]+，结合化合物的[HNMR与13CNMR核磁数据与甲酯化后的气相质谱图数据，确定化合物的分子式为C?H1MOe，其不饱和度为6，结构中含有3个羰基季碳，7个次甲基（6个双键烯碳，1个连氧叔碳），44个亚甲基（其中2个为连氧的仲碳），3个甲基，数据提示为长链脂肪酸甘油酯类结构。由甘油醇结构部分的^NMR信号S4.29(2H，dd，J=11.8，4.3Hz，1a-H，3a-H)，4.14(2H，dd，J=11.9，5.9Hz，1b-H，3b-H)和5.26(1H，m，2-H)判断，其3个羟基皆被酯化。该推断进一步被13CNMR谱的羰基信号S173.21(2xC)和172.80(1xC)所证实。〖HNMR和13CNMR谱进一步表明3个酯化片段为长链脂肪酸酯。化合物4经过NaOH/MeOH水解，BF3(1mol/L)甲酯化，通过GC-MS检测，得到2个水解产物，分别为11Z-十八碳烯酰甲酯和9Z-十八碳烯酰甲酯，且峰面积比值约为1:2。在EI-MS中，该化合物裂解片段有m/z265，分别为11Z-十八碳烯酰基（A)和9Z-十八碳烯酰基(B);13CNMR中27.2(邻近双键的碳）的信号可知片段A和片段B中双键为cis构型，如为trans构型，则相应碳信号出现在32-34[4]。双键的位置通过如下碎片离子推测为位于ir(12')位:m/z85[C6Hb]+，m/z111[C8HB]+;9〃（10〃）位和9苁(10苁)位：m/z113[C8H?]+，m/z139[CwH19]+;2种长链脂肪酸与甘油醇成酯顺序由EI-MS谱的裂解片段峰确定：m/z799和m/z773为裂解A片段中双键片段后的片段峰，表明A片段与甘油醇的1-OH成酯。B片段分别与甘油醇的2-OH和3-OH成酯。EI-MS(m/z):884[M+]，799，773，771,745，634，603，492，464，355，339，281，265，139，113，111，98，85，55。1HNMR(CDCI3，400MHz)Sppm：5.35(m，H-9'，10'，9〃，10〃，11苁，12苁)，5.26(m，H-2)，4.29(dd，J=11.8，4.3Hz，H-1a，H-3a)，4.14(dd，J=11.9，5.9Hz，H-1b，H-3b)，2.33(m，H-2'，2〃，2苁)，2.11(m，H-8'，11'，8〃，11〃，10苁，13苁)，1.51(m，H-3'，3〃，3苁)，1.30-1.25(m，nxH)，0.94(t，Me-18'，18〃，18苁)；13CNMR(CDCI3，100MHz)Sppm：173.21(C-1'，C-1苁)，172.80(C-1〃)，130.20，130.19，130.01，129.60，128.08，127.90(C-9'，C-10'，C-9〃，C-10〃，C-11〃,，c-12苁），68.96(C-2)，62.12(C-1，C-3)，34.10(C-2'，C-2〃，C-2〃)，31.76(C-16'，C-16〃，C-16〃），29.74-29.10(MxC)，27.18(C-8'，C-11'，C-8〃，C-11〃，C-10〃，C-13〃），24.85(C-3'，C-3〃，C-3〃)，22.66(C-17'，C-17〃，C-17〃)，14.02(C-18'，C-18〃，C-18〃)。化合物4的波谱数据与文献[7]报道一致，故鉴定为1-0-(11Z-十八碳烯酰）-2-0-(9Z-十八碳烯酰）-3-0-(9Z-十八碳烯酰）甘油酯。

