优良乳酸菌发酵性能研究的激活效应分析

优良乳酸菌发酵性能研究及其激活剂筛选
学生姓名：李敏         指导教师：活泼
（浙江科技学院生物与化学工程学院）
摘要：本文主要研究从民间收集的酸奶混合菌种中分离纯化具有优良发酵性能和生物活性功能的乳酸菌，并对其发酵特性和生物活性功能进行研究。采用乳酸菌分离培养基对收集的混合菌种进行分离、纯化，获得5个乳酸菌株。通过观察其菌落形态、镜检及其他鉴定实验如吲哚试验、糖发酵试验等初步认为所得菌株为乳酸菌。在菌种的发酵过程中,添加胡萝卜汁、番茄汁、马铃薯汁等不同蔬菜汁作为激活剂以提高菌种的发酵特性。结果表明马铃薯汁对菌种的发酵速度和凝乳均有较大的促进作用。Studies on the Fermentation Properties of Rural Lactobacteria and Its Activates
Student’ s name: Li Min      Advisor: Huo Po
（School of Biological and Chemical Engineering Zhejiang University of Science and Technology）
Abstract: The fermentation properties and bioactive function of 5 new Lacto bacteria which were isolated from rural yogurt have been studied in this article. 5 strains have been obtained from the collected rural yogurt by using agar plate with special isolation medium of lactic acid bacteria. Through the colony morphology, microscopic observation and the results of a series of physiological tests identification of bacteria, such as indole test, Sugar fermentation reaction etc. ,they were considered primarily Lacto bacteria. The results of the experiments indicated that the fermentation rate and the quality of the texture were improved when  Potato juice was added during the milk fermentation.

关键词：乳酸菌；发酵；分离；激活剂

Key  words: Lactobacteria; Fermentation; Isolation; Activate

 
1、绪论
1.1乳酸菌概述
人类对乳酸菌的利用已有很长的历史。早期的细菌学家将那些可以自发进行的传统乳酸发酵食品的细菌称之为“乳酸菌(Lactic acid bacteria。LAB)” [1]。乳酸菌是一群能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的统称，它们广泛分布于自然界中，从土壤、水、植物、发酵食品以及人和动物的肠道内均可分离到乳酸菌。
乳酸菌有助于增加食品的营养价值。建立肠胃正常的细菌生态菌群，提高免疫力，并有助于预防癌症等慢性病。乳酸菌在发酵香肠、泡菜等食品和饮料加工中被广泛应用，而其在发酵乳制品生产中起着至关重要的作用。利用天然的或经筛选的乳酸菌在牛奶中发酵，已得到越来越广泛的应用，发酵酸奶的市场正在逐步扩大。
1.2.乳酸菌对人体的有益功能
1.2.1促进消化吸收
由于乳酸菌可以调整肠道细菌生态，扮演着触媒的角色，使帮助维生素B群及维生素K的合成吸收的有益菌能正常生长繁殖[2]。乳酸菌的代谢物有助于肠道的正常蠕动，乳酸菌能抑制维生素B1分解菌在肠道中分解维生素B1，可使维生素B1免于缺乏。 
1.2.2治疗急性腹泻
乳酸菌会产生大量的乳酸﹑醋酸等有机酸，抑制造成腹泻的细菌及病毒生长繁殖。对水土不服的观光客尤其有用。
1.2.3控制胆固醇
实验证实，持续饮用酸奶一段时间后，可降低血中的胆固醇浓度，而停止饮用后，血胆固醇会逐渐恢复至原来的状况。 
1.2.4降低肠道癌病变的机率
某些有害菌产生的酵素，会使大肠内的致癌原转成致癌物质，因而提高大肠癌的发生率。乳酸菌可减低这些有害酵素的活性。研究显示乳酸菌可藉由其细胞壁上的多醣成份，强烈吸附肠内这些有害的致突变性代谢产物(这是过量的脂肪
被害菌所代谢出来的致癌物质)，并能加速排出这些毒素。实验也显示，肉食性动物大肠癌发生机率较高，若同时饮用酸奶，则可降低大肠癌的发生机率。 
1.2.5强化免疫系统
乳酸菌可活化肠道部位的巨噬细胞及淋巴细胞的产生，使免疫球蛋白A（Ig A）的浓度提升，并且产生γ- 干扰素及抗肿瘤因子，以抑制肿瘤细胞形成；当然乳酸菌调整菌丛生态的功能，也使免疫系统能更有效的对抗害菌，使害菌无以为生。 
1.2.6抗氧化﹑抗衰老
最近发现乳酸菌也能清理自由基，并改善排便，避免便秘。也避免体内毒素的堆积，因此也能延缓老化，保持青春。 
1.3乳酸菌发酵剂的功能
乳酸菌发酵剂在乳品发酵中有多种功能。
1.3.1产酸
牛乳中乳糖的含量为40-50g/L。乳球菌利用乳糖的葡萄糖部分快于半乳糖部分。乳球菌发酵的主要产物是L（+）—乳酸。
1.3.2蛋白质分解活力
与芽孢杆菌和假单胞杆菌相比，乳酸菌只有相对和缓的蛋白质分解力。乳酸军可以利用凝乳酶和菌体细胞壁蛋白酶降解蛋白质产生的多肽。蛋白酶和肽酶的联合作用提供给菌体细胞生长所需的多肽和游离氨基酸。肽类和氨基酸通过特异的转运体系穿过细胞膜。转运到内部的肽类可以通过细胞肽酶进一步的降解。
 
