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石腊包埋切片用途论文期刊

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石腊包埋切片用途论文期刊

石蜡切片:组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法

组织学中最常用的是苏木精(Hematoxylin)和伊红(Eosin)染色法,简称HE染色法。苏木精使细胞核和细胞质内的嗜碱性物质着蓝紫色,伊红使细胞质基质和间质内的胶原纤维等着红色。石蜡包埋可以切制较薄的切片,更便于观察,也可用作永久装片。

shí là qiē piàn

paraffin section

切片刀,切片机,恒温箱,温台,熔蜡炉,蜡杯,酒精灯,蜡铲,展片台,解剖刀,解剖针,解剖剪,解剖盘,培养皿,吸管,镊子,单面刀片,台木,毛笔,洒精灯,包埋纸盒,染色缸,盖玻片,载玻片,玻片盘,树胶,树胶瓶,显微镜,温度计,脸盆,水浴锅。

卡诺氏固定液、FAA固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、埃利希苏木精染液, 1%伊红酒精溶液,1%盐酸酒精溶液,甘油蛋白粘片剂,郝普特氏粘片剂,中性树胶。1%番红,1%固绿,1%过碘酸,Schiff试剂,0.5%偏重亚硫酸钠溶液,醋酸酐吡啶混合液,0.5%~1%淀粉糖化酶溶液。

鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、茎、叶等。

切片机,切片刀,温台,恒温箱,熔蜡炉,水浴锅等这类几个小组用一台就行;解剖刀,单面刀片,小台木,毛笔一只,蜡铲一个,盖玻片和载玻片30个,脸盆一个,酒精灯各一个,包埋纸盒2~3个,染色缸一个,瓷杯3个,显微镜一台。

FAA固定液50ml、1%番红100ml、1%固绿100ml、1%过碘酸100ml、Schiff试剂100ml、亚硫酸盐300ml、醋酸酐吡啶混合液100ml、0.5%~1%淀粉糖化酶溶液200ml,石蜡半盒、蜂蜡10块、埃利希苏木精染液100ml、1%伊红酒精溶液100ml、1%盐酸酒精溶液100ml、95%酒精5瓶、二甲苯2瓶,甘油蛋白粘片剂数滴,中性树胶数滴。

小白鼠一只、蚕豆种,小麦和大豆种10~20粒,洋葱和大蒜由实验室统一种,然后取其所需部分。

—苏木精伊红对染法

1、 熟悉石蜡切片的制作过程。

2、 掌握HE染色的基本原理和染色方法。

石蜡切片是最基本的切片技术,冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法(简称H.E.对染法)是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛,对组织细胞的各种成分都可着色,便于全面观察组织构造,而且适用于各种固定液固定的材料,染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色,细胞核被苏木素染成蓝紫色,细胞质被伊红染色呈粉红色。

(一) 器材

切片机,切片刀,温台,恒温箱,解剖刀,镊子,剪刀,解剖针,单面刀片,小台木,洒精灯,包埋纸盒,染色缸,烧杯,水盆,熔蜡炉,蜡杯。

(二) 试剂

卡诺(Carnoy)固定液,埃利希苏木精染液,1%伊红酒精溶液,1%盐酸乙醇液,各级酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%),二甲苯,甘油蛋白粘片剂,中性树胶。

试剂配法:

1、卡诺氏固定液:

100%酒精3份

冰醋酸 1份

或:100%酒精6份

氯仿 3份

冰醋酸 1份

2、埃利希苏木精染液的配法:

苏木精 1g

纯酒精 50ml

冰醋酸 5 ml

甘油 50 ml

钾矾(硫酸铝钾)约5g(饱和量)

蒸馏水 50 ml

配法:

ⅰ、将苏木精溶于约15 ml的纯酒精中,再加冰醋酸后搅拌。

ⅱ、当苏木精溶解后即将甘油倒入并摇动容器,同时加入其余的酒精。

ⅲ、将钾矾在研钵中研碎并加热,然后将它溶解于水中。

ⅳ、将温热的钾矾溶液一滴一滴地加入上述染液中,并随时搅动。

ⅴ、此液混合完毕,将瓶口用一层纱布包著小块棉花塞起来,放在暗处通风的地方,并经常摇动以促进它的成熟。成熟时间约3~4周。若加入0.2g碘酸钠,可立刻成熟。此液稳定而染色均匀,染核效果良好,不会发生沉淀,长期贮备无妨。此液可分别与伊红等进行二重染色。

3、1%伊红酒精溶液:

伊红1g溶于100 ml95%酒精溶液。

4、1%盐酸乙醇液

盐酸 1份

70%酒精 100份

5、甘油蛋白贴片剂:

蛋白 50 ml

甘油 50 ml

水杨酸钠(防腐剂) 1g

配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中,去蛋黄留下蛋白,用玻棒调打成雪花状泡沫,然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中,经数小时或一夜,即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加等量的甘油,稍稍振摇使两者混合。最后加入防腐剂(水杨酸钠)作防腐用。可保存几个月。

(三) 材料

鼠肝

1、 取材

颈椎脱臼法处死小鼠,打开腹腔,剪取肝组织(或小肠)。切取的组织块不宜太大,以便固定剂穿透,通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织,切成一小块2~3mm厚。

取材的注意事项:

(1)取材动作要迅速,不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

(2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择,尽可能不要损伤所需要的部分。

2、固定

将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下,立即投入卡诺固定液中固定,固定30~50min。

固定的注意事项:

(1)一般固定液,都以新配为好,配好后应贮存在阴凉处,不宜放在日光下,以免引起化学变化,失去固定作用。

(2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定时就没有作用了。

(3)固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的20~30倍,有些水分多的材料,中间应更换1~2次新液。

(4)材料固定完毕后,保存于严密紧塞或加盖的容器里,同时在容器外上标签,并随同材料在溶液中投入相应的标签,以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字,应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。

1、 洗涤

材料经固定后,除乙醇外,组织中的固定液必须冲洗干净,尤其是含有重金属的固定液。因为残留在组织中的固定液,有的不利于染色,有的产生沉淀或结晶影响观察。冲洗方法根据固定液的性质而定,固定液为水溶液的常用水洗涤,固定液含有乙醇的则用50%~70%乙醇冲洗。

2、 脱水

30%、50%、70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水各40min,放入95%、100%各两面三刀次,每次20min。各种材料经固定与洗涤后,组织中含有大量水分,由于水与石蜡不能互溶,所以必须将组织中的水分除去。

