聚赖氨酸复合防腐剂的利用策略分析

题    目 聚赖氨酸复合生物防腐剂
      的开发研究     
学    院  生物与化学工程学院  
专    业    食品科学与工程    
班    级     2003级食品A2班 
学    号       103041045      
学生姓名        马  杰        
指导教师        袁海娜        
发放日期      2007年3月5日  

一、主要任务与目标：
研究聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌和黑曲霉的抑菌效果；
研究聚赖氨酸＋乳酸链球菌素复配后的防腐效果；
研究聚赖氨酸＋纳他霉素复配后的防腐效果；
开发高效、安全的复合防腐剂。
二、主要内容与基本要求：
以滤纸片法、光电比浊法等方法研究聚赖氨酸对各腐败菌的最小抑制浓度，考察聚赖氨酸的防腐效果，本论文由于条件所限拟选用（金黄色葡萄球菌和黑曲霉为供试菌）。
以聚赖氨酸为主剂结合乳酸链球菌素、纳他霉素等生物防腐剂，通过不同比例复配，开发高效的复合生物抑菌剂。
三、计划进度：
07.03.05 – 07.03.16   动员，下达任务书，开题报告撰写
07.03.16 – 07.03.24   开题报告上交
07.03.25 – 07.05.15  研究聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌和黑曲霉的抑菌效果；研究聚赖氨酸＋乳酸链球菌素复配后的防腐效果；研究聚赖氨酸＋纳他霉素复配后的防腐效果。开发高效、安全的复合防腐剂。实验数据处理、分析、总结，并开始撰写毕业论文。
07.05.16 – 07.06.17   完成毕业论文的编写、修改，准备毕业论文答辩。
07.06.18 – 07.06.19   论文上交
07.06.23 – 07.06.24   论文答辩。
07年6月底前           成绩评定、评优
四、主要参考文献：
[1]刘钟栋.食品添加剂原理及应用技术(第二版)[M].北京:中国轻工业出版社,2004：267-292。
[2]于雪骊,刘长江,杨玉红. -聚赖氨酸研究现状及应用前景[J],粮食与油脂, 2006,9: 23-28
[3] 唐洁,车振明.天然微生物抗菌防腐剂及其在食品工业上的应用 [J],四川通信科技.2005,7:37-42
[4]孙艳辉,董英. -聚赖氨酸聚赖氨酸的研究进展[J],粮油加工与食品机械,2004,7: 68-69
[5]施庆珊,陈仪本,欧阳友生. -聚赖氨酸的抑菌特性及应用前景[J],食品与发酵工业,2005, 31(6): 76-79
[6]藤井正强等.多聚赖氨酸在食品中的应用[J],食品研究与开发，1993,28 (11)：26-27
[7]魂宝东,孟宪军.天然生物性食品防腐剂纳他霉素的特性及其应用[J],辽宁农业科学,2004,2:24-26
[8]李科德,韩木兰,柏建玲.乳酸链球菌素的研究和应用[J],微生物学通报,2002, 29(4):91-100
[9] Fujii, preservatives containing protamlne and PoIy一lystne[J], Jpn•Kokai tokkyo koho, 1988:63-112
[10] Ezaki,cture otsalads and meat products usiing preservatives[J], Japan．Kokal Tokkyo koho, 1993(4):304-840

指导教师                年   月   日   
 
系 主 任                年   月   日

聚赖氨酸复合防腐剂的开发研究
学生姓名：马杰          指导老师：袁海娜
（浙江科技学院生物与化学工程学院）
摘 要：聚赖氨酸(PL)是一种含有25～30个赖氨酸残基的同型单体聚合物。由赖氨酸残基通过 －羧基和 －氨基形成的酰胺键连接而成，具有广谱抑菌性。乳酸链球菌素(Nisin)称乳酸链球菌肽或乳链菌素，是由34个氨基酸组成能抑制大部分革兰氏阳性菌及其芽孢的生长和繁殖的抗菌素。纳他霉素(Natamyein)也称游链霉素(Pimaricin)，是一种能够专性抑制酵母菌和霉菌的多烯类抗菌素。三种抗菌素均为安全、高效的生物抗菌剂，具有广泛的开发前景。
本实验以Staphylococcus aureus和Aspergillus niger为供试菌，通过滤纸片法、光电比浊法等方法分别研究了聚赖氨酸对各腐败菌的抑菌效果，基本确定了最小抑菌浓度；通过将聚赖氨酸分别与乳酸链球菌素、纳他霉素以不同比例复合，研究开发新型安全、营养的复合防腐剂。实验结果表明：聚赖氨酸、乳酸链球菌素和纳他霉素有很好的抑菌性能，通过复合可以在降低使用成本的同时提高抑菌效果。