1.3.3风味物质的产生
乳球菌产生的风味化合物可以分为两类：发酵乳制品中的风味化合物和成熟干酪中存在的化合物。发酵乳中乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种和明串珠菌发酵牛乳中的柠檬酸产生乙醛、丁二酮、3-羟基丁酮、2，3-丁二醇。在得氏乳杆菌保加利亚亚种、干酪乳杆菌、瑞士干酪、等中发现二羧酸、乙二醛、甲基乙二醛、丁二酮、二羟丙酮等化合物。一般认为菌体产生的风味化合物是为了避免菌体中丙酮酸的积累。
1.3.4胞外多糖（产粘）的产生
许多乳酸菌可以产生胞外多糖。胞外多糖可以以荚膜多糖或黏液多糖存在。几个世纪以来在芬兰使用产粘菌株生产浓厚的、粘性发酵产品中“维利”（Villi）。在1980年以来嗜热性的、产粘的乳酸菌已经广泛的用于乳酸生产中。提高酸乳的流变学特性，减少或阻止乳清的析出。在酸乳生产中这些粘性菌株的使用可以替代稳定剂。
1.3.5抑制物质的产生
乳酸菌具有一定的保藏作用，根据早期研究由糖发酵产生的有机酸，赋予产品良好的保藏效果。产品pH值的降低和产生的有机酸（乳酸和醋酸）起主要的抑制作用。很少的细菌能在如此低的pH值增殖。
乳酸菌还产生一些含量较低的其他抑制物质。这些化合物包括过氧化氢、丁二酮、细菌素以及在乳过氧化物酶的作用于过氧化氢和硫氰酸后生成的亚硫氰酸
1.4乳酸菌的发展与应用 前景
近年来伴随中国消费者健康意识的提高，为乳酸菌市场的迅速发展孕育了巨大商机。专家预测，未来3-5年将是中国乳酸菌行业快速发展的“黄金时期”。 为引入先进理念，聚集各方优势，中国食品科学技术学会于2006年5月16日-17日在北京召开了以“肠道健康与乳酸菌”为主题的“第二届乳酸菌与健康国际研讨会暨中国食品科技学会乳酸菌分会成立大会”[3]。
1.4.1乳酸菌带来健康改善
经济与营养状况的改善正使肠道健康问题成为全球的共性问题，丹尼斯克公司的李永敬博士指出，在美国，约有3500万人患有肠易激综合症，在中国这一病症的发病率亦有10%。有专家预计，到2015年大肠癌将超过胃癌成为人类健康的第一杀手。乳酸菌、益生菌对人体肠道功能和免疫调节带来的良好改善已得到认同，这也为乳酸菌、益生菌的发展提供了新的应用和有待发展的机会。日本癌治疗协会的研究显示，特定的乳酸菌可将恶性变较高腺瘤的发展过程控制在通常的2／3。各国科学家也都在积极研究此议题。已有70多年乳酸菌研究与利用经验的日本养乐多集团高级科学家石川文保介绍说，乳酸菌能促进肠内菌群平衡，是因为由其发酵产生的乳酸可有效抑制有害菌的生长，从而增加有益菌的数量。
1.4.2 乳酸菌研究现状
a.乳酸菌研究基础化
    我国幅员辽阔，历史悠久，资源丰富，有巨大的开发潜力，值得科研人员和成功的企业家关注。对我国丰富的乳酸菌资源进行系统研究，在掌控资源的前提下，优选不同生理、不同遗传特性的乳酸细菌，开发出不同的产品。对乳酸菌资源、应用基础理论及生产技术进行研究，对企业来说意义是深远的[4]。
    b.生产技术集成化
    展望未来，乳酸菌的分子育种技术、高密度培养技术、发酵过程的在线检测与控制技术、食品重组技术和益生菌功能性评价技术的建立和运用，将会推动我国乳酸菌发酵食品走向国际市场，有可能催生乳酸菌行业的国际品牌。
    c.潜在市场细分化
乳酸菌发酵乳制品作为国际性的嗜好产品，有其特殊性，但由于消费者变得越来越理性，产品的个性化需求明显，潜在市场有细分化的趋势。消费者对乳酸菌发酵乳制品的选择需求会经历由追求口感风味，到追求营养强化，再到追求产品的特殊保健功能上。目前国内产品还停留在前两者的过渡期，营养强化是未来3-5年内乳酸菌产品的主流。针对不同人群的特性需求会形成特定的目标市场。
    d.合作国际化
    合作国际化是我国乳酸菌走向国际市场的必由之路。因此加强国际技术合作，可以大大提升乳酸菌制品的生产水平，确保产品的安全。
    e.产品保鲜生物化
    由于我国特别是广大农村地区的冷链还很不完善，再加上乳酸菌发酵产品中的益生菌在贮藏运输和销售过程中由于受环境变化的影响会逐步死亡。运用微生物生态学原理，通过生物信号传导中的分子调控，采用生物保鲜的方法，在保证产品绿色、天然、不用化学防腐剂的前提下，延长活性乳酸菌饮料的货架期。
1.4.3乳品竞争中的新机遇
正是因为乳酸菌所具有的营养、健康的特殊功效，使其风靡欧、美、日、韩等市场，并被广泛应用于乳制品、饮料、肉制品、保健食品等食品及预防医学领域。目前，全球含乳酸菌、益生菌的乳制品产值已达近400亿美元，欧洲占有约50%的市场。在中国市场上，除了专业生产此类产品的太子奶、养乐多等外，为了顺应消费趋势，并能从传统市场的大战中突围，乳品、饮料生产商纷纷将科技含量和附加值高的乳酸菌、益生菌产品纳入到自己的产品视线中。达能BE80菌、蒙牛LABS菌、伊利LGG菌、味全B-longum、光明活力E＋菌等产品相继上市。中国的乳业大战，瞄准乳酸菌这一新的产业，开辟了具较高科技含量的第二战场。
1.4.4科技与创新提升价值
长久以来，乳酸菌就用于生产各种动物(奶，肉，鱼等)和植物(蔬菜，酒等)发酵食品。传统上用于生产发酵食品的乳酸菌一般被认为是安全的。食品生物转化的产业化更提高了乳酸菌的经济重要性。乳酸菌在食品转化过程中所占的成本虽然很少，但在发酵产品的感官和卫生质量上却起着关键的作用。乳酸菌在食品发酵过程中的主要贡献是酸化，发酵产生的酸性最终产物积累在胞外环境中，构成不利于许多其他微生物生存的环境，这个特性是众多发酵法保存食品的基础，
也是干酪和酸奶生产中乳品凝结或腊肠发酵中可溶性肉蛋白凝结的先决条件。在大多数发酵食品中，耐酸性是保证乳酸菌的最佳生长和酸化速率，以及保持益生菌在胃肠道中存活的基本要求。在工业生产过程中，乳酸菌要经受一系列的环境压力，诸如极端温度、pH、渗透压、氧、和饥饿等。这些环境胁迫诱导的基因调节作用，都可能影I响到细胞的生理状况和性质，直接影响发酵过程和干酪香味成分产生。从工业观点出发，选择发酵好，能抵抗发酵过程中的不利条件的菌株是重要的。此外，该菌株的产酸速度，凝乳质量对工业生产也是至关重要的。因而对乳酸菌激活剂的筛选及其分离鉴定具有非常重要的意义。
1.5本章小节
本章对于乳酸菌对人体的有益功效、乳酸菌发酵剂的主要功能，研究现状及其发展展望等作了总结介绍。乳酸菌发酵乳制品作为国际性的嗜好产品，有其特殊性，随着消费需求的日益增加，乳酸菌发酵的需求将呈现上涨趋势。因此对于优良乳酸菌发酵性能的研究探讨，开发研制具有更快速，更有效的酸奶发酵剂激活剂具有很强的现实意义。由于对乳杆菌的研究报道比较详尽，但乳球菌研究较少，固本文重点研究对象为混合菌种中分离所得乳球菌。

