转GNA基因菊花叶片离体的技巧分析
【摘要】本实验以转雪花莲凝集素(GNA)基因菊花的9种不同转化克隆的植株为实验材料,通过这9种不同型的植株来测定转基因菊花的再生繁殖能力,从而为菊花的扩繁提供一定的实验依据。本实验用于培养转基因菊花叶片的培养基是在MS最适培养基的基础上再加30mg/L的卡那霉素,经过1个多月的培养和观察,发现在这9种转化克隆的植株中繁殖能力存在一定的差距,其中20号、42号、72号、87号的再生能力最强,2号的最差,其余几种的再生能力居中,但也有少许不同。
【关键词】基因; 菊花叶片; 克隆
【中图分类号】TU377.9+3【文献标识码】B【文章编号】2095-3089(2012)09-0287-02
前言
菊花的转基因早在1989年就被Lemineux利用农杆菌介导法首次获得成功,此后国内外关于菊花转基因的报道较多,Ledger等首次详细描述了用野生菊花叶片通过农杆菌LBA4404(含二元质粒pGA643)利用叶盘法转化菊花,获得约1%的转化率;Renou等使用超毒力菌株EHA101,用节、节间和叶的外植体接种后共培养一段时间,然后用潮霉素进行筛选,获得了转基因菊花;傅荣昭等将兔防御素NP-1基因导入菊花,获得抗卡那霉素植株;Takatsu等将水稻几丁质酶基因用农杆菌介导法转移到菊花中,获得了3株经ELISA检测对菊花灰霉病有及强抗性的植株①以及王关林等将雪花莲凝集素导入菊花中,获得了抗蚜虫性状的转基因菊花植株②。但是,转基因植物存在着外源目的基因在转基因植株当代及后代中表达水平低,遗传不稳定,甚至发生外源基因沉默等现象,这些现象都限制了转基因植物的商品化进程,本实验用以NPT-Ⅱ为选择标记基因的转雪花莲凝集素基因的菊花克隆试管植株为材料,测试叶片在附加卡那霉素的选择再生能力,从而分析外源基因的表达水平,这对分析外源基因在转基因植株种的表达规律有一定的参考作用,也对转基因菊花的组培扩繁工作有一定的积极意义。
1材料和方法
1.1材料: 9种转GNA基因的菊花试管苗
非转基因菊花试管苗
本实验用的全部材料由辽宁师范大学植物生物技术重点实验室提供。
1.2选择再生培养基的配制表1 MSMS0培养基的成分及母液配制
表2 MS培养基的配制母液取用表
糖30g/L,琼脂7g/L,PH5.8
6-BA 8mg/L,IAA 0.8mg/L
灭菌温度121℃,灭菌时间20min,压力103.4kp
温度冷却至40℃左右,加卡那霉素30mg/L
1.3接种与培养: 在超净工作台上,灭菌操作分别剪取9个克隆试管植株叶片,每株5片,从顶部第二节叶片开始,依次往下,用剪刀垂直主叶脉剪两刀,但不完全剪断,只需剪断主叶脉即可,其他部分保持相连,然后将叶片近轴面向上平放于培养基上,同一植株的5片叶片接种在同一瓶内,每个转化克隆的植株做3瓶平行实验,分别编号为A、B、C。对照实验用3株未转基因的菊花试管苗叶片,接种在选择再生培养基中,在相同的条件下培养③④。
培养条件是在2000LX左右光照约10h/d,培养温度为25℃左右。
1.4观察与统计: 每3天观察一次叶片变化,6周时统计不定芽再生频率。
不定芽再生频率=再生不定芽的叶片数/接种叶片数×100%
2结果与分析
