固定化酶水解黄鱼的的化学技术探讨

目  录
中文摘要 I
英文摘要 II
目录 III
1.  绪论 1
1.1  固定化酶的研究进展 1
1.2  固定化酶的特点和优点 1
1.3  酶的固定化方法 2
1.4  固定化酶中应用的材料 3
         1.4.1  有机分子载体 3
 1.4.2  无机载体材料 3
          1.4.3  复合载体材料 4
1.5  固定化酶的应用和研究意义 4
1.5.1  固定化酶在临床医药方面的应用 4
1.5.2  固定化酶在食品工业的应用 4
1.5.3  固定化酶在生物感应器中的应用 5
1.5.4  固定化酶在化工领域的应用 6
2.  实验部分 7
2.1  实验材料 7
2.2  实验仪器 7
2.3  测量方法 7
     2.3.1  氨基酸含量的测定 7
    2.3.2  NaOH标准溶液的标定 8
2.4  标准草酸的制备 8
2.5  实验流程 9
     2.5.1  前处理 9
     2.5.2  称量和制成鱼糜 9
    2.5.3  PH的调节 9
    2.5.4  酶的固定化 9
    2.5.5  酶解和过滤，烘干 10
     2.5.6  测定氨基酸氮的含量 10
3. 结果与讨论 11
3.1  单因素对水解反应的影响    11
3.1.1  反应体系PH值对水解反应的影响   11
3.1.2  反应温度对水解反应的影响 12
3.1.3  酶浓度对黄鱼水解的影响 12
3.1.4  水解时间对酶的影响 13
3.2  正交实验确定固定化酶水解黄鱼的最佳条件 14
3.3  固定化蛋白酶重复使用次数实验 15
3.4  比较固定化酶与游离形态酶活性的差异 16
3.5  比较固定化中性蛋白酶和固定化酸性蛋白酶活力差异 17
4． 总结与展望 18
致谢 19
参考文献 20