脱水注意事项

(1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分。

(2)在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。

(3)在低浓度或纯酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。

(4)在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。

(5)如需过夜,应停留在70%酒精中。

(6)脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象

5、透明

纯酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯0.5h(或至透明为止),须换一次二甲苯。

由于乙醇与石蜡不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡,所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时,光线可以透过,组织呈现出不同程度的透明状态。

透明注意事项

(1)使用透明剂时,要随时盖紧盖子,以免空气中的水分进入。

(2)更换每级透明剂,动作要迅速,一方面为了不使材料块干涸,另一方面能避免吸收湿气。

(3)在透明过程中, 如果材料周围出现白色雾状,说明材料中的水未被脱净,应退回纯酒精中重新脱水,然后再透明。

6、透蜡

放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min,再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各20~30分钟。

透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等),使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以

便包埋。透蜡时间根据组织的透蜡时间较长,约需1~2d。透蜡应在恒温箱内进行,并保持箱内温度在55~60℃左右,注意温度不要过高,以免组织发脆。置于恒温箱0.5h。

透蜡注意事项

(1)尽量保持在较低温度中进行,以石蜡不凝固为度;

(2)透蜡温度要恒定,不可忽高忽低;

(3)操作要迅速,力求在最短的时间内完成石蜡透入过程,以免引起组织变硬、变脆、收缩等。

1、 包埋

将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡,一起倒入容器内,然后立即投入冷水中,使其立刻凝固成蜡块。

用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间,包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素,选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为52~56℃,植物材料用的石蜡熔点为54~58℃。

包埋的操作过程

包埋时,将纸盒放在已经加热的温台上,从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯,倒入包埋用的纸盒中,取出存放材料的蜡杯3,迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部(注意切面朝下放置),再用温镊子轻轻拨动材料,使之排列整齐。轻轻将纸盒两侧的把手提起,慢慢地平放在面盆,并立即使它沉入水中,使盒中包埋块迅速凝固。待石蜡完全凝固(约30min)后即可取出备用。

2、 切片

①将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。

②将切片刀固定在刀夹上,刀口向上。

③摇动推动螺旋,使石蜡块与刀口贴近,但不可超过刀口。

④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置,刀片与石蜡切片约成15度左右。

⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度,一般为4~10微米。

⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮,让蜡块切成蜡带,左手持毛笔将蜡带提起,摇转速度不可太急,通常以40~50r/min。

⑦切成的蜡带到20~30cm长时,右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起,以免卷曲,并牵引成带,平放在蜡带盒上,靠刀面的一面较光滑,朝下,较皱的一面朝上。

⑧用单面刀片切取蜡片一小段,放在载玻上加水一滴,置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。

⑨切片工作结束后,应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蜡,把切片机擦拭干净妥为保存。

3、 贴片

①、取一片清洁的载玻片,滴一滴粘片剂于玻片中央,然后用洗净的手指加以涂抹,便成

均匀薄层。

②、滴1~2滴的蒸馏水已涂粘片剂的载玻片上。

③、用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带,放在水面上,注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上,并使之处于稍偏玻片的一端,另一端便于粘贴标签。

④、把玻片摆好片位置,在酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展。或放置置于预先加热的展片台上(温度保持在40~45℃)。此时蜡片因受热而伸展摊平。并使之处于稍偏玻片的一端,另一端便于粘贴标签。

⑤、展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于37℃温箱烘干,一昼夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。

10、脱蜡复水

石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min,然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各3~5min,再放入蒸馏水中3min。

染色液多数为水溶液,因此,染色前必须将蜡脱去,使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡,逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反,但是,由于蜡片较薄,所需时间比脱水浸蜡要短的多。

11、染色

切片放入苏木精中染色约10~30min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低,适当缩短或延长。室温高时促进染色,染色时间可短些,否则可适当延长时间,冬季室温低时可放入恒温箱中染色。

12、水洗

用自来水流水冲洗约15min。冲洗过程中使切片颜色发蓝(或放入堿性水中也可,但用促蓝剂对伊红可能拒染,如果时间来得及,应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜),但要注意流水不能过大,以防切片脱落,并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。

13、分化

就是将细胞质著的色褪去,使细胞核着色更加鲜明,也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液(盐酸1份+70%乙醇100份)中褪色,见切片变红,颜色较浅即可,约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键,,如分化不当会导致染色不匀,或深或浅,得到的切片染色效果差。如果染色适中,可取消此步骤。

14、漂洗

切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚;细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次。

15、脱水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5min。

16、复染

用0.5%伊红乙醇液对比染色2~5min。伊红主要染细胞质,着色浓淡应与苏木精染细胞

核的浓淡相配合,如果细胞核染色较浓,细胞质也应浓染,以获得鲜明的对比。反之,如果细胞核染色较浅,细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染,促使细胞质容易着色,并且经乙醇脱水时不易褪色。

17、脱水Ⅱ

放入95%乙醇中洗去多余的红色,然后放入无水乙醇中3~5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。

18、透明

切片放入二甲苯乙醇等量混合液中约5min,然后放入纯二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯应尽量保持无水,应经常更换,或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象,说明脱水未尽,应退回乙醇中重新脱水,否则切片难以镜检。

19、封藏:中性树胶封存

切片经染色、脱水、透明后,即可用封藏剂将其封藏起来,目的是永久保存切片,便于镜检。常用的封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶、加拿大树胶等,另一类为湿性封藏剂如甘油明胶等。如果切片是经二甲苯透明,则用树胶作为封藏剂,树胶可以用二甲苯稀释至合适的稠度。如果切片是直接从水中或水溶液中取出,则常用甘油明胶作为封藏剂,可用于短期保存标本。

封藏的方法:

封片前应根据材料的大小,选用不同规格的盖玻片。材料透明后,按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁净的吸水纸,将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上(切片的一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(千万不能待二甲苯干燥后再进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角,然后再缓慢地将盖玻片放下,这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足,可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多,可在干燥以后用刀刮去,并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。

染色结果:细胞核被苏木素染成蓝色,细胞质被伊红染色呈粉红色。

——番红固绿对染法

1、 熟悉植物石蜡切片的制作过程。

2、 掌握番红固绿对染法的基本原理和具体方法。

石蜡切片法也是在研究植物细胞的形态结构等方面常用的制片方法。它可以使植物材料切成薄的薄片,又可以切成连续薄片,切片经染色,观察效果甚好。番红固绿对染法,为

植物制片上最普遍的一种二重染色法,其染色程序简单并能清晰地显示出细胞的结构。番红为堿性染料,能使细胞核及木质化的细胞壁染成红色;固绿为酸性染料,能使细胞质及纤维素的细胞壁染成绿色。