菊花离体叶片在选择再生培养基上培养约两周87号和72号转化克隆的菊花叶片即有少数不定芽生出,一个月后,大部分转化克隆的菊花叶片都生出了不定芽,没有长出不定芽的叶片切口处形成疏松膨大的愈伤组织,而对照的培养基中一直都没有不定芽生长,切口处也有愈伤组织形成,但不膨大。各转化克隆的不定芽再生频率及不定芽密度(同一叶片上再生不定芽的多少见图1)见表3表3 再生频率及不定芽密度
备注:由于不定芽的密度较大数量不易统计,故用“+”表示叶片再生不定芽的程度表3表明非转化植株的再生频率为0,而所有被测转化克隆植株均有不定芽再生,这表明转化植株叶片均有NPT-Ⅱ基因表达。虽然各转化克隆植株的转化频率相差不悬殊(2号克隆除外),但在芽密度上却表现出明显不同,这表明NPT-Ⅱ基因在不同转化植株叶片中表达水平不同。两项指标综合分析,9个转化克隆中NPT-Ⅱ基因表达最大的有20号、42号、72号、87号,占总克隆的4/9,表达较好的是12号和35号,占克隆的2/9,表达较差的是6号和22号,占2/9,2号表达水平极低,占总克隆的1/9。造成转基因菊花和非转基因菊花叶片在相同培养基和相同培养条件下出芽情况不同的是培养基中的卡那霉素,卡那霉素是植物遗传转化的选择标记基因,这种选择性标记基因具有对选择性物质特殊的抗性,使转化的细胞能在选择性培养基中继续存活生长,而没有转化的细胞被培养基中的选择性物质抑制或杀死,从而达到筛选的目的⑤。在转基因植物的不同克隆型植株的培养过程中,能使再生不定芽频率产生差距的原因很多,其中与叶片的叶龄,部位、大小等生理差异都有一定的关系。
3讨论
外源基因在转基因植株中表达的研究是目前植物基因工程研究的热点问题之一。本实验表现出的不同转化克隆的植株再生能力存在差异与各转化克隆中外源基因整合情况有关,如外源基因整合位点及整合方式等是影响其表达的重要原因,还可能是由于整合的外源DNA易发生结构变化和修饰,如DNA片段分离、丢失、甲基化等。本实验涉及的这9个转化克隆中其NPT-Ⅱ基因在菊花染色体的整合位点、整合方式等尚未做详细研究,以本实验的 第一论文网材料进行表达水平与整合方式的深入研究是一个有价值的课题。此外在这次实验中表现出来的叶片在选择培养基上的差异与叶片的生理状况有关,虽然本实验中每个培养瓶中叶片的部位、叶龄、大小都基本相同,但叶片的生理差异是在所难免的,另外叶片在培养过程有的发生卷曲使得叶片切口处不能接触到培养基,不能很好的吸收营养,也是导致不同转化克隆的植株再生能力产生差异的原因。
总之本次实验验证了外源NPT-Ⅱ基因在转基因菊花叶片中能够表达,同时也验证了雪花莲凝集素基因能在转基因菊花中得到表达,它们赋予了叶片在选择培养基上很强的再生能力。本实验所用的转化材料是2年前进行基因转化所获得的,至今试管苗已经经过了十几次继代培养,实验表明外源基因在继代培养上基本是稳定的。
注释:
[1]蒋细旺,包满珠,吴家和,张献龙,田颖川.农杆菌介导CryIAC基因转化菊花.园艺学报.2005,32(1):65-69
[2] 王关林,刘彦泓,郭绍华,王宇,纪彦,方宏筠.雪花莲凝集素基因转基因菊花及转基因植株的抗蚜虫性研究.遗传学报.2004,31(12):1434-1438
[3] 崔德才,徐培文.植物组织培养与工厂化育苗.北京.化学工业出版社.2003.5:22-43,283
[4] 胡繁荣。丰香草莓叶片离体再生的试验研究.辽宁农业职业技术学院学报.2001
[5] 郭勇,崔堂兵,谢秀祯.植物细胞培养技术与应用.北京.化学工业出版社.2004.1:72