2、实验部分
2.1实验材料 
2.1.1  主要原辅料
混合菌种：实验室于各地采集所得优良菌种A、B混合菌
单菌种：由实验室所供混合菌种分离
牛奶：市售，伊利纯牛奶
土豆，番茄，胡萝卜，山药，佛手瓜：市售，新鲜
其他：蔗糖 乳糖 葡萄糖
2.1.2   培养基[4][5][6][7]
1号培养基 g/L：
大豆蛋白胨 5.0g,  蛋白胨 2.5g,  酵母膏 5.0g, 牛肉膏 6.0g, 乳糖 5.0 g,  MgSO4.7H2O 0.25 g,  Na2HPO4  5.0g,  Vc 0.5g,  脂 15g,  pH 7.0~7.2。                                                                                                
2号培养基 g/L：
蛋白胨 10.0g,  酵母膏 5.0g,  KH2PO4  6.0g, 柠檬酸氢二铵 2.0g
MgSO4.7H2O 0.25g,   MnSO4.2H2O 0.12g,   FeSO4.7H2O 0.04g,
无水醋酸钠 15g,  吐温 1.0ml, 葡萄糖 20g, 琼脂 15g,  pH 5.5。
3号培养基g/L:
牛肉膏 1.0g, 蛋白胨 1.0g, 酵母膏 1.0g, 葡萄糖 1.0g
琼脂 1.8g,  水 100ml。
蛋 白胨水培养基：
蛋白胨 10g, NaCl 5g，水 1000ml，pH 7.2~7.4。
    糖发酵培养基:
蛋白胨水培养基 1000 ml     1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1~2 ml
    pH 7.6   另配 20%糖溶液 （葡萄糖，蔗糖）各 10 ml.。
制法：
1）.将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（pH 7.6 ）分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管（德氏小管）,使充满培养液。
2）.将已分装好的蛋白胨水培养基和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水培养基121摄氏度灭菌 20 min ,糖溶液112摄氏度灭菌 30 min。
3) . 灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的糖溶液0.5 ml , 则成1%的浓度。
2.1.3  有关溶液
1）氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=0.100mol/L]：称取40g氢氧化钠，溶于100mL水中，摇匀使之成为饱和溶液后存于聚乙烯容器中，密闭放置数日后至溶液清亮。然后吸取该溶液10ml于1000ml无二氧化碳的水（将蒸馏水煮沸后冷却）中，摇匀。
2) 1.6 % 溴甲酚紫乙醇溶液 ：
溴甲酚紫 1.6 g 溶于100 ml 乙醇中，贮存于棕色瓶中保存备用。
3)吲哚试剂：
对二甲基氨基苯甲醛 8 g , 95 % 乙醇 760 ml , 浓盐酸 160 ml，10 % 硫酸，2 % 高锰酸钾。
4)含氨的硝酸盐溶液 ：
称取硝酸银 2 g , 蒸馏水 100 ml ,待硝酸银溶解后，取出10 ml 备用，向其余的90 ml 硝酸银中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，继续滴加氨水至沉淀刚 刚溶解成为澄清溶液为止，再将备用的硝酸银慢慢滴入，则溶液出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，继续滴入硝酸银，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。
2.1.4激活剂
胡萝卜汁、番茄汁、马铃薯汁、佛手瓜汁、番薯汁、山药汁、Vc、葡萄糖、乳糖、蔗糖。
2.1.5相关仪器