Study on PL Compound Preservative
Student’ s name：Majie         Advisor：Yuanhaina
（School of Biological and Chemical Engineering Zhejiang University of Science and Technology）
Abstract: PL is a kind of monomer polymer including 25 ~ 30 lysine units which are linked by the bond formed by carboxyl group and amino. PLhas the broad spectrum bacteriostasis ability.  Nisin is composed of 34 amino acids which can inhibit growth and reproduction of Gram-positive bacteria and its spore. The natamycin also called Pimaricin, is a kind of polyalkene antibiotic. It can specially inhibit yeast and the mold. Three antibiotics are all safe, and efficient biological antibacterial agent which deserve to develop.
In this paper, Staphylococcus aureus, and Aspergillus niger  were use as subject. By filter sheet and colorimetric method, the inhibition ability of poly-L-lysine, to the above subjects were experimented. The minimum inhibitory concentration was determined. The inhibition action of compound with poly-L-lysine, natamycin, nisin by different molar ratio was studied too. The results showed that poly-L-lysine, natamycin and nisin deserved to be developed with remarkable inhibition activity, specially for the compounds.
关键词：聚赖氨酸；纳他霉素；乳酸链球菌素；复合防腐剂

Keywords： PL; Nisin; Natamycin; Compound preservative
 
目  录
中文摘要 I
英文摘要 II
目录 III
1  绪论 1
1.1  我国食品防腐剂的发展现状 1
1.2   生物防腐剂 1
1.2.1  生物防腐剂的研究进展 1
1.2.2  复合防腐剂的抑菌效果 2
1.3  本实验的研究目的和意义 2
1.4  本实验的研究内容和预期结果 3
1.4.1  研究聚赖氨酸对各腐败菌的抑菌效果 3
1.4.2  开发聚赖氨酸复合防腐剂 3
1.5  本章小结 3
2  实验部分 4
2.1  材料与仪器 4
2.1.1  主要材料 4
2.1.2  主要仪器 4
     2.2  实验方法 5
         2.2.1  菌悬液的制备 5
         2.2.2  菌悬液浓度确定 5
         2.2.3  抑菌实验(滤纸片法) 6
     2.3  复合防腐剂的抑菌效果测定 6
         2.3.1  聚赖氨酸抑菌效果的测定 6
         2.3.2  聚赖氨酸和乳酸链球菌素复合的抑菌效果的测定 6
         2.3.3  聚赖氨酸与纳他霉素复合的抑菌效 果的测定 7
     2.4  本章小结 7
3  结果与讨论 8
3.1  聚赖氨酸抑菌效果 8
3.2  聚赖氨酸和乳酸链球菌素复合抑菌效果 9
3.3  聚赖氨酸与纳他霉素复合抑菌效果 11
3.4  本章小结 11
4. 总结与展望 12
致谢 13
参考文献 14

 
1  绪论
1.1我国食品防腐剂的发展现状
食品的腐败变质主要是指由于微生物的作用而导致食品质量下降或失去食用价值的一切变化，它直接影响食品的品质和消费者的健康。我国允许使用的食品防腐剂约18种，主要品种有：苯甲酸钠、山梨酸及其钾盐、丙酸钙等，生物防腐剂的开发和应用尚处于起步阶段。苯甲酸系列、山梨酸系列、丙酸盐等这些防腐剂均为化学合成的防腐剂，化学防腐剂如果在规定剂量内使用，是不会对人体产生毒副作用，但如果超剂量使用会产生累积毒性，而且有的化学防腐剂还有致癌作用[1-2]。近年来，我国屡次发生的防腐剂超量添加引起的食品安全事故引起了社会各界的广泛关注。因此，安全、高效的天然食品防腐剂的开发和生产成为食品防腐领域发展的趋势和要求。
1.2生物防腐剂
生物食品防腐剂是天然防腐剂中的一大类，是指通过微生物发酵的方法，从发酵液中提取分离得到有抑菌作用的物质，主要为多肽类物质。目前，国外一些发达国家批准使用的微生物食品防腐剂有乳酸链球菌素(Nisin)、纳他霉素(Natamycin)和聚赖氨酸(poly-L-lysine)。我国分别于1990年和1996年批准上述前两种微生物防腐剂用于食品防腐保鲜。后者，也是一种抑菌效果明显的微生物食品防腐剂，其在日本应用广泛，在我国的研究才刚刚起步。由于这三种微生物防腐剂安全无毒、抑菌作用强，因此具有广阔的应用前景[3]。
1.2.1三种生物防腐剂的研究进展
聚赖氨酸的化学合成是在1947年完成的。1977年日本学者从放线菌培养过滤液中提取出一种含有25～30个赖氨酸残基的同型单体聚合物。这种赖氨酸聚合物是赖氨酸残基通过 -羧基和 -氨基形成的酰胺键连接而成。故称为聚赖氨酸(PL),其分子式为[4]：
 
