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CRISPR/Cas系统是细菌和古菌特有的一种天然防御系统，用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。当外源基因入侵时，该防御系统的 CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的 RNA，然后 CRISPR 相关酶(Cas)在序列识别处切割外源基因组DNA，从而达到防御目的。
根据Cas蛋白的特点，可将CRISPR/Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系统需要借助复杂的蛋白复合体发挥作用，Ⅱ型系统仅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可对靶目标进行编辑，结构简单，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系统。
CRISPR/Cas自诞生以来，迅速发展，已经成为生命科学领域最耀眼、最有前景的技术。尤其是近两年，在全世界科学家的共同努力下，CRISPR/Cas相关新进展新突破不断涌现。
一、基因编辑技术的发展史
基因编辑可以分为三代，第一代：ZFN；第二代：TELEN；第三代：CRISPR/Cas。这三个基因编辑技术都利用了DNA修复机制，所以我们先来了解一下DNA修复机制（ 图1 ）。[图片上传失败...(image-8dab49-1625385468208)]
图1-NHEJ修复（左），HDR修复（右）
NHEJ（Non-homologous end joining）
非同源性末端接合
NHEJ修复机制不需要任何模版，修复蛋白直接将双股裂断的DNA末端彼此拉近，在DNA连接酶的帮助下重新接合（ 图1 ）。
HDR（Homology directed repair）
同源重组修复
当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，HDR才能发生。
NHEJ的机制简单又不依靠模版，因而NHEJ的活性相对于HDR高出许多。但NHEJ修复出错的概率较高，容易造成移码突变等，基因编辑正是利用了这一点（ 图1 ）。
1.ZFN的识别切割机制
融合锌指模块和FokI切割结构域形成ZFN ；以二聚体的形式靶向切割每个锌指结构；特异识别3个碱基 ；组装多个锌指结构(识别12-18bp)形成的ZFN对可特异切割基因组靶点 （ 图2 ）。
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图2-ZFN基因编辑原理图
2.TALEN的识别切割机制
两个TALE靶向识别靶点两侧的序列；每个TALE融合一个FokI内切酶结构域；FokI通过TALE靶向形成二聚体切割靶点；设计灵活识别特异性强（ 图3 ）。
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图3-TELEN基因编辑原理图
3.CRISPR/Cas9的识别切割机制
crRNA通过碱基配对与 tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA（ 图4 ）。
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图4-CRISPR/Cas9基因编辑原理图
ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9比较
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图5-三种基因编辑的比较
二、CRISPR/Cas技术的介绍
CRISPR/Cas9 系统的发现
1987年，在大肠杆菌的基因组中首次发现了一个特殊的重复间隔序列——CRISPR序列，随后，在其他细菌和古菌中也发现了这一特殊序列。
2005年，发现这些CRISPR序列和噬菌体的基因序列匹配度很高，说明CRISPR 可能参与了微生物的免疫防御。
2011年，CRISPR/Cas系统的分子机制被揭示：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR 转录生成 前体crRNA (pre-crRNA)， pre-crRNA 经过加工形成含有与外源基因匹配序列的crRNA，该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后，介导 Cas 蛋白结合并切割，从而保护自身免受入侵。
2013年，发现CRISPR/Cas9系统可高效地编辑基因组。随后张锋等使用CRISPR系统成功的在人类细胞和小鼠细胞中实现了基因编辑。
从此开始，CRISPR/Cas9技术给生命科学领域带来了巨大冲击，CRISPR/Cas9相关研究成果频频登上CNS等顶级期刊，近两年更是成为诺贝尔奖热门候选。