                         表1  实验相关设备
设备名称 型号 生产厂家
光照培养箱 SPX-250B-G型 上海博迅实业有限公司
数显恒温水浴锅 HH-4 国华电器有限公司
电热手提式低水控压力蒸汽灭菌锅 YXQ-SG41-280-B型 上海医用核子仪器厂
电热鼓风干燥箱 DGX-9143B-1型 上海福玛实验设备有限公司
药物天平 BP-2型 上海药用激光仪器厂
粘度计 平型乌氏     浙江省椒江市玻璃仪器厂
分光光度计 700型            上海福玛实验设备有限公司
2.2  实验方法
2.2.1 乳酸菌的分离纯化方法
配制细菌培养基（1，2，3号培养基）各200mL，分装于50OmL锥形瓶中，标记1号，2号，3号，121oC灭菌20min，冷却至45℃左右倒平板，于无菌操作台上放置12~24小时，观察无杂菌生长后为可用培养基[4]。用接种环分别蘸取混合菌种A、B平板划线接种于3号培养基上，置40.5℃培养24~48小时[5]。待菌落形成后，用接种环挑取单个不同菌落，再次划线分别接种于1、2号培养基上，置40.5℃培养24~48小时，仔细观察菌落形态并进行记录[6]。确认为纯培养物后，挑选出乳酸菌进行连续6次以上的传代，以达到分离提纯。
2.2.2  乳酸菌的鉴定方法
乳酸菌分离株的鉴定主要通过细胞形态观察、吲哚试验、糖发酵产气试验、乳酸检测等生理生化特征的分析来进行[7]。
2.2.2.1形态观察
a.菌落形态观察
以嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的标准菌菌落形态为参照，采用目测法观察菌落形态。
b.细胞形态观察
从培养基中随机挑取单菌落于显微镜下观察其细胞形态，乳酸菌在显微镜下观察得细胞形态为链球状和杆状两种形态。
2.2.2.2吲哚试验
   1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。
   2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置40.5℃恒温箱中培养24~48小时。
   3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2 ml , 经充分振荡，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，使吲哚萃取至乙醚中，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。
2.2.2.3糖发酵试验
   1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。
   2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌种至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的德小管倒置试管中，置40oC养箱中培养24小时，观察结果。
3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。培养液中的德氏小管内有气泡为阳性反应，德氏小管内没有气泡为阴性反应[7]。
2.2.2.4  乳酸的检测[6] [9]
选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取其发酵液的上清液约10ml于试管中，加入10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中浸泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。

.

2.2.3乳酸菌的分离纯化流程：
 
3号培养基划线接种

40oC培养24~48h

                                 菌落形成        观察记录菌落形态特征

选择挑取单个菌落

              挑取菌落2号培养基划线接种              挑取菌落1号培养基划线接种
                      
40oC培养24~48h                   40oC培养24~48h
     
观察记录菌落特征   选择单个菌落            选择单个菌落   观察记录菌落特征
   
                   、                             同杆菌实验方法

 
                      镜检        记录菌株细胞形态

通过一系列生理化实验鉴定菌株（吲哚试验、糖发酵产气试验、乳酸检测）
图2 乳酸菌分离纯化流程

2.2.4乳酸菌生长曲线的绘制[11]
大多数细菌的繁殖速率很快，将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。本研究采用光电比浊法测定不同培养时间乳酸菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。
操作步骤：
a.标记
取无菌试管数只，用记号笔分别标明菌体和培养时间，即A0、A1、A2、A3、A4....和B0、B1、B2、B3、B4.....
b.接种
分别用10ml吸量管吸曲1号菌，2号菌20ml转入盛用200ml已灭菌3号培养液的三角瓶中，混合均匀后分别取10ml混合液放入上述标记的无菌大试管中。
c．培养
将已接种的试管置培养箱中40.5oC培养，每隔一小时将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。
d.光密度测定
用未接种的液体培养基做空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。
从早取出的培养液开始依次测定（测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布。
e.将测定的OD600值绘制乳酸菌的生长曲线
2.2.5激活剂的筛选
2.2.5.1酸奶的制备
用接种环以无菌操 作分别挑取1号，2号菌种于添加了激活剂的牛奶培养基中，置40.5oC恒温培养箱中培养24~48小时。用已灭菌的吸量管分别吸取1ml 1号、2号菌液于100ml牛奶培养基中，40.5oC培养。待其凝乳完全，得酸奶，备用。

2.2.5.2激活剂的筛选方法[8]
 
图3 激活剂筛选路线
2.2.6酸奶各项指标检测
测定各组酸奶的酸度【9】、粘度、产酸速度。
2.2.6.1酸度测定方法
分别称取已搅拌均匀的1号、2号酸奶试样5g，准确至0.01g，置于150ml锥形瓶中，加入40ml新煮沸放置冷却至40℃的水，小心摇匀，再加入5滴酚酞指示液，小心摇匀，用0.100mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至处现粉红色或与标准色一致，并在0.5min内不褪色，记录消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数，同时做空白试验。
酸度计算：
X2=c*5.00*(V2-V1)*20/(0.1000M2)
                   X2---试样的酸度，°T
                   C--- 氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/l
  V2---试样消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，ml
                   V1---空白试验消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，ml
                   M2---试样的质量，g  
2.2.6.2黏度测定方法
   采用乌氏粘度计测量酸奶粘度。
2.2.6.3  产酸速度测定
   产酸速度是酸奶发酵的重要参数，其大小是对菌种活力和发酵效果的重要反映：平均产酸速度=终点滴定酸度/发酵时间，oT/h【8】。
2.2.7乳酸菌的动物试验
为了测定A、B混合菌及从中分离出的1号，2号菌是否具有降低胆固醇、甘油三脂或提高高密度脂蛋白的生理功效，对这些菌种进行小老鼠的动物试验：胆固醇测试，甘油三脂测试，高密度脂蛋白测试。
2.3本章小节
在本章中对本研究所用原材料、培养基、实验器材等作了简单概述。并对实验方法及操作流程安排等作了详细介绍。

3、结果与讨论
3.1乳酸菌的分离纯化
为将A、B混合菌分离纯化进行连续6代培养，在平板上观察得：
A菌：为圆形稍扁平的白色菌落，菌落有大有小，初步鉴定为乳酸菌。挑取少量在显微镜下观察到链球状和杆状两种形状。由A菌分离纯化培养得1号菌，3号菌，5号菌。
B菌：为卵圆形黄色菌落和白色菌落，菌落有大有小，初步鉴定为乳酸菌。挑取少量在显微镜下观察到链球状和杆状两种形状。由B菌分离纯化培养得2号菌，4号菌。
3.2  乳酸菌的鉴定
3.2.1形态观察
以嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的标准菌为对照，对各菌株进行初步鉴定。结果见表2。
表2 筛选所得菌株的生理特性分析
Table 2．Physiological property of isolated strains
实验编号 表面特征 镜检结果
嗜热链球菌 黄色，菌落较大，生长良好，菌落卵圆形表面光滑，凸起 椭圆球状
1号 乳白色，菌落较小，生长良好，菌落圆形表面光滑，凸起 椭圆球状
2号 微黄色，菌落较小，生长良好，菌落圆形表面光滑，凸起 椭圆球状
保加利亚乳杆菌 白色，较小，菌落较粗糙，形状多不规则或圆形，生长尚好 杆状
3号 乳白色，较大，菌落较粗糙，圆形，生长良好 杆状
4号 乳白色，较小，菌落较粗糙，圆形，生长尚好 杆状
5号 乳白色，较小，菌落较光滑，圆形，生长良好 杆状