图1   一PL结构图
聚赖氨酸具有广谱抑菌性，对革兰氏阳性和阴性菌如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、乳酸菌、金黄色葡萄糖球菌等的繁殖有抑制作用，而对霉菌的抑制作用较小。作为保鲜剂聚赖氨酸具有安全性高、在水中的溶解性极强、热稳定性好、使用范围广和不影响食品风味等优点。在中性和微酸性环境条件下均有较强的抑菌性。由于对热稳定，故加入后可热处理，因此还能抑制一些耐热性芽孢杆菌等。另外，聚赖氨酸对一些呈蝌蚪状的非收缩性长尾噬菌体也有抑制作用。值得注意的是，具有高抑菌活性的聚赖氨酸至少必须有10个以上赖氨酸单体，而且利用微生物合成的聚赖氨酸其抗菌活性高于化学合成的聚赖氨酸(含有50个赖氨酸单体)[5]。实践中发现聚赖氨酸可与食品中的蛋白质或酸性多糖发生相互作用，导致抗菌能力的丢失，并且聚赖氨酸有弱的乳化能力。因此聚赖氨酸被限制于淀粉质食品[6]。
    纳他霉素(Natamyein)也称游链霉素(Pimaricin)，是一种多烯大环内酯类抗真菌剂,也称游链霉素。纳他霉素是近白色至奶油黄色结晶粉末,几乎无臭无味。其抑菌机理是纳他霉素分子的疏水部分即大环内酯的双键部分以范德华力和真菌细胞质膜上的甾醇分子结合,形成抗生素---甾醇复合物,破坏细胞质膜的渗透性;分子的亲水部分即大环内酯的多醇部分则在膜上形成水孔,损伤膜的通透性,从而引起菌内氨基酸、电解质等重要物质渗出而死亡。但有些微生物如细菌的细胞壁及细胞质膜不存在这些类甾醇化合物,所以纳他霉素对细菌没有作用[7]。
乳酸链球菌素(Nisin)称乳酸链球菌肽或乳链菌素，是从乳酸链球菌发酵产物中提制的一种多肽抗菌素类物质,是一种世界公认的安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。由34个氨基酸组成，分子式为C143H228N42O37S7。Nisin是一种白色粉末,使用时需溶于水或液体中[8]。Nisin能抑制大部分革兰氏阳性菌及其芽孢的生长和繁殖，如葡萄球菌属、链球菌属、乳酸杆球菌属以及梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的细菌，特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显[9]。
1.2.2 复合防腐剂的抑菌效果
单一防腐保鲜剂允许使用量内很难达到防腐效果的问题，容易发生超标，且易受环境因素影响，一般抑菌谱较窄。例如：单独使用聚赖氨酸对枯草芽胞杆菌、黑曲霉抑制不明显，然而采用聚赖氨酸与醋酸复合作用对枯草杆菌等耐热性较强芽胞菌抑制增强，即聚赖氨酸与醋酸双重作用比单独使用时抑菌范围更广泛[10]。
1.3 本实验的研究目的和意义
为了保持食品的品质以及延长食品的保存期需要，防腐剂广泛地应用于食品的生产中。我国常用的食品防腐剂有许多种类，由于这些防腐剂均为化学合成的防腐剂对人体健康有一定影响，随着人们生活水平的提高日益需要更安全的防腐剂。日本开始使用聚赖氨酸、Nisin等以微生物发酵法生产的防腐剂替代传统的化学合成的防腐剂，这些生物防腐剂的安全性越来越引起人们的重视。
聚赖氨酸由于其抗菌性和安全性已广泛应用到食品工业的各个领域，如用于面包点心、奶制品、肉制品、冷藏食品和袋装食品等。聚赖氨酸作为一种生物防腐剂，并且是人体必须氨基酸—— 赖氨酸的聚合物。对于多聚赖氨的研究、生产和应用尚处于初级阶段，所以需加快发展运用高新技术提高其质量、档次，以进一步推动我国食品工业的发展，适应日益增长的食品市场的需求[11]。
单一防腐保鲜剂允许使用量内很难达到防腐效果的问题，容易发生超标，且易受环境因素影响，一般抑菌谱较窄，而-聚赖氨酸复合防腐剂就可以提高防腐的高效性，并保证各种成分单体远低于国家卫生标准，大大提高产品安全性。还可以提供更加宽松的环境要求和更广的抑菌谱，使用更加安全。聚赖氨酸复合防腐剂更加经济、适用，由于利用了单种防腐剂的各自优点，避开缺点，同时发挥之间的协同增效作用，使产品在尽可能低用量发挥最大的效能[12]。
1.4 本实验的研究内容和预期结果
1.4.1研究聚赖氨酸对各腐败菌的抑菌效果
以滤纸片法、光电比浊法等方法研究聚赖氨酸对各腐败菌的最小抑制浓度，考察聚赖氨酸的防腐效果，本论文由于条件所限拟选用（金黄色葡萄球菌和黑曲霉为供试菌）。
1.4.2开发聚赖氨酸复合防腐剂
以聚赖氨酸为主剂结合乳酸链球菌素、纳他霉素等生物防腐剂，通过不同比例复配，开发高效的复合生物抑菌剂。
1.5本章小结
本章 通过对食品防腐剂现状的描述，揭示出食品防腐剂目前存在的安全问题，进而提出开发新型生物防腐剂，针对目前防腐剂使用超标，严重影响食品安全的情况，提出通过生物复合防腐剂的研究开发，解决食品防腐剂的安全问题。
 