1  绪论
酶是生物产生的具有催化活性的蛋白质，它能特定促成本身不参加反应，具有反应效率高，条件温和，反应产物污染小，耗能低，反应容易控制等特点。这是任何无机催化剂都无法比拟的优点。但因为酶的化学本质是蛋白质，其最大的弱点是不稳定性，对酸，碱，热及有机溶液容易发生酶蛋白的变性作用，从而降低或失去活性[1]。而且酶往往在溶液中进行反应，反应以后会残留在溶液系统在中不易回收，最终造成产品生化分离提纯操作上的麻烦。加之酶反应只能分批进行，难于连续，自动化操作。这大大地阻碍了酶工程的发展应用。固定化酶能从反应以后的残留溶液中提取出来，仍可重复使用多次。完全克服了游离化酶的缺点大大提高了酶的利用率，降低了生产的成本。
1.1  固定化酶的研究进展
酶固定化技术于[2]2O世纪6O年代应运而生并发展起来。它是模拟体内酶的作用方式(体内酶多与膜类物质相结合并进行特有的催化反应)，通过化学或物理的手段，用载体将酶束缚或限制在一定的区域内，使酶分子在此区域进行特有和活跃的催化作用，并可回收及长时间重复使用的一种交叉学科技术。固定化酶方面的研究已得到了长足的发展，在理论研究和应用研究方面取得了许多重要成果。如：高科技制备有更高的活性的固定化酶；酶的定向固定化和多酶共固技术；使用改性载体及新型载体固定化酶。目前，固定化酶技术已成为酶工程的研究重点和热点之一。
1.2  固定化酶的特点和优点
酶固定化以后，一些性质发生了改变，主要特点表现如下：
(1)酶的稳定性提高；
(2)最适pH值改变；
(3)酶的活性和催化底物有所变化；
(4)最适温度有所提高；
(5)对抑制剂和蛋白酶的敏感性降低。
固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。与水溶性酶相比，优点如下：
(1)易于将固定化酶与底物、产物分开，方便后续的分离和纯化；
(2)可以在较长时间内连续生产；
(3)酶的稳定性和最适温度提高，最适pH值改变，对温度和pH值适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶敏感性降低；
(4)酶反应条件容易控制；
(5)较水溶性酶更适合于多酶的反应；
(6)可以增加产物的收率，提高产物质量；
(7)酶的使用效率高，使用成本低；
(8)适于产业化、连续化、自动化生产[3]。
1.3  酶的固定方法
酶的固定方法很多，其中最常见的方法有吸附法，包埋法，结合法，交联法和热处理法等[4]。
吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。采用吸附法制备固定化酶或固定化菌体，操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用，但由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。
包埋法：将酶或者含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法[5]。包埋法制备固定化酶或固定化菌体时，根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类[6]。
结合法：选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定方法称结合法。根据结合的化学键不同，结合法可分为离子键结合法和共价键结合法[7][8]。用离子键结合法固定，条件温和，操作简便。只需要在一定的PH值，温度和离子强度等条件下。用共价键结合法制备的固定化酶，结合很牢固，酶不会脱落，可以连续使用较长时间。但载体活化的操作复杂，比较麻烦，同时由于共价结合时可能影响酶的空间构想而影响酶的催化活性。
交联法：借助双功能试剂使用酶分子之间交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不方便。
热处理法: 将含的酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到的固定化菌体。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不方便。
这5种常见的酶的固定方法各自有各自的优点和缺点，必要是可以结合其中的不同种方法进行固定，效果更佳。随着固定化酶技术的发展，越来越多的固定方法被用在了实验中，同时固定化的载体[14]也越来越多样化[9]。
1.4  固定化酶中应用的载体材料
固定化酶中应用的载体可分为有机高分子载体、无机载体和复合载体三大类。
1.4.1  有机高分子载体
有机高分子载体可以分为两类。
一类是天然高分子载体材料。此类材料一般无毒性，传质性能好，但强度较低，在厌氧条件下易被微生物分解，寿命短。常见的有琼脂、海藻酸钠等。近年来研究比较热门的新载体是甲壳素和壳聚糖及其衍生物、丝素膜(家蚕丝纤维)。另一类是合成有机高分子载体材料。一般来说强度大，但传质性能较差。这类材料种类很多，有聚乙烯 醇(PVA)冷冻胶、聚乙烯氧化物载体、Poly(EGDMA／AAm)共聚物珠状载体、无孔聚苯乙烯(PS)／聚苯乙烯磺酸钠(PNaSS)微球载体、PF(Phenolic—formaldehyde resins)凝胶载体、球状纤维素单宁树脂和多孔醋酸纤维素球形载体等。
1.4.2  无机载体材料
无机载体材料具有一些有机材料不具备的优点，如稳定性好、机械强度高、对微生物无毒性，不易被微生物分解，耐酸碱，成本低，寿命长等。目前，对无机载体加以修饰，使之与酶和细胞结合的技术取得了重大突破。在这方面，美国的环球石油(UOP)公司以氧化铝为载体，德国的Miles公司以二氧化硅为载体，制备固定化酶都取得了显著的成效。日本学者也采用了一种新型的商品名为(TN—M)的无机多孔陶瓷载体来固定假单胞菌的脂肪酶。固定化细胞用于啤酒生产中的应用在我国基本上还停留在实验阶段，这主要是因为载体一般都用海藻酸盐、卡拉胶等有机材料，存在固定化工艺复杂、耐腐蚀性差、易受压变形和无法再生等缺点。浙江大学的程江峰等选用了陶瓷拉西环为载体材料，在填充床反应器中进行啤酒连续快速发酵反应，取得了良好的效果。
1.4.3  复合载体材料