           
图4 1号菌                  图5 2号菌
        
图6 3号菌                  图7 4号菌
 
图8 5号菌
经过对1~5号菌的菌落形态观察及其细胞形态观察，初步鉴定1~2号菌株为乳球菌，3~5号菌株为乳杆菌。
3.2.2吲哚试验：
在1~5号菌种中，分别加入吲哚试剂，进行吲哚试验，结果显示1~5菌种的试管均不呈现玫瑰色，证明为阴性反应，说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的

能力。也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验证明为阳性[15]。
3.2.3糖发酵试验：
在添加葡萄糖的发酵培养液中加入1~5号菌种于40.5oC培养24小时后，培养液均变为黄色，反应结果为阳性，且杜氏小管内无气泡，其反映结果为阴性。加入蔗糖的发酵培养液中加入菌种后的反应结果也为阳性 [16]，且杜氏小管内无气泡，其反映结果为阴性。培养液变为黄色证明该菌种能分解葡萄糖和蔗糖而产酸。杜氏小管内没有气泡，说明该菌种分解糖后不产气。也证明此菌种不是大肠杆菌，因为如果是大肠杆菌除了产酸反应结果为阳性外，杜氏小管内也会有气泡，因为大肠杆菌具有分解葡萄糖和蔗糖产酸并产气的能力。
3.2.4小型发酵实验：
分别对1~5号菌进行小型发酵实验，观察到1~5号菌的滤纸条均变为黑色，说明有乳酸存在[17]。因为在1~5号菌种发酵液的上清液中加入10%硫酸1 ml 和2%高锰酸钾1 ml 后，此时上清液中的乳酸转化为乙醛，加热后使乙醛挥发，因此使滤纸条变黑[18]。
3.3乳酸菌生长曲线的绘制
由于乳杆菌的研究报道很多，但对乳球菌的研究较少，故本文主要对乳球菌进行详细研究，采用光电比浊法对1号菌和2号菌进行生长曲线绘制，以生长时间为横坐标，600nm处的吸光度为纵坐标绘制乳酸菌生长曲线 。详见图9： 
由图9可见：在接种后4小时内，OD值变化较小，但在4小时后，OD值呈直线上升，进入对数期，直到在10小时后，OD值上升速度缓慢。表明前4小时为1号菌的延迟期，4~9小时为1号菌的对数期，9小时以后为稳定期，将1号菌接种做酸奶培养其养时间可能在4~6小时内。

 
由图可见：在接种后3小时内，OD值变化较小，但在4小时后，OD值呈直线上升，进入对数期，直到在10小时后，OD值上升速度缓慢。表明表明前3小时为2号菌的延迟期，3~10小时为2号菌的对数期，10小时以后为稳定期，将2号菌接种做酸奶培养其养时间可能在4~6小时内。
3.4激活剂的筛选
3.4.1 1号菌：
将1号菌接种于纯牛奶中做发酵培养，其凝乳时间为6小时，为了缩短其凝乳时间，提高经济效益，进行了1号菌的激活剂筛选。通过文献查找，初步选定Vc、佛手瓜、山药、胡萝卜、番茄、马铃薯等作为1号菌激活剂，对1号菌进行激活实验，结果见表3：

表3各激活剂对1号菌的发酵影响
激活剂                     性状                   凝乳时间           结论
空白             凝乳较松软有部分乳清析出，        6小时
有轻微发酵乳香味
VC                凝乳较松软有部分乳清析出         6小时          无激活效果
有淡淡发酵乳香味
佛手瓜汁          凝乳较松软有部分乳清析出
有佛手瓜香味，但无发酵乳特有香味    6小时          无激活效果
山药             凝乳较松软有部分乳清析出，
有轻微山药特有香味及发酵乳香味      6小时          无激活效果
胡萝卜汁    凝乳形态较结实，上层有些许乳清析出，
搅碎后形态均匀，滑润不含块状物，   5小时          有激活效果
无大量乳清分离，
有轻微胡萝卜香味及发酵乳特有香味
番茄汁       凝乳形 态较实，上层有些许乳清析出，  5小时          有激活效果
搅碎后形态均匀，滑润不含块状物，
马铃薯汁     凝乳形态较实，上层微量乳清析出，
搅碎后形态均匀，滑润不含块状物，    4小时         有激活效果
有马铃薯香味及发酵乳的特有香味
验结果表明：VC、佛手瓜、山药等对1号菌发酵无促进作用
              胡萝卜、番茄、马铃薯等对1号菌发酵有促进作用
为了进一步研究胡萝卜、番茄、马铃薯等对1号菌的激活效果，以其新鲜榨汁作为激活剂，对1号菌进行发酵培养并详细记录现象。
工艺条件：新鲜榨的蔬菜汁，蔬菜汁用量5%
          菌种接入量10%  培养温度：40.5oC