CRISPR/Cas技术的原理
CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA，改造成具有引导作用的sgRNA （single guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割（图4）。
CRISPR/Cas技术的优势
设计简单，简明的碱基互补设计原则，识别不受基因组甲基化影响，能靶向几乎任意细胞任意序列，方便同时靶向多个靶点，切割效率高。
三、CRISPR/Cas的脱靶效应
PAM**** (Protospacer adjacent motif )
前间区序列邻近基序
PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件。如果靶序列 3′端没有PAM序列，即使靶序列与sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不会切割该序列位点。 PAM序列主要影响CRISPR/Cas9的DNA切割效率。在细胞水平上，NGG介导的切割效率是最高的。
sgR****NA ****(Single guide RNA )
向导 RNA
sgRNA与目标基因组相结合的 20nt 序列区决定着 CRISPR/Cas 系统的靶向特异性。CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性其实主要依赖于sgRNA与靠近PAM区的10~12 bp的碱基配对，而其余远离PAM序列 8~10 bp 碱基的错配对靶位点识别的影响并不明显。目前研究结果均提示，可能靠近 PAM 的 8~14 bp 序列是决定特异性的关键，其他序列也均在不同程度上影响脱靶效应。
CRISPR/Cas9的脱靶效应给研究带来了一定程度上的不确定性，也是限制其发挥更大潜力的主要原因之一。
2017年5月30日， Nature 杂志子刊 Nature Methods 刊登了美国哥伦比亚大学研究人员的一篇文章，研究人员通过CRISPR/Cas9成功修复了导致小鼠失明的基因后，对小鼠进行全基因测序，发现修复后的小鼠基因组有超过1500个单核苷酸突变，以及超过100个位点发生大片段插入或缺失（ 图6 ）。文章的结论无疑引发了巨大震动，也给正在进行中的CRISPR/Cas9带来了不确定性。
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图6--动物体内实验中CRISPR/Cas9编辑后发生意想不到的突变
仔细分析后，发现该文章并不十分严谨，文章仅有两只小鼠作为实验组，一只作为对照组，数量不足以证明结论是否只是个例。而且单碱基突变是生物体内自然现象，不能全归于CRISPR/Cas9。整个实验只基于一个sgRNA数据，且该sgRNA特异性评分很低，造成脱靶效应也应该在预料之中（ 图7 ）。
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图7--针对 Nature Methods 文章的回应
经过一系列的研究和改进，目前CRISPR系统的脱靶性已经很低，当然，要想达到理想的状态，还有很长的路要走。
四、CRISPR/Cas技术的进展
2016年6月，张锋在 Science 发表文章，发现CRISPR/Cas13a能有切割细菌的特定RNA序列。
2016年9月，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，证实CRISPR/Cas13a可以用于RNA检测。
2017年2月22日，美国纪念斯隆.凯特林癌症中心（MSK）研究人员在 Nature 杂志发文，使用腺相关病毒（AAV）介导，将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于CAR-T疗法。该研究既解决了传统CAR-T疗法的随机整合可能存在的潜在危害，又大大降低了CAR-T细胞发生分化或癌化的风险，赋予了CAR-T技术全新的高效性、稳定性、安全性。
2017年8月2日，Shoukhrat Mitalipov在 Nature 发表长文，使用CRISPR/Cas9技术修正了植入子宫前的人类胚胎中一种和遗传性心脏病有关的变异。该研究证实了通过编辑人类胚胎进行治疗遗传病是安全可行的。值得一提的是，该成果受到了基因编辑领域大牛George Church等人的质疑。
2017年8月11日，杨璐菡等在 Science 发表文章，通过CRISPR/Cas9技术敲除猪基因组中的内源逆转录病毒（PERV）序列，并克隆出多只PERV失活小猪。向最终实现使用猪器官进行人体器官移植的终极目标迈进了一大步。
2017年9月，杂交水稻之父”袁隆平院士宣布使用CRISPR/Cas9技术敲除与镉吸收和积累相关基因的水稻育种成功。该研究从根本上解决了水稻镉污染的问题，将扭转我国部分农作物重金属超标的问题，进而改善部分人群重金属慢性中毒的问题。