复合载体材料是以有机材料和无机材料复合组成的新载体材料。如磁性高分子微球，这是一种内部含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末，从而具有磁响应性的高分子微球。
1.5  固定化酶的应用和研究意义
1.5.1  固定化酶临床医药方面的应用
琼脂糖固定化牛胰核糖核酸酶能很好地催化合成重要的寡核苷酸。纤维素固定化胰蛋白酶的活力回收达57.5%、酶解半衰期达480h且能制备出符合质量标准的医用玻璃酸。前列腺素衍生物是2O世纪重要的药物发现之一，用大孔聚N—氨乙基丙烯酰胺固定化前列腺素合成酶并酶促合成前列腺素衍生物E1时，固定化酶显示出良好的贮存稳定性及活性。壳聚糖固定化胰蛋白酶制备具有多种药用价值的高比活抑肽酶已显示出工业化应用前景，微囊固定化过氧化氢酶具有良好的酶活性及稳定性，将在临床检测及卫生防疫方面具有广泛用途。药用酶可通过固定化提高稳定性及缓释性、并可除去免疫原性，甚至葡聚糖磁性毫微粒固定化L—天冬酰胺酶具有通过血液注射治疗急性淋巴白血病的医用前景。这些研究将为现代医学的发展提供强有力支持。
1.5.2  固定化酶在食品工业的应用
固定化酶在食品添加剂和配料中的应用。如：低聚果糖、天门冬氨酸、L-苹果酸、阿斯巴甜、酪蛋白磷脂肽（CPP）等。低聚果糖作为一种保健食品受到人们越来越多的重视，Jong[10]等用固定化酶生产低聚果糖，所用蔗糖浓度为600g／L，进料速率2.7h-1，反应温度50℃，30天后酶活性仅损失了8%，产率达到1174g／L.h。
固定化酶在乳制品中的应用。牛奶是人们熟悉的营养佳品，其中含有5％的乳糖。由于部分人体内缺乏乳糖分解酶(即乳糖酶或半乳糖酶)，饮用后会导致腹泻等症状，因此，无乳糖牛奶成为一种客观的需求。为了解决该问题，曾采用聚丙烯酰胺包埋法，将乳糖酶固定化后，于牛奶作用，去除乳糖。此外用固定化的乳糖酶处理后，可以防止其在冰激淋类产品中结晶，改善产品口感，提高产品品质。
固定化酶在油酯工业中的应用。脂肪酶可以催化酯交换、酯转移、水解等反应，所以在油酯工业中有广泛应用。1,3—特异性脂肪酶可酶促酯交换反应，将棕榈油改性为代可可酯。代可可酯是生产巧可力的原料，价格甚高，而棕榈油价廉，因此该工艺受到重视。Blooner等用脂肪酶将棕榈油转化成代可酯，Goto等用表面活性剂处理固定化酶，使酶活性大幅度提高，并延长固定化酶的寿命。
固定化酶在果汁中的应用。柑橘类产品加工中出现苦味是柑橘加工中的重要问题。造成苦味的物质有两类：一类为柠檬苦素的二萜烯二内酯化合物(A环和B环)；另一类为果实中的黄酮苷。脱苦的方法主要有吸附法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物质，而固定化酶法主要是利用不同酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物质。
固定化酶在茶叶加工中的应用。茶饮料质量的提高一方面是通过去除异味，提高适口性；另一方面是提高营养价值，提高人体对有益成分的吸收率。目前，固定化酶法已经开始应用于茶饮料中，并从上述两方面均取得了良好的效果。比如：固定化的单宁酶和果胶酶[11]。单宁酶是一种水解酶，可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚酸键。将单宁酶应用于茶叶饮料可以改善茶饮料的品质。
1.5.3  固定化酶在生物感应器中的应用
利用活蚕液状丝素蛋白的变性作用制备的葡萄糖氧化酶传感器具有酶活性损失小、稳定性高、响应速率快及使用寿命长等优点。葡萄糖氧化酶被固定化在纳米微带金电极上可得能用于活体检测的微型生物传感器；聚吡咯固定化脲酶传感器在脲浓度为(5.0×10～1.0×10)tool范围内具有良好的电化学响应性。自动化及连续化快速检测是生物传感器的临床检测特点，但酶电极的制备较复杂且需专用仪器配套方可。当用烷基胺玻璃珠固定化葡萄糖氧化酶测定血糖时，则可用普通分光光度计于520nm处，方便测定其回收率、直线性及精度等皆达到实用要求，且多次重复使用6个月以上仍有8O的保留活力。这些结果表明生物学及生物工程、医学及生命科学仍是固定化酶应用的重要场合。
1.5.4 固定化酶在化工领域的应用
    水解蛋白酶固定化后可用于肽及有机化合物的酶促合，如硅藻土固定化木瓜蛋白酶可在乙酸乙酯介质中催化合成Leu—脑啡肽前体Boc—Phe—Leu—OMe，产率高达9O%以上；固定化嗜热菌蛋白酶可高产率及专一性催化合成高甜度低热量的二肽甜味剂Aspartame的前体Z—L—Asp—I—Phe—OMe，并可同时实现天冬甜精的生物合成与DL-苯丙氨酸甲酯的光学拆分[12]。通过反相悬浮聚合制备的聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体可直接用于洗涤剂制备、且具有潜在的应用前景。脂肪酶既能催化天然油脂及酯类的水解，也能在有机介质中催化酯的合成、交换、氨解及肽合成而具有重要工业价值，故固定化脂肪酶的研究颇受重视。固定化酶在化学及化工领域中的应用研究也是人们感兴趣的课题，通过反相悬浮聚合制备的聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体可直接用于洗涤剂制备，且具有潜在的应用前景。
固定化酶在各领域都起着不可替代的作用。而且固定化酶具有节省能源与资源，减少污染的 生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。该技术必定将成为21世纪酶工程研究的核心内容。
氨基酸是人体必不可少的营养物质。现代社会对氨基酸需求越来越大，因此迫切需要有新的生产工艺促进氨基酸生产业的发展才能满足人们日益增长的需要。固定化酶水解鱼蛋白技术的优点有2个：(1)没有污染，符合国家可持续发展的战略。(2)成本低，低成本获得高的利益。一方面，固定化酶可以重复使用，降低酶的成本。另一方面，小黄鱼的价格基本维持在7元左右，而氨基酸的价格处于空白阶段，从黄鱼中水解得到的氨基酸具有很好的营养价值且有很高的应用价值可用于各种高档营养品的生产等。我相信将固定化中性蛋白酶（木瓜蛋白酶）水解鱼蛋白用于生产氨基酸，可以大大提高氨基酸的产量，并获得很高的利润。