表 4　3种果汁对1号菌的发酵影响
时间/激活剂 胡萝卜汁 番茄汁 马铃薯汁 空白
1H 上层无结膜
液体状，无明显变化 上层无结膜
液体状，无明显变化 上层无结膜
液体状，无明显变化 上层无结膜
液体状，无明显变化
2H 上层无结膜
液体状，无明显变化 上层无结膜
液体状，无明显变化 上层有部分粘稠状可流动液体下层部分凝固 上层无结膜
液体状，无明显变化
3H 上层有部分粘稠状可流动液体下层部分凝固 上层有部分粘稠状可流动液体下层部分凝固 凝乳未完全 液体变粘稠
4H 凝乳未完全
 凝乳未完全
 凝乳完全
形态较结实 开始凝乳
5H 凝乳完全
上层有些许乳清析出 凝乳完全
上层有些许乳清析出  6H后凝乳完全取出培养箱
取出培养箱后一段时间观察现象 凝乳形态较实
上层有些许乳清析出搅碎后，形态均匀，滑润不含块状物 凝乳形态较实
上层有些许乳清析出搅碎后，形态均匀，滑润不含块状物 凝乳形态较实
上层微量乳清析出搅碎后，形态均匀，滑润不含块状物，有发酵乳的特有香气 香味 凝乳形态较前3者，不够结实较松软
上层少量乳清析出搅碎后，形态不够均匀含少量块状物
结果表明：马铃薯汁对1号菌种的激活作用效果较为明显，胡萝卜汁和番茄汁对1号菌种的作用相同，均不如马铃薯明显。
为了确定实验的准确性，以相同接种量及激活剂用量再做2次重复试验，得出同结论。为了缩短1号菌的发酵周期，增加激活剂用量观察其是否对1号菌的发酵周期具有更明显的缩短作用。
工艺条件：新鲜蔬菜汁，蔬菜汁用量5% ，10%
  菌种接种量10%  培养温度：40.5oC
               表5 不同接种量对1号菌的发酵影响
时间/激活剂 番茄汁5ml 番茄汁10ml 胡萝卜汁5ml 胡萝卜汁10ml
1H
 上层无结膜
液体状，无明显变化 上层无结膜
液体状，无明显变化 上层无结膜
液体状，无明显变化 上层无结膜
液体状，无明显变化
2H 上层无结膜
液体状，无明显变化 上层无结膜
液体状，无明显变化 上层无结膜
液体状，无明显变化 液体变粘稠
4H 上层有部分粘稠状可流动液体下层凝固
凝乳未完全 上层有部分粘稠状可流动液体下层凝固
凝乳未完全 上层有部分粘稠状可流动液体下层凝固
凝乳未完全 上层有部分粘稠状可流动液体下层凝固
凝乳未完全
5H 凝乳完全
上层有微量乳清析出形态较结实 凝乳完全
上层有微量乳清析出形态较结实 凝乳完全   上层有微量乳清析出
形态较结实 凝乳完全   上层有微量许乳清析出
形态较结实
取出培养箱后于冰箱内4 oC保存24小时观察现象 凝乳形态较实
上层有些许乳清析出搅碎后，形态均匀，滑润不含块状物 凝乳形态较实
上层有些许乳清析出搅碎后，形态均匀，滑润不含块状物 凝乳形态较实
上层微量乳清析出搅碎后，形态均匀，滑润不含块状物 凝乳形态较实
上层微量乳清析出搅碎后，形态均匀，滑润不含块状物
1H 上层无结膜
液体状，无明显变化 上层无结膜
液体状，无明显变化 上层无结膜
液体状，无明显变化 
2H 上层有部分粘稠状可流动液体下层凝固 上层有部分粘稠状可流动液体下层凝固 上层无结膜
液体状，无明显变化 
3H 凝乳未完全 凝乳未完全 液体变粘稠 
表5 不同接种量对1号菌的发酵影响(续)
时间/激活剂 番茄汁5ml 番茄汁10ml 胡萝卜汁5ml 胡萝卜汁10ml

4H 凝乳完全
形态较结实
取出培养箱 凝乳完全
形态较结实
取出培养箱 上层有部分粘稠状可流动液体下层凝固
凝乳未完全 
6H   凝乳完全
形态较结实
有少许乳清析出 
取出培养箱后于冰箱内4 oC保存24小时观察现象 凝乳形态较结实上层微量乳清析出搅碎后，形态均匀，滑润不含块状物 凝乳形态较结实上层微量乳清析出搅碎后，形态均匀，滑润不含块状物 凝乳不够结实较松软
上层少量乳清析出搅碎后，形态不够均匀含少量块状物 
实验表明：三种激活剂对1号菌的凝乳时间均有明显缩短，其中马铃薯汁对1号菌的作用最为明显。故对1号菌选用5%马铃薯汁为激活剂最为恰当。
3.4.2  2号菌：由于菌种自身发酵速度较慢，只对发酵时间进行记录
表 6各激活剂对1号菌的发酵影响
凝乳时间/激活剂 空白 胡萝卜汁 番茄汁 马铃薯汁
 24H 20H 20H 18H
凝乳时间/激活剂 Vc 佛手瓜汁 蛋白胨 酪蛋白胨
 21H 24H 18H 18H

由表8可见：2号菌发酵速度较慢，大量激活剂对其均无明显促进作用，马铃薯汁，蛋白胨，酪蛋白胨等对其有激活效果，但发酵周期仍然过长，新的激活剂有待进一步研究探讨。
3.4.3酸奶各项指标检测结果
经过以上对1号菌和2号菌的激活剂的初步筛选，结果表明对1号菌选用5%马铃薯汁为激活剂最为恰当，2号菌由于其自身发酵速度缓慢，此次研究中所选用激活剂对其虽有促进效果但发酵周期仍然过长，2号菌的激活剂还有待进一步研究，故本次实验中酸奶各项指标的对比检测只对1号菌选用马铃薯汁作为激活剂和1号菌不加激活剂进行检测。
3.4.3.1 酸奶的酸度检测
酸奶的酸度与粘度是酸奶质量的重要指标，固对添1号菌添加了激活剂与不添加激活剂2组进行酸度及粘度比较，观察其发酵效果。
1号菌：对马铃薯汁作为激活剂与空白组进行酸度及粘度比较
     
由图11可见：马铃薯汁组酸度，产酸速度均明显高于空白组，说明马铃薯汁对1号菌的产酸有显著提高。
平均产酸速度：马铃薯汁组：41.45 oT/h   空白组：24.77 oT/h
3.4.3.1 酸奶的粘度检测