2  实验部分
2.1材料与仪器
2.1.1主要材料
菌种：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、黑曲霉(Aspergillus niger)，由我院实验室提供。
培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基：
牛肉膏      0.3g
蛋白胨      1.0g
NaCl        0.5g
水          100ml
pH          7.6
琼脂        2%
121℃灭菌20min
马铃薯培养基（PDA）：
马铃薯汁（20%）     100ml
葡萄糖              5.0g
琼脂                1.5-2.0g
pH                  7.6
121℃灭菌20min
液体培养基：
牛肉膏      0.3g
蛋白胨      1.0g
NaCl        0.5g
水          100ml
pH          7.6
121℃灭菌20min[12]
2.1.2主要仪器
AB204-N电子分析天平                梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司
BP-2型托盘天平                     上海医用激光一起厂
XW-80A型旋涡混合器                 上海医用仪器厂
YXQ-LS-50S1型立式压力蒸汽灭菌器    上海博迅实业有限公司医疗设备厂
SW-CJ-1B型单人单面净化工作台       苏州净化设备有限公司
SPX-100B-2型生化培养箱             上海博迅实业有限公司医疗设备厂
MJX-250B-Z霉菌培养箱               上海博迅实业有限公司医疗设备厂
2.2实验方法
2.2.1 菌悬液的制备
把各种菌进行活化，细菌用牛肉膏蛋白胨固体培养基，37℃培养，真菌用马铃薯培养基（PDA）28℃培养。用无菌生理盐水配制菌悬液备用。其中黑曲霉配成菌悬液后用4层擦镜纸过滤，取孢子悬液备用。
2.2.2 菌悬液浓度确定
因为我们实验中需要多次对菌悬液的浓度进行测定，所以简便准确的测定方法对实验的效率很重要。因此我们根据方法的简易程度依次进行了显微镜直接计数、光电比浊计数和平板菌落计数。具体方法如下：
方法一：显微镜直接计数法
(A) 菌悬液配制:用无菌生理盐水配制菌悬液。
(B) 检血球计数板:在加样品前，先镜检血球计数板，若有污物，则清洗干净，吹干后再进行计数。
(C) 加样品:将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌毛细管将摇匀的菌液由盖玻片一端滴一小滴，让菌液自动流入计数室，并充满小室。
(D) 显微镜计数:加样静止5min后，用显微镜计数。本实验采用25中格，每中格16小格的血球计数板。计数时只需数4个角和中间的5个中格中的菌数，再乘以5即为一计数室内的菌数。一计数室体积为0.1mm3。
(E) 清洗血球计数板:此法简便，但结果活菌与死菌的和，有一定误差。
方法二：光电比浊计数法
（A）菌液标准曲线的制作：无菌液体培养基为空白在560nm处测定各梯度的菌液OD值并绘制标准曲线。
（B）将各梯度进行平板菌落计数，结果与上述OD值对照，确定菌液浓度与OD值的关系。
方法三：平板菌落计数法
无菌操作将原菌液进行10倍梯度稀释，再依次从各试管中取0.2ml菌液在琼脂平板上涂布，最后放入恒温培养箱中培养至长出单菌落，再计数，乘以相应的梯度即为原菌液的浓度。使用之前再根据需要将原菌液用无菌生理盐水稀释。此法可准确测量活菌数，但需要时间长（至少1天）[13]。
2.2.3 抑菌实验（滤纸片法）
选择吸水性强的滤纸，打孔器制作直径为6mm的圆形滤纸片，经灭菌后，浸在抑菌剂中保持5min，制备滤纸片。分别用和空白做对照。具体方法如下：
用无菌吸管吸取0.2ml的菌悬液，放入灭菌琼脂培养皿中，涂布均匀,做成含菌平板，用灭菌镊子夹出含有抑菌剂滤纸片放在培养基上，每皿做3份平行。细菌类置入37℃恒温培养箱，真菌类置入28℃恒温培养箱中培养至长出菌落，观察抑菌效果。
2.3 复合防腐剂的抑菌效果测定
2.3.1 聚赖氨酸的抑菌效果测定
各取2ml聚赖氨酸（1.5%、1.0%、0.5%、0.2%、0.15%、0.1%、0.05%、0.025%）、2ml二倍浓度的牛肉膏蛋白胨液体培养基、0.1ml的菌悬液加入试管，金黄色葡萄球菌在37℃培养箱中培养24h,黑曲霉在28℃培养箱中培养48h，比浊法测定抑菌效果。金黄色葡萄球菌做三组平行实验，黑曲霉做两组平行。
各组的空白为2ml无菌水，2ml二倍浓度的牛肉膏蛋白胨液体培养基然后加入0.1ml的菌悬液，于冰箱中保存，备用。（注：用加菌的空白，可以测出加抑菌剂的试管中的菌浓度在培养后的变化。）
2.3.2 聚赖氨酸和乳酸链球菌素复合后的抑菌效果测定
实验所用菌种为金黄色葡萄球菌，菌悬液浓度为106cfu/ml。
取三组抑菌效果好的聚赖氨酸浓度（0.1%、0.075%、0.05%），乳酸链球菌素浓度(3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%、0.5%)进行复配。由于乳酸链球菌素的抑菌浓度偏高，超过万分之五的残留量，所以分别进行高浓度组（3.0%、2.5%、2.0%）和低浓度组（1.5%、1.0%、0.5%）实验。
具体方法：取1ml聚赖氨酸，1ml乳酸链球菌素，0.1ml菌悬液于试管中，放入37℃培养箱中培养24h。取0.1ml培养后的菌涂平板。
2.3.3聚赖氨酸和纳他霉素复合的抑菌效果测定
实验所用菌为黑曲霉，菌浓度106，
聚赖氨酸选用(0.75、0.5、0.25),纳他霉素选用(1.0、0.5、0.25)
实验方法：方法同上
2.4本章小结
本章阐述了用显微镜直接计数法、光电比浊计数法、平板菌落计数法测定菌悬液浓度的实验方法，同时研究了聚赖氨酸、聚赖氨酸与乳酸链球菌素复合、聚赖氨酸和纳他霉素复合抑菌效果测定的方法。