(一) 器材

切片刀,切片机,温箱,温台,解剖刀,镊子,单面刀片,台木,毛笔,蜡铲,酒精灯,包埋纸盒,染色缸,玻片盘,温度计,脸盆。

(二)试剂

FAA固定液,1%番红,1%固绿,各级酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%),二甲苯,石蜡,郝普特氏明胶粘片剂,树胶。

试剂配法:

1、FAA固定液(福尔马林醋酸洒精混合液)

福尔马林 5 ml

50%或70%的洒 90 ml

冰醋酸 5 ml

此液适用于植物组织,此液中的酒精,有用50%的,也有用70%的,一般薄嫩的材料右用50%的,厚硬的材料用70%的,醋酸的用量也可根据材料情况作适当的改变,对一些大块而密实的组织可增加用量,同时减少福尔马林的用量。固定时间可因材料及醋酸含量的变化而异,一般为5~20h。固定的材料,一般无需用水洗,可直接从70%的酒精开始脱水。

1、 1%番红

番红1g溶于100ml水中。

2、 1%固绿

1g固绿溶于100ml95%酒精中。

3、 郝普特氏明胶粘片剂

明胶 1g

蒸馏水 100ml

石炭酸 2g

甘油 15ml

配制时先将明胶溶解于30℃的蒸馏水中(在水浴锅内进行),待溶解后再加石炭酸和甘油,搅拌均匀后,趁热过滤,贮存于玻璃瓶中。

(三)材料

大豆、小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆等。

1、 取材

取已培养好的大豆、小麦、蚕豆根或茎、叶等用刀片将其尖端约1.2cm根尖切割下来,用刀

片切割其成熟区部分成5mm长的小段(亦可切带侧根的部分),将切好的材料放入玻管中。

2、 固定

将FAA固定液倒入盛有材料的玻管中,固定时间为24h。

3、 冲洗

用70%酒精换洗3次,每次0.52h。

4、 脱水

80%、90%酒精各12h,纯酒精(中间换一次)12h。

5、 透明

等量纯酒精及二甲苯中12h,二甲苯(中间换一次)12h。

6、 透蜡

方法同前。

7、 包埋

方法同前。

8、 切片

根为横切面,其厚度为8~10um。

9、 贴片。

方法同前。

10、 番红固绿对染法染色程序如下:

(1)切片在二甲苯中脱蜡,约10min。

(2)等量纯酒精二甲苯5min。

(3)经纯酒精,95%、90%、80%、70%、505、305各级酒精各5min。

(4)蒸馏水25min。

(5)1%番红水溶液染色2h左右。

(6)用水洗去多余染液。

(7)50%、70%、80%、90%、95%各级酒精脱水10min。

(8)1%的固绿(用95%酒精配制)染色1040s。

(9)95%酒精洗一下。

(10)纯酒精脱水5min。

(11)等量纯酒精二甲苯混合液中5min。

(12)二甲苯5min。

(13)中性树胶封藏。

注意:

(1)番红与固绿在酒精中很容易脱色,因此在酒精中脱水时,不能放置太久。

(2)用固绿对染之前应检查番红染色的是否合适,所染颜色应稍深一些,以防其在以后脱水步骤中仍会脱色,如果太浅,应退回重染。

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石油石化节能期刊

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石油工业计算机应用期刊

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糕点切片机毕业论文

浙江兰溪有江南第一早茶之称,根据兰溪市志记载,兰溪的小吃种类在顶峰期曾多达300余种。早茶文化因水运之利而兴起:跑船的、店伙计、商贾在忙活之前一定得喝杯早茶,吃些点心。

如今的江面虽已不见曾经川流不息的货船,也并无彼时商铺林立的沿江码头,但兰溪的早茶街依旧热闹,遍布着烟火气......

这份对于食物的专注,不仅体现在其街头巷尾的诸多小吃之中,也浸润在了许许多多当地人的血脉里。

缪君自出生起便带着这份和食物最紧密的链接,一路与她相随,直到遇见了欧亚大陆另一头的法国美食文化。

小时候的缪君做的梦都是与食物相关的,她长大后最想做话梅厂的厂长,这样她就可以有吃不尽的话梅了。

回忆起小时候的景象,她不曾记得在那个物质还相对匮乏的年代,有曾为吃发过愁。

缪君:“我们家从来没有因为吃而发愁,我外婆或者母亲都会将最简单的食材变化出来各种美食。家族里对美食有一种(吃多识广),见得多了吃得多了就会有感受。”

由于父母都是国营工厂的双职工,童年的很多时光是和外婆一起度过的。缪君的祖父母是两位能干的生活家,都做得一手好菜。曾经营着一家以当地的土特产为主的糕饼店。

在缪君出身后,曾经一块块香甜可口的绿豆糕、鸡蛋糕变成了一碗碗热气腾腾的馄饨与面条,外婆的面摊子承载着她小时候深刻的记忆。

缪君:“四岁的时候我就在外婆旁边帮忙做馄饨,而且是单手做的哦!左手拿馄饨皮,右手拿竹签。竹签里撇上一点肉末,左手一卷、一捏、一扔,就进锅了……

白天店里的案板用来制作面食,到晚上时就成了我们睡的床,这段经历印象很深。”

渐渐长大后,缪君和姐姐便早早地参与到照料家务的琐事之中。由于经常要独自在家,七岁时便能自己生火做饭了。

缪君:“最开始我们是用煤油炉做饭,后来我们烧柴火。

这其实是生活技能的学习,而不是知识的学习,但觉得非常受用。

我跟我姐遇到了困难或什么事情会自己去想办法,而不会过多去借助于他人,为此我个人感觉是,自己比较独立吧。”

这份由生活小事日积月累的独立和处理问题的能力在她二十多年后当远赴异乡之际,成为了她很好的保护伞。

除此之外,食物对于缪君而言是带着回忆和传承的。

她至今都能自豪地回忆起当年学校食堂蒸饭时,她的午餐饭盒永远是最令人瞩目的。

缪君:“我的饭盒里有的是五谷杂粮饭,会有各种东西:有莲子、黑米还有些核桃。因为我妈希望我们有个健康的身体,觉得我们饮食上必须要跟上,所以我们吃的是五谷杂粮。”