2  实验部分
2.1  实验材料
中性蛋白酶（AR）：江苏无锡天达酶制剂有限公司
海藻酸钠（AR）：中国医学上海化学试剂公司
甲醛（AR）：中国浙江衢州巨化试剂有限公司
无水氯化钙（AR）：衢州巨化试剂有限公司
氢氧化钠（AR）：杭州萧山试剂厂
其他试剂均为常规试剂
2.2  实验仪器
G0-5003B型搅拌机：广东省中山市吾尔电器有限公司
SW-CJ-1B型单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司
立式压力蒸汽灭菌锅 YXQ-LS-30SI：上海博迅有限公司医疗设备厂
DHZ-DA型 200341615 摇床：江苏太仓实验设备厂
双层铁皮电炉：浙江嘉兴市风桥电热器厂霉菌培养箱 MJX-250B-Z型
上海博迅有限公司医疗设备
2.3  测量方法
2.3.1  氨基酸含量的测定：双指示剂甲醛滴定法
精确吸取10mL样品水解液用于氨基氮测定，先吸取水解液10mL放入两个100mL三角瓶中，再分别加入蒸馏水80mL及1%酚酞指示剂3滴，用NaOH标准溶液滴定至刚显粉红色，所耗用的NaOH标准溶液毫升数即为应去除的总酸滴定数。然后吸取甲醛10mL加入其中，摇匀，立即用NaOH标准溶液滴定至鲜红色为止（以最后滴下一滴NaOH标准溶液与液面接触时，颜色基本上与溶液的颜色一致），记下加入甲醛后消耗的总NaOH体积(V)，同时做空白实验，用蒸馏水代替样品液在同一个条件下作空白滴定，记下所耗的NaOH标准溶液的毫升数（V1）。
      氨基酸氮（g/100mL）=
      式中V—加甲醛后耗用的NaOH标准溶液毫升数
          V1—空白滴定耗用的NaOH标准溶液毫升数
          N—所用NaOH标准溶液的当量浓度
          0.014—氨的毫克当量
          10—吸取样品10mL
2.3.2  NaOH标准溶液的标定：草酸标定法
    把洗干净的碱式滴定管用少量NaOH溶液洗三遍, 再将NaOH溶液装入滴定管中,赶走橡皮管和尖嘴部分的气泡,调整管内液面的位置恰好为“0.00”。
用已洗净且用标准草酸溶液润洗过三遍的移液管准确量取20.00ml标准草酸溶液，加入锥形瓶中,加入2-3滴酚酞指示剂，摇匀。将NaOH溶液滴入锥形瓶中，边滴边摇动，开始时，滴定速度可快一点，当接近终点，粉红色消失较慢时，开始逐滴加入碱液，每加入一滴都应摇匀，观察红色是否消失，决定是否再滴加，最后应控制加入半滴碱液,并用洗瓶冲洗锥瓶内壁，摇匀，30秒钟内粉红色不消失，即认为已达终点，记下滴定管液面的位置。
另取两份20.00 ml标准草酸溶液，再用NaOH溶液滴定，要求三次所用的碱液量相差不超过0.05ml。
滴定过程应注意：
    (1)滴定完毕后，尖嘴外不应留有液滴, 尖嘴内不应留有气泡。
(2)由于空气中CO2影响，已达终点的溶液放久后仍会褪色，这并不说明中和反应停止。
2.4  标准草酸的制备
用电子天平准确称取1.575g无水草酸，准确定容到250ml，配成0.05mol/L的草酸溶液，用来标定NaOH标准溶液的准确浓度。