3  结果与讨论
3.1聚赖氨酸抑菌效果
表1、图2为采用比浊法测定PL对金黄色葡萄球菌的结果。图2显示：一定浓度的PL对金黄色葡萄球菌有抑菌效果。且在此过程中，随着PL浓度的增加，抑菌效果增强。当PL的浓度从0.025%增加到0.15％时，达到了最佳的抑菌效果。但当浓度继续增加时，金黄色葡萄球菌又出现了生长情况，而且此后随着PL浓度的继续增加，金黄色葡萄球菌继续生长。这可能是由于PL在抑制金黄色葡萄球菌生长的同时，又可以作为金黄色葡萄球菌的N源营养素。
表1 聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌和黑曲霉的抑菌效果
PL 金黄色葡萄球菌 黑曲霉
1.5% 0.2104 0.0422
1% 0.1842 0.0445
0.5% 0.1265 0.1354
0.2% 0.1039 
0.15% 0.0828 
0.1% 0.0943 
0.05% 0.1222 
0.025% 0.2313 

 
图2  PL对金黄色葡萄球菌的抑菌效果
 
图3  PL对黑曲霉的抑菌效果
图3为PL对黑曲霉的抑菌实验结果。实验中数据有一定的波动。
表2  聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌、黑曲霉的抑菌效果
PL 黑曲霉 金黄色葡萄球菌
0.25% +++ -
0.5% +++ -
0.75% - -
注：+++为菌落非常多，++为菌落比较多， +为有菌落，-为没有菌落。
表2为采用平板菌落计数法测定的PL对金黄色葡萄球菌、黑曲霉的抑菌实验结果。上表数据表明，聚赖氨酸在0.75%的时对黑曲霉有一定的抑菌效果，而低于此浓度没有抑菌作用。这与图3中比浊法的结果基本一致。同时对金黄色葡萄球菌的平板菌落计数发现PL对其有较强的抑菌效果。
3.2 聚赖氨酸与乳酸链球菌复合抑菌效果
表3数据表明，0.0375%的聚赖氨酸与不同浓度的乳酸链球菌复合，其中聚赖氨酸0.0375%+乳酸链球菌素0.5625%复合的抑菌效果最好。

表3  0.0375%聚赖氨酸与乳酸链球菌复合的抑菌效果
复配比例 长菌个数
聚赖氨酸0.0375%+乳酸链球菌素0.1875% ++
聚赖氨酸0.0375%+乳酸链球菌素0.375% +++
聚赖氨酸0.0375%+乳酸链球菌素0.5625% +++
聚赖氨酸0.0375%+乳酸链球菌素0.75% -
聚赖氨酸0.0375%+乳酸链球菌素0.9375% +
聚赖氨酸0.0375%+乳酸链球菌素1.125% +

注：+++为菌落非常多，++为菌落比较多，+为有菌落，-为没有菌落。
表3数据表明，0.05625%的聚赖氨酸与不同浓度的乳酸链球菌复合，其中聚赖氨酸0.05625%+乳酸链球菌素0.0375%复合的抑菌效果最好。