表 7铃薯汁与对照组的粘度比较
名称 发酵乳下降时间（每隔1H测一次） 
马铃薯汁 22S45 28S38 ∞ ∞  
空白 24S25 24S28 2M58S18 20M29S66 ∞ ∞
注：∞表示粘度计已无法测出其粘度；S表示秒 ；M表示分钟
由表6见：实验所用粘度计于第3小时开始无法测出马铃薯汁组粘度，已超出其测量范围。说明添加了马铃薯汁的1号菌产胞外多糖（产粘）能力明显提高。胞外多糖可以以荚膜多糖或黏液多糖存在。乳酸菌产胞外 多糖可以提高酸乳的流变学特性，减少或阻止乳清的析出。表明马铃薯汁对1号菌的激活效果可以明显提高酸奶凝乳效果。
3.5乳酸菌的动物实验
为了确定A、B混合菌及从中分离的1、2号单菌是否具有降低胆固醇、甘
油三脂或提高高密度脂蛋白的生物活性功能，进行了动物实验。使用SPSS软件对实验数据进行生物统计[14][15]，结果如下：
3.5.1对胆固醇的影响
     表8 A、B混合菌及1、2单菌对胆固醇的影响
 N Mean Std. Deviation Std. Error
第0周  1.00
        2.00
3.00
4.00
5.00
Total 10
10
10
10
10
50 2.4720
2.4650
2.4730
2.4760
2.4780
2.4782 .33704
.31917
.30137
.28934
.29200
.29549 .10658
.10093
.09530
.09150
.09234
.04179

表9 A、B混合菌及1、2单菌对胆固醇的影响（续）
 N Mean Std. Deviation Std. Error
第2周  1.00
        2.00
3.00
4.00
5.00
Total 10
10
10
10
10
50 2.6500
2.7120
2.1790
2.2800
2.1890
2.4020 .58687
.69977
.55553
.67868
.34116
.60867 .18559
.22129
.17567
.21462
.10788
.08608
第3周  1.00
        2.00
3.00
4.00
5.00
Total 10
10
10
10
10
50 2.4570
2.4110
2.3190
2.4070
2.2430
2.3674 .31486
.47099
.50318
.51547
.34804
.42719 .09957
.14894
.15912
.16301
.11006
.06041
第4周  1.00
        2.00
3.00
4.00
5.00
Total 10
10
10
10
10
50 2.7150
2.5630
2.6070
2.4030
1.9890
2.4554 .51113
.45877
.63764
.67539
.34223
.57652 .16163
.14508
.20164
.21358
.10822
.08153
    
（表中1号，2号，3号，4号，5号分别代表对照组，1号菌，A菌，B菌，2号菌；下同）
表10 A、B混合菌及1、2单菌对胆固醇影响的方差齐性分析
 Levene
Statistic df1 df2 Sig.
第0周
第2周
第3周
第4周 .025
1.304
.543
1.172 4
4
4
4 45
45
45
45 .999
.283
.705
.336
对计量资料多组平均数进行方差齐性分析，Sig.>0.05，则进行方差检验
表11 A、B混合菌及1、2单菌对胆固醇影响的方差分析
 Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
第0周 Between Groups
Within Groups
Total .001
4.277
4.278 4
45
49 .000
.095 .003 1.000
第2周 Between Groups
Within Groups
Total 2.676
15.477
18.153
 4
45
49 .669
.344 1.945 .119
第3周 Between Groups
Within Groups
Total .293
8.649
8.942 4
45
49 .073
.192 .381 .821
第4周 Between Groups
Within Groups
Total 3.222
13.064
16.286 4
45
49 .806
.290 2.775 .038
Sig<0.05,多组之间有差别，进行q检验。  
第4周
表12 A、B混合菌及1、2单菌对胆固醇影响的各组差异性比较
VAR00001 N Stubset for alpha=.05
  1 2
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
Sig. 10
10
10
10
10
 1.9890
2.4030
2.5630
2.6070

.064 
2.4030
2.5630
2.6070
2.7150
.571
由表12可见：5号和1号不出现同一列，表明5号和1号有明显差别，且5号<1号，1号为对照组证明5号即2号菌对降胆固醇有明显效果
3.5.2对甘油三脂的影响
    表13  A、B混合菌及1、2单菌对甘油三脂的影响
 

表14 A、B混合菌及1、2单菌对甘油三脂影响的方差齐性分析
 Levene
Statistic df1 df2 Sig.
第0周
第2周
第3周
第4周 1.215
1.498
1.989
.745 4
4
4
4 45
45
45
45 .318
.219
.112
.567
对计量资料多组平均数进行方差齐性分析，Sig.>0.05，则进行方差检验

表15 A、B混合菌及1、2单菌对甘油三脂影响的方差分析
 Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
第0周 Between Groups
Within Groups
Total .039
4.684
4.723 4
45
49 .010
.104 .093 .984
第2周 Between Groups
Within Groups
Total 1.256
11.547
12.803 4
45
49 .314
.257 1.224 .314
第3周 Between Groups
Within Groups
Total .490
3.545
4.034 4
45
49 .122
.079 1.554 .203
第4周 Between Groups
Within Groups
Total 1.361
2.298
3.659 4
45
49 .340
.051 6.663 .000
Sig<0.05,多组之间有差别，进行q检验。
         

  第4周
表16  A、B混合菌及1、2单菌对甘油三脂影响的各组差异性比较
VAR00001 N Stubset for alpha=.05
  1 2
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
Sig. 10
10
10
10
10
 .8290
.8440
.8760
1.0630

.110 

1.0630
1.2580
.060
由表16可见：5号、4号、3号与1号不在同一列，表明5号、4号、3号对1号有明显差别，1号为对照组，且5号、4号、3号均<1号，证明3号，4号，5号即A菌，B菌，2号菌对降甘油三脂均有明显效果，比较上表数据可得5号即A菌对降甘油三脂效果最明显，4号即B菌次之，3号即2号菌对降甘油三脂效果在3种菌种效果最不明显。
3.5.3对高密度脂蛋白的影响
 表17  A、B混合菌及1、2单菌对高密度脂蛋白的影响
                N Mean Std. Deviation Std. Error
第0周  1.00
        2.00
3.00
4.00
5.00
Total 10
10
10
10
10
50 1.3420
1.3160
1.3570
1.3010
1.3450
1.3322 .19982
.13184
.16761
.12151
.14661
.15092 .06319
.04169
.05300
.03843
.04636
.02134