2.5  实验流程
酶

海藻酸钠溶液固定化酶

鲜带鱼前处理称量吸干鱼糜调节pH酶解过滤滤液烘干
图1  固定化酶水解黄鱼蛋白的工艺流程
2.5.1  前处理
将新鲜的鱼去头、去鳍、去内脏和去刺。把多余的鱼肉放入冰箱冷藏，防止变质降低蛋白质的含量。
2.5.2  称量和制成鱼糜
称取的时候要必须注意擦净鱼身上残余的水分，由于实验过程所用的鱼量很少，水所引起的误差会比较大。将鱼切成小块并尽可能的剁碎，将剁碎的鱼肉量移入轧汁机内搅成鱼糜，将鱼糜转移进500ml的锥型瓶中，量取一定量的水（如200ml）。将水分2次倒入装有鱼的锥型瓶中，适当调整好2次用水的量保持加水的总量不变。将鱼糜尽量的冲到锥型瓶中，把固定好的酶放入装有鱼糜的锥型瓶中并摇匀。
2.5.3  pH的调节
测量鱼糜的pH值，并将水解液的pH调到7（根据酶的种类而定）。
2.5.4  酶的固定化
配制100ml的浓度为4%的海藻酸钠。将实验所需的酶缓慢加入海藻酸钠中，并不断搅拌使酶均匀的溶解在海藻酸钠中。由于酶颗粒很小且海藻酸钠的黏度很高会，如不及时搅拌均匀酶在海藻酸钠中不能很好的溶解，会影响酶的固定导致固定化酶的催化能力降低。最后将加了酶的海藻酸钠溶液滴入装备好的浓度为5%的CaCL2中进行固定（如图2）。固定后用无菌水冲洗固定化酶颗粒上残留CaCL2溶液保持酶的纯度。
 
图2  酶的固定化装置图
2.5.5  酶解和过滤，烘干
塞好装有鱼糜的锥型瓶口，用油纸包好防止蒸发失水。最后将准备好的鱼糜放入摇床中，调节好摇床的温度和转速。酶解数小时取出，过滤出反应残留的溶液中的酶，用无菌水把酶冲洗干净，放入锥形瓶中下次实验可以继续用。余下的含氨基酸的溶液放入75℃的烘箱中烘干24h左右取出用电子天平准确称量产品的重量。
2.5.6  测定氨基酸氮的含量
用双指示剂甲醛滴定法测量氨基酸氮的含量[13]。

3  结果与讨论
3.1  单因素对水解反应的影响
固定化酶催化水解反应中有很多因素影响反应的进行，各因素之间也存在着相互影响。且每个因素对固定化酶水解的影响也各不相同。其中水解的PH值、温度、酶浓度、水解时间和底物浓度影响最大，为了更好的设定影响反应的条件，为此对以上单因素进行实验分析。但考虑到如对料水比进行实验分析，将会大大的增加实验的工作量，但由于时间的限制，不可能完成任务。根据资料所提供的信息暂把料水比定为1：2。