表4  0.05625%聚赖氨酸与乳酸链球菌复合的抑菌效果
复配比例 长菌个数
聚赖氨酸0.05625%+乳酸链球菌素0.1875% +++
聚赖氨酸0.05625%+乳酸链球菌素0.375% -
聚赖氨酸0.05625%+乳酸链球菌素0.5625% +
聚赖氨酸0.05625%+乳酸链球菌素0.75% +
聚赖氨酸0.05625%+乳酸链球菌素0.9375% +
聚赖氨酸0.05625%+乳酸链球菌素1.125% +
注：+++为菌落非常多，++为菌落比较多，+为有菌落，-为没有菌落。
表4数据表明，当聚赖氨酸的浓度达到0.075%时，无论与何种浓度的乳酸链球菌复合，其抑菌效果明显，且当聚赖氨酸0.075%+乳酸链球菌素0.375%复合的抑菌效果最好。
表5  0.075%聚赖氨酸与乳酸链球菌复合的抑菌效果
复配比例 长菌个数
聚赖氨酸0.075%+乳酸链球菌素0.1875% +
聚赖氨酸0.075%+乳酸链球菌素0.375% -
聚赖氨酸0.075%+乳酸链球菌素0.5625% +
聚赖氨酸0.075%+乳酸链球菌素0.75% +
聚赖氨酸0.075%+乳酸链球菌素0.9375% +
聚赖氨酸0.075%+乳酸链球菌素1.125% +
注：+++为菌落非常多，++为菌落比较多，+为有菌落，-为没有菌落。

3.3 聚赖氨酸与乳酸链球菌复合抑菌效果
表6数据表明，当聚赖氨酸的浓度达到0.1875%时，聚赖氨酸0.1875%+纳他霉素0.3750%复合的抑菌效果最好；当聚赖氨酸的浓度达到0.3750%时，聚赖氨酸0.3750%+纳他霉素0.3750%复合的抑菌效果最好；当聚赖氨酸的浓度达到0.5625%时，聚赖氨酸0.5625%+纳他霉素0.3750%复合的抑菌效果最好。
表6  聚赖氨酸和纳他霉素复合的抑菌情况
复配 长菌个数
聚赖氨酸0.1875%+纳他霉素0.3750% +
聚赖氨酸0.1875%+纳他霉素0.1875% ++
聚赖氨酸0.1875%+纳他霉素0.0938% ++
聚赖氨酸0.3750%+纳他霉素0.3750% +
聚赖氨酸0.3750%+纳他霉素0.1875% +++
聚赖氨酸0.3750%+纳他霉素0.0938% +++
聚赖氨酸0.5625%+纳他霉素0.3750% +
聚赖氨酸0.5625%+纳他霉素0.1875% ++
聚赖氨酸0.5625%+纳他霉素0.0938% ++
注：+++为菌落非常多，++为菌落比较多，+为有菌落，-为没有菌落。
3.4本章小结
本章通过对聚赖氨酸、聚赖氨酸与乳酸链球菌素复合、聚赖氨酸和纳他霉素复合的抑菌效果的测定，得出其最佳抑菌浓度，阐明复合防腐剂确实能解决单一防腐保鲜剂允许使用量内很难达到防腐效果，容易发生超标，且易受环境因素影响，抑菌谱较窄的问题，而复合防腐剂就可以提高防腐的高效性并保证各种成分单体远低于国家卫生标准，大大提高产品安全性。