小小年纪的缪君和姐姐两人还很会捣鼓,在她们的厨房王国中她们做着各种各样的尝试,还有一些有着较高难度的烹饪,比如用生石灰洗西瓜子、卤西瓜子,做青苔、糖皮红果等等。

有时跟在母亲身边看着帮忙,有时自己动手母亲在一边指点,有时自己天马星空“捣腾”出些食物来。

这些带着回忆的动作被食物的气味包围,也让这份回忆带着母亲的味道。

时隔多年之后,当缪君为人母后,她接过了母亲手上的接力棒,带着女儿在厨房中冒险,这不仅仅是母女俩的亲密时光,更是一份家族关于对于美食饱含热爱之心的传承。

就这样,在行头百变的食材中,缪君度过了愉快的童年和无忧无虑的青少年时期。本以为扬帆起航之际,她却遭遇了情绪紧张,高考落榜的经历。

不过这次落榜反倒是成为她日后人生中非常重要的经历之一,她对情绪有了更深的认识与领悟,也在那时,她接触到了打坐和气功,有关静心修身的练习。

从一开始双脚疼痛到身体渐渐适应再到逐渐感受安宁,她从打坐中感受到心的力量。

第二年高考她顺利地考取了法语专业。第一次离家,开始了有关法语的征途。

语言学习的道路是漫长和痛苦的,缪君说自己并不属于那种拥有语言天赋的人。

作为笨鸟的她在大学四年里过得很简单,基本就是单纯的校园生活,埋头苦读。不过她的工具包里也并非一无所有,年少时做家务的经历很好地塑造了她其中一部分的特质。

缪君:“坚持的力量,可能是来自于从小和父母一起做家务吧,我想两者是有密切联系的。当时父母工厂倒闭内退,他们选择了小店经营,柴烟油米酱醋茶都有接触到。

比方说,我们家有卖米,最简单的销售大米。当时进货到店里的米,有很多的小石子和沙子掺杂着。为了提高米的销售,我们家做了一个步骤,就是用米筛把小石子杂质滤去。看似一个非常简单的动作简单,但事实上相当繁琐并考眼力。

暑假回来时,我就帮助父母在店里筛米,提高米的纯度,所以我们家的米在那个区域,卖得也是最好的。”

带着这样一股子坚持的劲儿,她顺利地完成了本科和研究生阶段的学习,同时承担了诸多法语教学的工作。后来机缘巧合下,缪君入职了世界五百强之一的法国米其林轮胎公司,担任技术口译与笔译的工作。

在存够了出国第一年所需的经费之际,和法语打了这么多年交道的她终于迎来了出国看看的机会,也开启了她与法国接下去这十五年的缘分。

只不过迎接她的并不是传说中巴黎的浪漫,而是来自巴黎顶尖翻译院校巴黎高翻颠覆式的严苛体验。

缪君:“第一年基本可以说自信心是彻底地毁灭,无论是从语言的程度还是逻辑思维,我个人觉得是一个彻底的打击。

在中国,虽然我们有过研究生的训练,不过那也就仅仅是写写小文章、硕士论文的训练。而在巴黎高翻,学习压力与强度比国内两年的都要强。

除了吃饭以外,基本上就在电脑面前、图书馆、教室里,周末也都是一样的节奏。”

缪君回忆说当时一周有近十门的课程,每门课每一周都要上交一份七八页的报告,除了昏天暗地的写作之外,几乎没有其它活动。

在如此高压的课业压力下,缪君收到了她第一份报告的成绩,第一次断崖式的打击:二十满分,她只拿到了四分(十分及格)!

当然收到这样的成绩,并不只她一人,还有不少学生在教室里当场就哭了。

高翻的残酷是外界都有所听闻的:等到缪君毕业时只剩下了七八位同学。

从没有批判性思维到法国学院式写作,从四分垫底到慢慢一点点匍匐前进,拿到十分,然后再是十二分,十四分。

半年飞跃式的变化,赢得了当时高翻教学主任的称赞,她说从没有见过在这么短的时间内,有学生能取得如此大的进步!

如同鲜美的食材需要经过慢火精心地熬制,缪君也在经历着相同的人生阶段。日子虽然艰难,但她依旧拥有好好做饭、好好吃饭、好好生活的心境。

就这样一转眼,她不仅获得了高翻研究生的毕业,而且也获得了翻译学博士阶段学习的机会。

在博士期间,她遇到了人生中的另一位恩师André Salem,在他的指导下,她的博士论文获得“非常优秀”的成绩。

这一份论文的背后是她五年的生命时光,比起研究生阶段的熬制,博士阶段的“食材烹饪”难度更大, 需要守着小火,以最大的耐心静待熬制出精髓的那一刻。

缪君:“本科阶段的学习像是一个海绵,你给他什么就可以吸收了,饱和了。研究生阶段好似爬山,但你看得到山的山顶,你只要爬上去就可以了,有了工具就能爬过去。但是对于博士阶段,那儿没有山的,而你需要造一座山出来。”

其实就是挖个坑自己跳,跳完还得爬上来。

在无止尽的参考书目中,缪君必须在前人已有的研究领域中提出自己的问题和猜测,在不停的阅读过程中,在不同的推导阶段中,她一次次面临着无数次的怀疑:自我的怀疑,导师的怀疑,亲朋好友的怀疑,也有过无数次想要放弃的时刻。

但靠着“饭要一口一吃,事要一件一件做”这句话背后巨大的生活能量,缪君支撑了过来。

加上当年高考失利后遇见了的静坐以及来到法国后接触到的太极,一起成为了缪君抚平情绪、继续出发的最牢靠的定心丸。

缪君:“在太极动作当中,如果你想要克服对方或者是战胜对方,一旦有了这样的想法时,其实已经输了。所以太极教会我们用平常心。”

开始读博的那段日子,她也想过加大火力让论文烹制的速度快一些,可以赶快结婚成家,找到工作,去赚钱,去拥有自己的事业。

但经历了波折,透过美食与太极,缪君逐渐领悟到大道理背后的共通真谛。心于是渐渐静下来,而后便有了“定”和“安”的力量,当她沉静下来梳理、表达自己观点时,便是她火力最旺之际。

五年的时间里,她用文火致熟的烹饪方式完成了属于她的味厚滋补论文大餐,这道大餐也获得了答辩时少有人能获得的最高等级的荣誉称号。

与此同时,她也脱胎换骨一般拥有了属于自己的人生精髓。

缪君:“读博结束后让我获得了一种自信心,这种自信心是如何获得的呢?