3.1.1  反应体系pH值对水解反应的影响
水解液的pH值对固定化酶的水解的影响较大。是影响酶催化效率的几个最主要的因素之一，改变水解液的pH将直接影响酶的活力。实验 中各因素分别设定为：料水比为
1：2时，酶浓度为1.5%，温度为50℃，水解时间为5h时，摇床转速=100r/min，pH值对水解出氨基酸量的影响如图3所示。  
         
图3  pH对固定化中性蛋白酶水解的影响

由图3可知，当水解液的pH值为7的时候，水解出的氨基酸的量最大，水解效果最好。产生这种现象的原因是由于pH值对固定化的中性蛋白酶的抑制作用，表现为溶液中的氢离子改变了固定化酶和底物的带电状态，影响了他们的结合。在pH值为7时酶的活性最大，催化能力最大，所以水解效果也最好。
3.1.2  反应温度对水解反应的影响
    温度同样是影响酶催化效率的几个最主要的因素之一，改变水解温度也会改变酶的水解效率。实验中各因素分别设定为：料水比为1：2，酶浓度为1.5%，pH值为7，水解时间为5h，摇床转速=100r/min，温度对水解出氨基酸的量的影响如图4所示。
 
图4  温度对固定化中性蛋白酶水解的影响
由图4可知，当水解温度为50℃的时候，水解出的氨基酸的量最大，水解效果最好。温度对酶的水解影响比较大，温度低时，随着温度的升高，水解反应速度逐渐加快，但伴随着温度继续升高，在水解速度加快的同时，酶逐渐变性而失去活力，产物生成的速度反而下降，如图4可以看出，固定化中性蛋白酶水解黄鱼的最佳水解温度在50℃。
3.1.3  酶浓度对黄鱼水解的影响
    在一定的范围内，酶的水解效率随着浓度的增大而增高。实验中各因素分别设定为：料水比1：2时，pH值为7，水解时间为5h，温度为50℃，摇床转速=100 r/min，酶浓度对水解出氨基酸量的影响如图5所示。
 
图5  酶浓度对鱼蛋白水解的影响
由图5可知，随着浓度的增加，酶解的速度加快，1.5%以后水解上升变的缓慢。由于酶的价格一般比较昂贵，考虑到经济效益，在实际操作中不可能增加酶的量来提高水解效率。选择1.5%的酶浓度比较合适。
3.1.4  水解时间对酶的影响
一般情况下，水解时间越长水解出的氨基酸含量也会越多，但是实际操作中不可能无限的增长水解的时间，同时固定化酶半衰期并不是很长，延长时间将影响酶的使用次数。确定合适的水解时间是实际生产中一个很重要的环节。实验中各因素分别设定为：料水比为1：2时，酶浓度为1.5%，pH值为7，温度为50℃，摇床转速=100 r/min，水解时间对水解出氨基酸的量的影响如图6所示。
 
图6  时间对鱼蛋白水解的影响
由图6可知，随着时间的增长，水解出的氨基酸的量逐渐增加，5h以后水解出的氨基酸的量增加趋势趋于平稳。主要原因与固定化酶的活力和产物的抑制有关。酶的活力随着时间的延长活力逐渐减小，而且随着产物的增加，产物的抑制作用越来越大。因此把水解时间定为5h。
3.2  正交实验确定固定化酶水解黄鱼的最佳条件
影响固定化酶水解黄鱼的各个因素并不是孤立的发生作用，它们之间存在着相互作用。而且所有因素是共同对酶水解产生影响。为了确定固定化酶水解黄鱼的最佳反应条件，设定了4个主要影响因素即：酶浓度，水解温度，反应时间，溶液PH值。采用正交实验设定4个因素3个水平，采用L9（34）正交表，所选条件见表1，实验结果见表2。
表1 正交实验各因素与水平的设定
因素/水平 酶浓度 水解温度/℃ 反应时间/h 溶液PH
1
2
3 1
1.5
2 45
50
55 4
5
6 6.5
7
7.5