4  总结与展望

多聚赖氨酸复合防腐剂在食品中可用于肉制品、高盐食品、快餐、色拉、蛋糕等食品的保鲜，而且保鲜效果较好。多聚赖氨酸复合防腐剂由于可以抑制酵母菌的增殖，并在中性和微酸性的PH值范围内，还能够很好地抑制其它微生物的生长，使其越来越多地用来改善食品的保存期。多聚赖氨酸复合防腐剂可以提高食品的保鲜效果，同时降低单一防腐剂的用量。聚赖氨酸作为一种生物防腐剂，并且是人体必须氨基酸—— 赖氨酸的聚合物随着进一步的研究，其应用领域在不断增加。多聚赖氨酸复合防腐剂作为一种天然防腐剂，它添加于食品中仅需微量就能奏效，且不会影响食品口味感，因安全健康而符合现代人对健康的要求，在生产应用上以其低成本、高效而提高市场竞争力。
随着国民经济的不断发展，人民生活水平的不断提高，人们对食品要求也更高了：更多样化、更新鲜、更有营养、更健康。所以对食品的添加剂和防腐剂也要求越来越高。目前，日本对于营养型天然食品防腐剂聚赖氨酸已经批量生产，而我国的食品防腐剂多年来一直以化学防腐剂为主，天然食品防腐剂只有少数的几种，对于聚赖氨酸的研究、生产和应用尚处于初级阶段，所以需加快发展运用高新技术提高其质量、档次，以进一步推动我国食品工业的发展，适应日益增长的食品市场的需求。

致谢
本课题是在我的指导老师袁海娜的亲切关怀和悉心指导下完成的。她严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从课题的选择到项目的最终完成，袁老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。大学四年来，袁老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向袁老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。
感谢班主任袁秋萍老师以及食品专业的每位老师，有你们的悉心教导，才让我掌握过硬的专业知识，才有我今天的毕业。
感谢生化学院的各位老师，各位领导，在人生路上指引我前进。
感谢我的实验搭档刘颖等同学，有他们的密切配合，才能得出完整的实验数据，向科学靠近。
感谢我的室友们，大学四年让我们培养了真挚的兄弟情意，成为我今后宝贵的财富。
最后，我要特别感谢我的家人，没有你们的支持，就没有今天的我。
愿把我的幸福和快乐都送给关心和支持过我的人，也愿他们一切如意。