在海量阅读后,你获得了一个更广阔的天空,知道自己的知识盲点在哪儿,但与此同时,它也给了你一份力量,让你知道你有能力去学习。

(读博让你)无论何时,都会用一种批判性的眼光看待事物,而非执着于某一点,片面地看待问题。我想读博给了我全面看问题的(能力),也就是锻炼了自己的逻辑思维能力。”

博士毕业后的空档期,缪君度过了一段截然不同的生活。如果说读博阶段她体验的是法国高等教育的严苛和残酷,那在Potel & Chabot的甜点部实习的经历赋予她直击法国文化精髓之一的法餐,尤其是甜点的极致体验。

凭借着出色的自荐信和朋友的推荐,她把小时候外婆开糕点店的经历以及被食物包围长大的童年及青少年时期的故事写进了推荐信里。

无独有偶,负责招人的前世界甜点冠军Marc Rivière先生也和他的祖母有过一段类似的经历。当故事与故事相遇,毫无正规厨师训练的缪君被破格录取了。

让她没想到的是,小小的一块甜点背后居然是个如此复杂和庞大的世界。

缪君:“糕点里面有很多细分,比如有专门负责切水果的水果部,有制作巧克力的巧克力部,还有大糕点部、小糕点部还有冰激凌部,有非常多的细类。

我被分在巧克力和小糕点部门实习。每个部门的分工都很有讲究,比如切水果部门切水果的方式很讲究,要考虑到配合的糕点。

举个最简单的例子吧,比如说草莓?你要切丁、还是切片,一个切四瓣还是五瓣,事实上都是有讲究的。糕点各部门间经常有个协调工作,最后完成的时候,要把几个部门完成的内容合在一起。”

每块精致的甜点背后除了多部门的协调之外,还涉及到研发、口味、运输、外观、保存期限等等方面。比起品尝甜点时舒适惬意的环境,制作甜点的背后是甜点师们无数个小时的付出。

缪君每天早上六点半前就要抵达工作的地方,除去午饭的时间,要一直站着忙碌到下午的四点才能收工。

超高强度的工作量,严苛的法国食品卫生标准,极致的整理制作流程都让缪君对食材和美食的体悟上了一个全新的台阶,打开了新世界的大门。

其中最让她受益的是跟随着前世界甜点冠军的师傅学习,也让她发现了成为真正高手背后的秘诀。

缪君:“当时我师傅是把我叫过去,在他的手下工作,他给我们展示的是力道。他的每个动作都是带着心去完成的,而我们,在做同一动作时所欠缺的就是那份心。为此他做出来的糕点滋味,是与众不同的。”

缪君:“比如说我们拉裱花,裱花其实很简单,用力量去挤就可以。

但是在他手下,所使用的力道,裱花的方式以及角度,每个细节动作都不尽相同,为此所呈现出来的效果也自然不一样。

犹如我们写的书法。他所用的力量和我们所用的力道是完全不一样的。每一个动作,只有已经重复了上万遍,才会有炉火纯青的效果。”

当一个动作简单重复了上万次便练就了极致,美食背后追求极致的精神也正是人生中最值得珍藏的那个回味。

这,就是缪君的美味人生观。

无论到哪儿,无论遇见怎样的人生境遇,她都会遵循:好好买菜,好好做饭,好好吃饭这十二个字组成的简单又朴实的原则。

正因为这样,即使生活再艰难,食物入口的那一刻,便又是点燃生活的契机。

人生和美食其实有很多相似之处,人生的过程也犹如烹饪的过程,我们需要极大地关注当下的生活,把握好时机和火候。

珍惜出现在生命中的每个人,珍惜每一道遇见的食材,好好对待。

不同的人生际遇和顺序造就了人生不一样的可能性,于美食而言不也正是如此吗?

每个人做出的饭菜都带着他们各自的属性,也正因如此造就了无数道让你怦然心动的佳肴,百味的人生也造就了千百种人生的无限可能:香气四溢!光芒万丈!!热气腾腾!!!

文静:在法国这些年自己比较大的收获是什么?

缪君:我个人觉得在法国的阶段让我知道自己是什么样子的一个人,活出自我这点很重要

文静:在顶级的法餐餐饮行业实习,你作为中国人有什么特别之处吗?

缪君:我觉得我挺让他们有些震惊,这也得益于我小时候对于美食的熟悉程度吧。

比如说有一个师傅叫我制作蛋糕上花朵的中心,就用一点点红色圆形面皮切出来滚圆便可。他是用小刀来完成的。我刚开始也是按照他的方式,用小刀去切一根细条,但后来我发现效率太低了,于是按照自己的在中国做面食的这种经验来进行制作。

可以同时可以搓上两条、三条、然后五条。再用一个比较大的刀进行切割,然后再将小颗粒揉搓成小圆球。我也不是一颗一颗搓,而是十颗、二十颗一起搓,所以我可以在很短的时间内就制作许多颗。

其实是在糕点制作时是非常紧张的,每一个任务都是有一个时间限制,必须在一个规定时间内进行完成,要不然你会影响到下一个同事的承接。

我在将近十分钟内,制作了300多颗,远远高出于他们的水平!

还有一个细节就是我用到了筷子。之前他们用腰果外部包裹一层麦芽糖,他们基本上都是戴着手套,去慢慢一颗一颗去取腰果,而在这个过程中,手套不时被麦芽糖黏住。个人觉得这样的效率太低,于是第二天便从家里带了双消毒过的筷子,用筷子一夹,“嗖嗖嗖”地就取出来,而且又不粘手。于是大家对我刮目相看的(中西方用餐工具的借鉴)还蛮有意思的。

文静:美食和人生之间有着什么样的联系?

缪君:当下焦虑的情绪很普遍,这里有个很重要的点就是你不知道怎么生活了。这其实就回到了原点:你如何认识自我?如何生活?如何过每一天?