表17  A、B混合菌及1、2单菌对高密度脂蛋白的影响（续）
                N Mean Std. Deviation Std. Error
第2周  1.00
        2.00
3.00
4.00
5.00
Total 10
10
10
10
10
50 1.2750
1.2770
1.2310
1.1990
1.0940
1.2152 .12403
.18379
.12449
.22820
.10793
.16791 .03922
.05812
.03937
.07216
.03413
.02375
第3周  1.00
        2.00
3.00
4.00
5.00
Total 10
10
10
10
10
50 1.0560
1.0640
1.0810
1.1490
1.1710
1.1042 .09082
.09216
.15531
.14783
.11328
.12693 .02872
.02914
.04911
.04675
.03582
.01795
第4周  1.00
        2.00
3.00
4.00
5.00
Total 10
10
10
10
10
50 1.3600
1.2970
1.2840
1.2080
1.2460
1.2790 .10914
.12000
.18026
.16645
.18020
.15657 .03451
.03795
.05700
.05264
.05698
.02214
表 18 A、B混合菌及1、2单菌对高密度脂蛋白影响的方差齐性分析
 Levene
Statistic df1 df2 Sig.
第0周
第2周
第3周
第4周 .581
1.752
1.276
1.120 4
4
4
4 45
45
45
45 .678
.155
.293
.359
对计量资料多组平均数进行方差齐性分析，Sig.>0. 05，则进行方差检验
表 19 A、B混合菌及1、2单菌对高密度脂蛋白影响的方差分析
 Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
第0周 Between Groups
Within Groups
Total .021
1.095
1.116 4
45
49 .005
.024 .217 .928
第2周 Between Groups
Within Groups
Total .226
1.155
1.381
 4
45
49 .056
.026 2.200
 .084
第3周 Between Groups
Within Groups
Total .109
.680
.789 4
45
49 .027
.015 1.811 .143
第4周 Between Groups
Within Groups
Total .130
1.071
1.201 4
45
49 .033
.024 1.370 .259
Sig.>0.05 说明各组无差别，可得1号，2号，A菌，B菌对高密度脂蛋白均无明显效果。
由乳酸菌的动物实验结果得：A、B菌对降低甘油三脂有明显效果，对胆固醇及高密度脂蛋白均无影响，2号均对降胆固醇及降甘油三脂均有明显效果，但对高密度脂蛋白无影响，1号均对甘油三脂、胆固醇及高密度脂蛋白均无影响。表明2号菌的对人体的有益功能最佳。
3.6本章小节
在本章节中，对实验所察现象进行了详细描述，对实验数据进行了统计分析。
A菌分离得1号、3号、5号3种菌，其中1号为乳球菌，3号、5号为乳杆菌。
B菌分离得2号、4号2种菌，其中2号为乳球菌，4号为乳杆菌。并通过一系列生理生化实验对分离所得菌种进行了鉴定，结果表明1~5号菌均为乳酸菌，具有乳酸菌的生理生化特性。对1号，2号菌进行了激活剂的筛选，得马铃薯汁对1号均具有明显的激活效果，其接入量为5%，菌种接入量为10%；2号菌活性较差。对实验所用菌种及分离所得菌种1号、2号进行动物实验，结果显示A、B菌对降低甘油三脂有明显效果，对胆固醇及高密度脂蛋白均无影响，2号均对降胆固醇及降甘油三脂均有明显效果，但对高密度脂蛋白无影响，1号均对甘油三脂、胆固醇及高密度脂蛋白均无影响。表明2号菌的对人体的有益功能最佳。
 
4、总结与展望
4.1总结
本文通过对乳酸菌的菌落特征，菌体细胞形态以及该菌的生理生化反应实验和运用该菌种做小型发酵实验，证实该菌种为乳酸菌。杆状的即为短乳杆菌，链球状的即为乳链球菌。此次实验通过对乳酸菌的激活剂筛选得出不同的菌种其适用的激活剂不同，激活效果不同。A菌的最佳激活剂为马铃薯汁，用量为5%，接菌量为5%。实验中为了高效分离筛选乳酸菌，应该注意挑取具有典型特征的黄色菌落。另外，在吲哚试验中，为了保证实验的准确性，在加入吲哚试剂后切勿摇动试管，这样乙醚层就不至于被破坏。在糖发酵试验中，应该在灭菌时适当延长煮沸时间，这样可以防止倒置杜氏小管内有残留气泡。在激活剂的筛选实验中，榨取新鲜果汁时应注意尽量保持清洁，减少杂菌感染，灭菌操作要充分，接种时要注意无菌操作，注意了上述几点有利于实验的成功性。
4.2展望
发酵酸奶制品的产量每年以25％ 的速度增长，随着人们生活水平的提高， 人们对发酵酸奶制品的质量、口感提出更高的要求。为了迎合消费者这种需求，一些实力强大的乳品企业为保证发酵制品的质量、口感和生产的标准化．已经在大量使用进口的直投式酸奶发酵剂．而且因为使用传统的商业发酵剂有诸多的缺点．很多中小型乳品企业也在尝试使用方便快捷的直投式酸奶发酵剂， 但是这种菌种使用成本昂贵，目前很多企业期待着口感好、价格适中的优秀的酸奶发酵剂面市。因此，研制能够促进发酵剂迅速发酵又能保持口感的激活剂将是未来市场的热点。

致  谢
感谢浙江科技学院生化学院活泼老师在实验期间的指导与帮助。感谢我的班主任袁秋萍老师，以及所有帮助过我的老师和同学。感谢周燕、赵巧灵等同学在实验上的帮助。感谢五位室友对我生活上的鼓励和帮助。感谢评阅、评议学士论文和出席学士论文答辩会的各位专家学者，感谢你们在百忙之中对我的论文给予指导。

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