参考文献
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乳酸链球菌的应用
关键词：细菌,乳酸链球菌，食品防腐剂，溃疡治疗，乳腺炎
摘要：大约30年前，乳酸链球菌作为食品防腐剂首次引入英国。最初乳酸链球菌是作为乳酪产品生产加工过程的防腐剂，而后也同样大量用于其他食品和饮料产品的防腐。目前大约有50个国家都认为乳酸链球菌是安全的食品防腐剂。我们将简要的回顾一下乳酸链球菌在加工奶酪，各种奶类乳制品和蔬菜罐头的保存中作为防腐剂的应用。乳酸链球菌最近更多的是应用于在高湿度条件下作为烘焙制品和奶类液体蛋制品的防腐剂。最让人感兴趣的是其天然乳酪制品生产中的防腐应用。现今对乳酸链球菌的防腐性能的大量研究工作已展开。利用乳酸链球菌来控制啤酒，葡萄酒，酒精和低PH值的食品如沙拉酱中腐烂乳酸菌的繁殖。乳酸链球菌的发展前景是利用其与其他链球菌和其他细菌的协同效应形成螯合剂，并且在新型食品加工技术，如高压消毒，电弧消毒中作为辅料。生产高纯度的乳酸链球菌，并加入其他的螯合剂以增强链球菌在人类溃疡治疗和牛的乳房炎的治疗正为人们所关注。
引言
    乳酸链球菌肽是一种低分子量的抗菌蛋白或有益菌，可以由Lactococcus lactis合成。Lactis(以下称为L lactis).它被用于食品防腐剂已经有30年了。纯乳酸链球菌肽的制备的最新发展导致了它在兽医和制药上的应用。乳酸链球菌肽在20年代末30年代初首先发现的，那时它被认为是牛奶中有毒物质，这对乳酪生产起了不良影响(Rogers & Whittier 1928; Whitehead 1933)。乳酸链球菌肽发展的分界线是作为食品防腐剂的特性，由英国谢菲尔德乳制品研究国家学院于1947年发现的。1951年，Hirsch首先发现它可以最为食品防腐剂，并在1952年对它在乳酪生产中的防腐剂做了研究。乳酸链球菌肽商业上的发展是有Aplin & Barrett在1957进行的。1962年许多工作证实乳酸链球菌肽没有毒性。1971年建立起乳酸链球菌肽分子结构。1969年JECFA对乳酸链球菌肽商业上按纯度规定，并在1970年由WHO建立了乳酸链球菌肽国际参考标准。乳酸链球菌肽作为食品防腐剂在50个国家获得认可，包括EEC（乳酸链球菌肽的食品添加剂号位E234）和USA（1990）。
   商业上的乳酸链球菌肽包含21/2%的乳酸链球菌肽A，平衡物是使用食盐和由改良的牛奶媒介发酵的乳化固体，这种乳化固体是由乳酸链球菌肽的L lactis链形成的。产品的浓度是每加仑1百万个国际单位。Aplin &Barrett Ltd,运用了微生物技术制备出了高产量的乳酸链球菌，大约有400000国际单位/毫克。另一种乳酸链球菌Nisin Z,现被称之为His 的替代品。这份报告所有提及的乳酸链球菌的浓度均是指纯的乳酸链球菌的含量。
抗菌谱
实验表明，乳酸链球菌对革兰式阳性菌有很强的抑制作用，而对革兰式阴性菌和酵母菌，霉菌却表现出很弱甚至没有抑制作用。革兰式阳性菌的芽孢对乳酸链球菌尤为敏感。正因为乳酸链球均有如此广的抗菌谱而被用做产品的防腐剂。同时也表明乳酸链球菌也有很强的抵制活性。像这样适合在低PH的条件下繁殖生长的细菌，乳酸链球菌就能对在生产加工过程中没有进行热处理的低PH的食物，例如沙拉酱和酒精饮料中，起到很好的防腐作用。酵母菌对乳酸链球菌的不敏感性正表明两者可一起应用于抑制乳酸菌的生长。L. monocytogenes是适合低温下生长的一种恶性病原体，小孩，老人，孕妇，和免疫系统能力低下的人感染率都非常的高，一旦感染会引起严重的疾病，甚至有很高的死亡率。乳酸链球菌对L. monocytogenes有很强的抑制的作用。实验中已经用乳酸链球菌来杀灭多种食物中的L. monocytogenes。
乳酸链球菌对植物细胞的作用
乳酸链球菌的使用浓度是依据乳酸链球菌的数量和需要抑制的植物的细胞和芽孢的数量来确定的。它主要是通过对植物细胞膜的去极化作用来破坏植物的细胞壁从而对植物细胞产生破坏。Henning 和他的合作者用事实证明了乳酸链球菌的抗微生物作用是由于乳酸链球菌和细胞膜的磷脂相互作用而引起的，乳酸链球菌和磷脂形成复杂的链球菌—磷脂化合无。他们发现只要分离出细胞膜就可阻止乳酸链球菌对植物细胞的作用。
乳酸链球菌对植物细胞的作用机制可以是灭菌机理也可以是抑菌机理，这些都取决于链球菌的浓度，细菌的浓度，当前的环境条件以及植物的生理状态。当周围环境符合细菌的最适宜生长条件时，例如，最适宜的温度，PH，营养供能充足等等，乳酸链球菌更多的是表现出杀菌的作用机制。相反，当周围条件不是细菌的最适宜生长条件，或有其他的抑菌剂在起作用时，链球菌此时表现出的确是抑菌机制。事实上，运用不同的条件使防腐剂对食品中的微生物是杀灭还是抑制应该给予足够的重视。
    Abee et al证明，L .monocytogenes 细胞如果在30℃的条件下生长的话，乳酸链球菌Z在4℃以下才会失去其作用，反之，如果细胞在4℃的条件下生长，那么乳酸链球菌会在4℃的条件下诱导细胞破裂而死亡。