美食,你需要选菜、构思、购物以及制作,安排以上步骤其实是日常中很主要,也是很重要的点。此外在生活中和大家一起用餐,做哪些菜,可以成为一种话题,人与人之间的沟通基础。为此这些部分,可以说是除了工作以外的日子吧。但很多人比较盲目的是,只想通过工作来获得人生的成就感。

而这样往往忽略和家人陪伴这一过程。这个忽略后,那么所剩的目标就是努力赚钱,将赚钱作为人生终极目标。

在法国其实很注重这种饮食的交流,他们一餐可以吃四个多小时,聊起美食便滔滔不绝。

缪君和她的美食人生有着诸多的闪光之处,后期的创作仿佛是美食之旅一般。

这一篇文章是两个半小时的采访,八页稿纸,十多个小时的创作和后期制作才呈现在大家面前的作品。和耐心等待文火烹饪的美食一样,需要把心放进去才能让作品有灵魂,如同用心做的每一道菜。这也就是为什么你在吃一道菜的时候会流泪,在读到某个故事的时候会心潮澎湃。

在缪君的推荐下,这篇文章是伴随着《东京大饭店》这部日剧慢慢创作出来的。说来惭愧,来法一晃三年多,埋头苦学法语之余并没有好好领略法国文化的精髓之一:法餐。通过这部剧集,我对于厨师的刻苦和法餐的精髓,更重要的是对于食物的态度加深了很多地了解。

自从自己开始生活后,才发现要做到一日三餐好好吃饭有多么不容易,有些时候一忙起来便顾不了胃了,也没安下心来做饭。直到后来接触到一些会好好吃饭的人,发现他们的身上都带着一股淡淡的生活的智慧。

这股子智慧像是生活浓缩后萃取的精华在你最低迷无助的时刻,一碗热气腾腾的面,或者香气四溢的炒饭就能让你提振。

因为这份智慧背后是带着对食物的敬畏,对平凡小事的关照,包裹进了感受力里,当你入口的那一刻,它便迸发了力量。

要好好吃饭!那么,今天要吃点什么呢?

此系列由旅法三语内容创作者施文静发起,旨在记录101种不一样的人生。

只此一次的人生,可以有哪些不一样的可能?

施文静,专注人物故事创作 帮助你讲好自己的故事,提升故事的价值让更多人想要链接你 资深媒体人,前央视英语频道出镜记者,采访500+嘉宾 施文静的故事岛 品牌主理人 故事岛赋能成长社群 发起人

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学专班姓学

院:业:级:名:号:

指导教师:

一、工作任务的进展情况

1.开题报告结束后,张老师给我们开了有关中期准备工作的见面会,简要指导了我们接下来的任务;2.金相试样的制备

(1)金相检验是研究金属及合金内部组织的重要 方法 之一,为了在金相显微镜下正确有效地观察到内部显微组织,就需制备能用于微观检验的样品--金相试样,也可称之为磨片.金相试样制备的主要程序为:取样—磨光—抛光一浸蚀等.(2)取样原则:手工用金相显微镜对金属的一小部分进行金相研究,其成功与否,可以说首先取决手工用金相显微镜对金属的一小部分进行金相研究,其成功与否,可以说首先取决所取试样有无代表性.在一般情况下,研究金属及合金显微组织的金相试样应从材料或零件在使用中最重要的部位截取;或是偏析、夹杂等缺陷最严重的部位截取.在分析失效原因时,则应在失效的地方与完整的部位分别截取试样,以探究其失效的原因.对于生长较长裂纹的部件,则应在裂纹发源处、扩展处、裂纹尾部分别取样,以分析裂纹产生的原因.研究热处理后的零件时,因组织较均匀,可任选一断 面试 样.若研究氧化、脱碳、表面处理(如渗碳)的情况,则应在横断面(3)试样的截取:手工无论采取何种截取方法截取试样,都必须保证不使试样观察面的金相组织发生变化.软材料可用锯、车、刨等方法切取;硬材料可用水冷砂轮切片机、电火花切割等方法切取;硬而脆的材料(如白口铸铁),也可用锤击法获取.对于要测量表面处理层深的试样,要注意切割面与渗层面垂直.研究轧制材料时,如研究夹杂物的形状、类型、材料的变形程度、晶粒拉长的程度、带状组织等,应在平行于轧制方向上截取纵向试样;如研究材料表层的缺陷、非金属夹杂物的分布,应在垂直轧制方向上截取横向试样.金相试样较理想的形状是圆柱形和正方柱体.以具体情况而定.一般可取高为10~15mm,直径φ1o~15mm;方形试样边长为10~15mm为宜.在实际工作中,由于被检材料和零件的品种极多,要在材料和零件上截取理想的形状与尺寸有一定的困难,一般可按实际情况决定.但是以试样的高度为其直径或边长的一半为宜,形状与大小以便于握在手中磨制为原则(4)试样打磨:手工磨光的目的是要能得到一个平整的磨面,这种磨面上还留有极细的磨痕,这将在以后的抛光过程中消除.磨光工序又可分为粗磨和细磨两步.

粗磨:手工对于软材料可用锉刀锉平,一般材料都用砂轮机磨平.操作时应利用砂轮侧面,以保证试样磨平.要注意接触压力不宜过大同时要不断用水冷却,防止温度升高造成内部的组织发生变化.最后倒角时防止细磨时划破砂纸.但对需要观察脱碳、渗碳等表面层情况的试样不能倒角,有时还要采用电镀敷盖来防止这些试样边缘倒角.粗磨完成后,凡不作表面层金相检验的棱边都应倒成小圆弧,以免

在以后的工序过程中会将砂纸或抛光物拉裂.甚至还可能会被抛光物钩住而被抛飞出外,造成事故.

细磨:手工细磨的目的是消除粗磨遗留下来的深而粗的磨痕,为抛光作准备.细磨本身包括多道操作,即在各号砂纸上从粗到细顺序进行.手工细磨的磨削工具是砂纸.按照磨料颗粒粗细尺寸砂纸分为各种规格,分别编号.手工手工磨光法是把使用放在垫有平玻璃板或平铁板的金相砂纸上进行推磨.为了保证试样试面平整而不产生弧形,在磨面上所施力应力求均衡,磨面与砂纸完全接触.同时磨削应循单方向进行,向前推行时进行磨削,回程时把试样提离砂纸.细磨时一般依次从0号(w40)开始,逐一换细一号的砂纸推磨,一般钢铁试样磨到04号砂纸,软材料如铝、镁等合金可磨到05号砂纸.每换下一号细砂纸时,应将试样和手冲洗干净,并将下面垫的玻璃板擦干净,谨防粗砂粒掉入细砂纸上,同时磨面方向应旋转90°,以便观察上次磨痕是否磨掉.在细磨较软的金相试样时,如铝、镁、铜等有色金属是应该在砂纸上涂一层润滑剂,可防止砂粒嵌入软金属材料内,同时减少表面撕损现象.常用的润滑剂有机油、石蜡、汽油溶液、汽油、皂化水溶液、甘油水溶液.制取的试样:

编号1.12.1

炉号2j061022j06101

钢种16mndr16mndr

规格mm1260

试样方向横向横向

下屈服强度抗拉强度

382341

536513

伸率3129.5

编号1.1

冲击温度-10-20-30-40-50

冲击96422824287945163

冲击2376295

冲击38222223721376137

平均值742222299914844

金相编号101112

备注板边中心1∕4

1.2-10-20-30-40-50

2.1-10-20-30-40-50

202122

板边中心1∕4

2.2-10-20-30-40-50

根据以上数据的顺序绘制冲击性能与温度的变化曲线:

二、未按计划完成工作任务的原因

已完成

三、工作中遇到的问题及改进 措施

数据处理,学习了origin数据处理的方法,成功地绘制出了变化曲线.四、下一步 工作计划

第9周至第10周抛光,制取要观察试样,照照片,第11周结合变化曲线观察分析16mndr低温压力用钢的力学性能

试样抛光手工抛光的目的是除去金相试样磨面上由细磨留下的磨痕,成为平整无疵的镜面.