　　化合物5:淡黄色固体，易溶于石油醚、乙酸乙酯、氯仿，不溶于甲醇、水。EI-MS:m/z882[M]+，结合化合物的^NMR与13CNMR核磁数据与甲酯化后的气相质谱图数据，确定化合物的分子式为C?H1ffiOe，其不饱和度为7，结构中含有3个羰基季碳，9个次甲基（8个双键烯碳，1个连氧叔碳），44个亚甲基（其中2个为连氧的仲碳），3个甲基，数据提示为长链脂肪酸甘油酯类结构。由甘油醇结构部分的^NMR信号S4.29(2H，dd，J=11.9，4.3Hz，1a-H，3a-H)，4.14(2H，dd，J=11.9，5.9Hz，1b-H，3b-H)和5.26(1H，m，2-H)判断，其3个羟基皆被酯化。该推断进一步被13CNMR谱的羰基信号S173.16(2xC)和172.76(1xC)所证实。^NMR和13CNMR谱进一步表明3个酯化片段为长链脂肪酸酯。化合物5经过NaOH/MeOH水解，BF3(1mol/L)甲酯化，通过GC-MS检测，得到3个水解产物，分别为11Z-十八碳烯酰甲酯、9Z-十八碳烯酰甲酯和9Z，12Z-十八碳二烯酰甲酯，且峰面积比值约为1:1:1。在EI-MS中，该化合物裂解片段有m/z265，分别为11Z-十八碳烯酰基（A)和9Z-十八碳烯酰基(B);m/z263，为9Z，12Z-十八碳二烯酰基（C);13CNMR中27.2(邻近双键的碳）的信号可知片段A、片段B和片段C中双键为cis构型，如为trans构型，则相应碳信号出现在32-34[4]。双键的位置通过如下碎片离子推测为位于1T(12J位：m/z85[C6Hb]+，m/z111[C8Hb]+;9〃(10〃)位：m/z113[C8H?]+，m/z139[CwH19]+;9〃（10〃)位：m/z111[C8Hb]+，m/z137[C10H17]、12〃（13〃)位：m/z71[C5Hu]+，m/z97[C?Hb]+;3种长链脂肪酸与甘油醇成酯顺序由EI-MS谱的裂解片段峰确定：m/z797和m/z771为裂解A片段中双键片段后的片段峰，表明A片段与甘油醇的1-OH成酯。m/z603为裂解C片段后的片段峰，表明C片段与甘油醇的3-OH成酯。B片段与甘油醇的2-OH成酯。EI-MS(m/z):882[M+]，797，785，771，745，632，603，601，534，508，506，480，355，339，281，279，265，263，139，137，113，111，98，97，85，71，55。1HNMR(CDCl3，400MHz)Sppm：5.35(m，H-11'，12'，9〃，10〃，9〃，10〃，12〃，13〃)，5.26(m，H-2)，4.29(dd，J=11.9，4.3Hz，H-1a，H-3a)，4.14(dd，J=11.9，5.9Hz，H-1b，H-3b)，2.78(m，H-11〃)，2.33(m，H-2'，2〃，2〃)，2.07(m，H-8'，11'，8〃，11〃，8〃，14〃)，1.46(m，H-3'，3〃，3〃)，1.30-1.25(m，nxH)，0.90(t，Me-18'，18〃，18〃）；13CNMR(CDCl3，100MHz)Sppm：173.16(C-1'，C-1〃)，172.76(C-1〃)，130.22，130.03，130.00，129.96，129.70，129.67，128.08，127.90(C-11'，C-12'，C-9〃，C-10〃，C-9〃，C-10〃C-12〃，C-13〃)，68.91(C-2)，62.10(C-1，C-3)，34.02(C-2'，C-2〃，C-2〃），31.73(C-16'，C-16〃，C-6〃)，29.74-29.10(MxC)，27.18(C-8'，C-11'，C-8〃，C-11〃，C-8〃，C-14〃），25.63(C-11〃），24.85(C-3'，C-3〃，C-3〃)，22.66(C-17'，C-17〃，C-17〃)，14.02(C-18'，C-18〃，C-18〃）。化合物5的波谱数据与文献[7]报道一致，故鉴定为1-0-(11Z-十八碳烯酰）-2-0-(9Z-十八碳烯酰）-3-0-(9，12Z-十八碳二烯酰)甘油酯。

化合物6:白色片状固体，易溶于石油醚、乙酸乙酯、氯仿，不溶于甲醇、水。EI-MS(m/z):284(M+)，256，129，115，97，83，73，60，43。[HNMR(CDCl3，400MHz)Sppm：2.34(2H，m,H-2)，1.63(2H，m，H-3)，1.26(28H，brs,H4-17)，0.88(3H，t，J=6.8Hz，H-18)。化合物6的波谱数据与文献[8]报道一致，故鉴定为十八碳烷酸。

　　3讨论

　　本研究从灵芝孢子油中分离鉴定了6个化合物，其中包括5个甘油三酯类化合物和1个脂肪酸类化合物，5个甘油三酯类化合物均为首次从灵芝属中分离得到，十八碳烷酸为首次从灵芝孢子油中分离得到。一般认为灵芝孢子油的临床作用与其含有丰富的不饱和脂肪酸特别是油酸、亚油酸有密切的关系，对于油酸、亚油酸等游离脂肪酸的检测多采用甲酯化气相色谱法[9-m];但不经过系统的化学成分分离，单纯采用甲酯化气相色谱法测定灵芝孢子油中的游离脂肪酸，必定对灵芝孢子油中甘油三酯类化合物同时进行水解并检测，因此单纯采用甲酯化气相色谱法检测灵芝孢子油中油酸、亚油酸等游离脂肪酸的结果并不准确。根据最新报道：甘油三酯在灵芝孢子油中的质量分数高达18%，为灵芝孢子油主要成分之_。本研究的结果为灵芝孢子油进一步的药理药效研究提供了物质基础。

　　在分离纯化过程中，由于甘油三酯类化合物的结构性质类似，利用传统的分离手段进行分离纯化比较困难，因此采用制备液相分离，从而达到较满意的纯化效果，这为甘油三酯的分离提供了条件。