2017年10月4日，张锋在 Nature 发表论文证实CRISPR/Cas13a能够在哺乳动物细胞中编辑特定的RNA。CRISPR/Cas13a能够达到RNAi相似的降低基因表达的效率，而且有更强的特异性，且对细胞内天然的转录后调控网络的影响更小。
2017年10月19日，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，设计了高精确性的Cas9变体—HypaCas9。该研究极大地降低了Cas9的脱靶效应，且不降低靶向切割效率。
2017年10月25日，张锋在 Science 发表文章介绍CRISPR新系统--REPAIR，可以高效的进行RNA的单碱基修复。因为不改变DNA序列，所以为通过基因编辑治疗遗传病而又不永久影响基因组提供了新可能。
2017年10月25日，哈佛大学Broad研究所的David Liu实验室在 Nature 发表长文，报道了新型腺嘌呤基因编辑器——ecTadA-dCas9，可以将A·T碱基对转换成G·C碱基对，该技术首次实现了不依赖DNA断裂即可进行基因编辑的技术，即单碱基基因编辑技术。该技术高于其它基因组编辑方法的效率，且几乎没有随机插入、删除或其它突变等不良副作用，因此为今后大范围治疗点突变遗传疾病提供了极大的便利。
五****、展望
近几年CRISPR/Cas基因编辑技术飞速发展，推广应用到了生物、医学、农业以及环境等多个领域，造就了一批批科研奇迹，尤其是在遗传病的治疗、疾病相关基因的筛查与检测、肿瘤治疗以及动植物的改造、病原微生物防治等领域有着巨大的潜力，也将深远地影响整个世界。
特别感谢：BioArt主编给予的帮助和意见以及吉满生物吴晨提供图1-图5的图片。
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同时收录部分基础教育、大众科普、大众文化和文艺作品类刊物，内容覆盖自然科学、工程技术、农业、哲学、医学、人文社会科学等各个领域，全文文献总量2200多万篇。
CNKI概述：
1、产品分为十大专辑：理工A、理工B、理工C、农业、医药卫生、文史哲、政治军事与法律、教育与社会科学综合、电子技术与信息科学、经济与管理。十专辑下分为168个专题和近3600个子栏目。
2、收录年限：1994年至今(部分刊物回溯至1979年，部分刊物回溯至创刊)，8200种全文期刊的数据完整性达到98%。
3、数据库应用：CJFD除了可用于信息检索、信息咨询、原文传递等常规服务外，还可以用于以下一些专项服务：引文服务，生成引文检索报告；查新服务，生成查新检索报告；期刊评价，生成期刊评价检索报告；科研能力评价。
生成科研能力评价检索报告；项目背景分析，生成项目背景分析检索报告；定题服务，生成CNKI快讯。
是。因为新闻出版署可查的期刊不一定是正规期刊，正规期刊必须在邮政期刊订阅网上可查 1、正规期刊内容均将通过不同的网络载体呈现。 2、作为一本面向海内外公开发行的正规期刊，在拥有国家新闻出版总署所批复刊号的同时，需要有各地邮政部门确认的邮发代号，没有刊号及邮发代号，无法在邮局（或在中国邮政报刊订阅网上）订阅，此类出版物在职称评定过程被视为非正规出版物，不予认定。因此，正规的期刊，必须拥有国家新闻出版总署所批复的刊号和各当邮政部门确认的邮发代号。
可以。万方可以做新闻期刊。集纳了70多个类目共7600种科技类期刊全文。方数据库是由万方数据公司开发的，涵盖期刊、会议纪要、论文、学术成果、学术会议论文的大型网络数据库，也是和中国知网齐名的中国专业的学术数据库。
可以在网上搜一下核心期刊要目总览，核心类别叫中国医学；CSCD的名单网上也有的。
中国科学引文数据库（CSCD）分为核心库和扩展库，其中，核心库期刊：669种(以*号为标记)；扩展库期刊：378种。
CSCD已被中国科学院院士主席团指定为中国科学院院士推选人查询库，被国家自然科学基金委员会列为国家杰出青年基金申请项目、基金资助项目后期绩效评估、国家重点实验室评估等指定查询库。
扩展资料
注意事项：
1、刊物选择：一般发表核心期刊都是要求发到专刊上面，所以投稿的时候一定要选对，如发的是教育类的，教育类专刊CN刊号一定要带有G4的标志。
2、格式字数：不同的刊物对格式字数等要求都不同，字数只能多不能少，如图教育探索征稿要求。
3、科学性：文章一定要有科学依据，真实的数据真实存在的。
4、可读性：可读通过数据图表等有一定的启发，专业术语语言规范性都有要求。
参考资料来源：百度百科-核心期刊
《时珍国医国药》《重庆医科大学学报》（此刊是CSCD+北大核心）,审稿1-2周。需要速联
01/官网查询。中国科学院文献情报中心情况分区查询链接：自从2020年12月起，中科院已启用升级版查询系统。登陆进入系统后，输入刊名/issn即可检索。02/小程序查询.中国科学院文献情报中心公众号—服务—分区表—2020年升级版—输入刊名/ISSN即可检索。04/LetPub查询百度搜索LetPub，点击进入首页，输入期刊名即可检索。点击想要查询的学科，还可以根据研究方向查看中科院分区。需要投稿却不清楚分区的，可以根据目录来选择哦！
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