尽管抛光是金相试样制备中的最后一道工序并由此而得光滑的镜面,但金相工作者的 经验 是:在金相试样磨光过程中要多下功夫,因为抛光的作用仅能去除表层很薄一层金属,所以抛光结果在很大程度上取决于前几道工序的质量.有时抛光之前磨面上留有少量几条较深的磨痕,即使增加抛光时间也难以除去,一般必须重新磨光.故抛光之前应仔细检查磨面,是否留有单一方向均匀的细磨痕否则应重新磨光,以免白费时间.这是提高金相试样制备效率的重要环节.

姓 名 学 号 院 (系) 土 木工 程学院 学 科 工程力学与海洋工程 导 师 论 文 题 构多尺度有限元分析与试验 研究

中期报告日期 2013年3月26日 检查组长签字

研究生院培养处制

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1.硕士学位论文中期报告在硕士研究生入学后第三学期末或第四学期初进行; 2.报告经中期报告检查组长签字认可后,交院(系)研究生教学秘书备案;

3.如确实不能按时完成论文工作,需在正常毕业时间的两个月前提出延期申请。

11

硕士学位论文导师审阅记录

12

硕士学位论文修改说明

13

附件1-4

硕士研究生发表论文记录单

附件1-5

硕士学位论文检查小组反馈意见表

一、设计(论文)进展状况

1、经过前期的学习和需求分析,我已经大概掌握了java程序的编写过程,以及java中对于框架的运用,加之对数据库的了解,熟悉了java程序与数据库之间的联系。

2、对系统进行了全面分析,并进行了需求分析和功能模块的设计。对系统与数据库之间的关系进行了系统的分析和设计。对数据库中关于考题表的设计进行了优化。

3、实现了数据库的设计,共有8个数据库表。ExamStu考生考题表。Choose选择体表,JCloze填空题表,estimate确定题表,Jquiz简答题表,choose—an表选择题答案表,Jcloze—an填空题答案表,estimate—an确定题答案表等。

4、已经实现了对不一样类型的考题按难度设置进行抽取,并组合

(1)管理员登录进行考题的录入

(2)管理员对数据库中考题的管理,如删除,修改

(3)学生登录后能够从系统得到一份自动分配的考卷

(4)教师登录后能够看到考生考卷,并进行评阅

(5)对于考生提交的考卷系统能够自动进行相关的打分,如选择题,确定题

5、已完成与专业相关的3000—5000字的外文资料的翻译。

二、存在问题及解决措施

1、存在的问题是:管理员和学生以及教师的权限问题

解决的措施是:根据输入的用户名,密码,到数据库里检索数据,根据该用户的权限值,保存成session,当打开一个新的页面,确定session。

2、存在的问题是:考题随即分配问题

解决的措施是:设计数据库时在各个考题表中设置一个关键字来区别已经选中的考题。

3、存在的问题是:对于考生试卷中确定,填空以及选择题自动比对的问题

解决的措施是:添加了一个答案表,并且设置了一个与之相联系的表的关键字

4、存在的问题是:在数据库设计时,考生考完试后,考生所答试卷不能正确的和考题关联上

解决的措施是:设置主外键进行表与表之间的联系。

5、存在的问题是: 系统安全 性的问题

解决的措施是:

(1)运用数据库自身的安全管理措施以及windows安全管理措施

(2)在系统资源访问上,增加过滤器验证身份,以到达可靠性。

三、后期工作安排

1、继续完成考生考试过程中关于得到随即分配考题的问题,关于考试过程中考题难度的浮动问题

2、集中测试考题分配问题

3、测试不一样人员的权限问题,不一样身份登录只能看到相应的页面,构成测试报告文档。

4、完善系统的安全性。并进行测试,构成测试报告文档。

5、系统的验收测试,并构成测试报告文档。

6、完成该系统后,在指导教师的指导下,针对本系统的开发,存在的问题

以及对系统开发的经验 总结 ,写出一篇一万五千字左右的论文,作为对所完成毕业设计的.汇报与总结

(1)研究进度安排

川崎病是一种急性、自限性的全身血管炎,好发于5 岁以下婴幼儿。1962 年在日本首次发现,1967年日本学者川崎富作首先报道,此后欧、亚、美、澳洲及南非各地均有报道。由于本病病因未明,临床表现比较复杂,全身多系统均可受累,尤以冠状动脉为甚,在日本和美国已经取代风湿热成为 儿童 获得性心脏病的最常见疾病,目前已成为最常见的小儿后天性心脏病之一,并可能为成人缺血性心脏病的危险因素之一。近年来, KD 无论在流行病学、病因及发病机制的研究以及临床诊疗上均获得了诸多进展。本论文根据预定的开题报告内容以及进度合理安排,目前已经就相关文献综述以及国内外研究现状进行了分析与总结,为本文的研究奠定了理论基础。

(2)目前已完成的研究工作及结果

本文已经对相关案例进行了预定的选取。本文选取2013年10月-2014年7月在三峡大学仁和医院、宜昌市中心医院及宜昌市二医院就诊的川崎病患儿20例,年龄波动于6月~8岁,平均年龄(2.10±1.83)岁,男:女=2:1。受检对象按入选顺序编号,如第1个入选对象编号为1。诊断标准选用美国心脏病协会制定的川崎病诊断标准:

1)发热持续5天以上,抗生素治疗无效,不能被其他已知疾病所解释;

2)双眼结膜充血(非渗出性);

3)口唇鲜红、皲裂,口唇点膜弥散性充血,杨梅舌;

4)多形性红斑、皮瘆;

5)在急性期有手足硬肿,掌距红斑;在恢复期指(趾)端甲床皮肤移行处有膜状脱皮;

6)急性非化脓性颈淋巴结大,常为单侧,其直径>1.5cm或更大。

以上标准至少满足5项,可确诊为川崎病,其中1)为必备条件。若患儿不明原因发热超过5天,伴其他诊断标准中的3项,并经二维超声心动图或冠状动脉造影确诊存在冠状动脉扩张或冠状动脉瘤,除外其他疾病,亦可确诊。对于所有患者的一般资料进行了充分的统计,同时在此基础上对患者进行了随机分组,从

三峡大学硕士学位论文中期报告

而为后续的研究奠定基础。

(3)后期拟完成的研究工作及进度安排

后期,本文将首先就检测KD患儿表达CCL5、CCR5的具体细胞。收集KD患儿和正常对照组外周血 3- 4 ml,PBMC分离:无菌肝素钠抗凝血 3- 4ml,经Ficoll

密度梯度离心法分离提取外周血单个核细胞( PBMCs)。同时在分析以及检测的基

础之上,对结果进行分析包括:

1)明确CCL5、CCR5分别在外周血PBMC中的具体表达细胞;

2)对于活化前后的T细胞,CCL5、CCR5的表达水平有何变化;

3)找到CCL5、CCR5之间在川崎病患儿中表达的联系。

经过上述比较,研究CCL5与CCR5在川崎病患儿外周血中的表达变化,从而为川崎病发病机制和治疗手段提供新的思路。研究结果如下表所示:

表1 趋化因子CCL5对T细胞趋化性影响

视野0 10 20 50 100 300 500

①21 50 88 57 60 52 33

②26 45 82 57 60 36 36

③12 44 43 14 32 60 61

④40 76 55 69 61 57 66

⑤19 55 63 29 53 43 50

⑥14 55 76 23 40 46 53

⑦17 35 59 41 55 30 30

⑧9 33 47 65 32 38 47

⑨13 14 25 20 30 36 29

合计171 407 538 375 423 398 405

平均数/视野19.0±9.4 45.2±17.2 59.8±20.1 41.6±20.9 47.0±13.3 44.2±10.3 45.0±13.6

表2 CCR5阻断剂对T细胞趋化性影响

视野0 10 50 100 200

①50 30 18 13 10

②38 23 13 12 9

③44 19 12 5 5

④72 25 17 5 7

⑤78 27 9 7 9

合计282 124 69 42 40 平均数/视野56.4±17.63 24.8±4.15 13.8±3.70 8.4±3.85 8.0±2.0

通过对趋化因子CCL5/ CCR5对T细胞趋化性影响,我们的实验结论如下:

1、趋化因子受体CCL5/ CCR5在川崎病患儿外周血中高表达,提示他们可能与川崎病患儿外周血的发生和发展密切相关,另外,受体CCRS可能是川崎病标志物之一。

2、趋化因子受体CCL5在川崎病患儿外周细胞中有明确表达,且为功能性受体。

十浓度呈现明显的

3、在实验组中加入趋化因子CCLS后SACC-83细胞内的Ca

2

瞬时上升现象(见图1),而利用受体CCRS阻断剂Maraviroc和CCRSmAb将细胞表

十浓度无明显的波动变化(见图面的受体CCRS阻断后,跟踪监测发现细胞内的Ca

2

1)。

4、趋化因子CCLS与其受体CCRS结合后,对川崎病患儿外周细胞的运动性、侵袭性、趋化性和增殖效应均产生了促进作用,其机理可能是CCL5/ CCR5生物轴通过引起细胞内钙离子浓度的改变,启动了癌细胞内钙离子相关的信号。

(4)存在的困难与问题

趋化因子(chemokines)是细胞因子超家族中的成员之一,是一类对细胞具有定向趋化吸引作用的小分子蛋白质,它可以定向吸引免疫细胞参与免疫应答和免疫病理过程[12]。到目前为止,至少有50种趋化因子被发现,其由70-125个氨基酸组成,分子量在8-11KD不等。大多数趋化因子含有4个保守的半胱氨酸形成的两个特征性的二硫键,故其有很相似的高级结构,C端为α螺旋,N 端不规则,有比较高的生物学活性,与受体相结合。

趋化因子首先作为趋化性介质被发现,但随着对趋化因子研究的深入,现在已经认识到趋化因子不但对白细胞具有趋化作用,而且在免疫细胞和器官的发育、免疫应答过程、炎症反应、病原体感染、创伤修复及肿瘤形成和转移等方面发挥广泛的生理和病理作用〔14-16〕。随着近年来对趋化因子及其受体研究的深入,国内外众多学者均已发现其二者结合在自身免疫性疾病中对T细胞的募集及趋化进行作用,并将相应T细胞聚集至靶器官发生组织器官损伤。Wenzel等在研究系统性红斑狼疮(SLE)时发现CXCL10及其受体CXCR3的结合可定向招募细胞毒性T 细胞进入靶器官最终造成皮肤损害;Barone 等研究表明,干燥综合征(SS)患者泪腺角膜上皮细胞CXCL9、CXCL10、CXCL11及受体CXCR3 表达均升高;Goulvestre 等通过对甲状腺组织中表达的细胞因子和相应趋化因子研究,得出CCL21、CXCL12、CXCL13、CCL22在自身免疫性甲状腺疾病(AITD)患者的甲状腺组织中的表达增加,其中自身免疫性疾病甲状腺组织中有异位二级淋巴滤泡形成的CXCL12、

三峡大学硕士学位论文中期报告

CXCL13、CCL22的表达显著增加。目前对于趋化因子及其受体的研究点在于趋

化因子在自身免疫性疾病中所起的募集、趋化T细胞至靶器官的作用,但其在川崎病中的具体作用研究尚不多,目前的研究对于趋化因子CCL5及其受体CCR5在川崎病中的表达及意义研究较少,缺乏相关文献的支持以及数据的保障,同时本文研究的内容以及提取方法相对复杂。由此要求研究中必须要花费更多的精力以及时间以保证研究结果的合理性与准确性,同时也需要进一步进行文献的搜集与整理,特别是对于国外文献的搜集与调查,从而为本文的研究奠定基础。

(5)如期完成全部论文工作的可能性。

目前,已经采集了部分研究对象资料,并进行了相对应的分组及采血。同时,国内学者已进行过CCL5、CCR5在其他疾病中的表达研究,可提供相应的研究方法及路线参考。而笔者的前期预实验已分离出PBMC并成功进行了T细胞的活化增殖。因此,后续能够按照最初的进度完成论文工作,并且保证研究质量以及结论的准确性。

导师评语:

评议小组评语:

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