表2 正交实验的结果
      A      B     C     D 氨基酸
序号   酶浓度/% 水解温度/℃ 反应时间/h 溶液PH 氮含量
   1     1     1     1     1   60.1
   2     1     2     2     2    84.3
   3     1     3     3     3   62.3
   4     2     1     2     3   83.3
   5     2     2     3     1   88.4
   6     2     3     1     2   84.6
   7      3     1     3     2   86.1
   8     3     2     1     3   73.5
   9     3     3     2     1   83.5
   K1     68.9     76.5     72.7     77.3  
   K2     85.4     82.1     83.7     85.0  
   K3     81.0     75.8     78.9     73.0  
   R     16.5     6.3     11.0     12.0  
由表2可知，在固定化酶水解黄鱼的实验中，实验所选的这4个水解因素影响程度为：A>D>C>B.得出的最佳反应条件A2B2C2D2。即酶浓度为1.5%，水解温度为50℃，反应时间为5h，pH为7的时，固定化中性蛋白酶水解黄鱼蛋白的效果最好。
3.3  固定化蛋白酶重复使用次数的实验
    固定化酶与游离酶相比，最大的优势是固定化酶能重复使用几次，而游历酶只能使用一次。固定化酶的使用次数越多，节约的成本就越多。因此有必要对固定化酶的使用次数进行测定。
实验中各因素分别设定为：料水比为1：2，酶浓度为1.5%，pH值为7，温度为50℃，摇床转速=100r/min，水解时间为5h时，水解出的氨基酸的量随固定化酶的使用次数的变化如表3所示。

表3 固定化酶水解次数对水解的影响
实验数     1 2 3 4         5 6 7 8
氨基氮含量  103.1 102.5  102.1  101.5  102.3  103.5   104.1    104.6
由表3可知，固定化中性蛋白酶在前面4次的实验中，催化效率逐渐降低，原因是由于固定化酶在使用过成中有损伤，从第5次开始催化效率增高是由于固定化酶在使用中部分破碎，酶与底物的接触面增大，催化效率有所上升。经过8次实验以后，固定化酶完全破裂，酶与底物不能再进行分离，放弃本次使用的酶。
3.4  固定化酶与游离酶活性的比较实验
酶在固定化后，会影响酶的活性，如果酶的活性降低太大，固定化酶将失去意义。将等量固定化酶和游离态酶在相同的条件下，同时酶解黄鱼，比较两者对黄鱼水解状况。
    实验中各因素分别设定为：料水比为1：2，酶浓度为1.5%，pH值为7，温度为50℃，摇床转速=100 r/min，水解时间为5h，固定化中性蛋白酶和游离态中性蛋白酶水解黄鱼所得氨基酸氮的含量如表4所示。
表4 两种形态酶水解出氨基酸氮的量（mg/100ml）
    酶的形态 氨基酸氮的量
固定酶                   102.5           101.2 99.8 98.5
游离酶 128.5 129.0 131.5 133.2
由表4可知，游离态酶在催化活力要比固定化酶要高。原因主要是由于固定化酶经海藻酸钠在固定后，部分酶被固定剂包埋在海藻酸钠中，阻止了酶与底物的接触，导致酶的活性一定程度的降低。

3.5  比较固定化中性蛋白酶和固定化酸性蛋白酶活力差异
    由前面的实验可知采用固定化中性蛋白酶在水解的效果较好，采用固定化酸性蛋白酶是否具有同样的水解效果或有更好的效果？二者没有直接的联系，需要通过实验验证。
实验中各因素分别设定为：料水比为1：2，固定化酸性蛋白酶的酶浓度为1.5%，pH值为2.5，温度为50℃，摇床转速=100 r/min，水解时间为5h时，固定化酸性蛋白酶水解出的氨基酸氮的含量如表5所示。
表5 固定化酸性蛋白酶水解出氨基酸氮的含量（mg/100ml）
      鱼的种类    氨基酸氮的含 量  
        黄鱼        26.3         29.3         28.1        27.5
从表5中可以明显的看出，采用固定化酸性蛋白酶水解黄鱼，在相同的条件下酸性蛋白酶水解出的氨基酸氮的含量远远少于固定化中性蛋白酶所水解出氨基酸氮的量。而且水解出的氨基酸经烘干后没有粘性，说明氨基酸含量很低。达不到水解的目的。实验表明：水解黄鱼的实验中，在相同的条件下，固定化中性蛋白酶的活力比固定化酸性蛋白酶的活力要强。

4  总结与展望
固定化技术是一项新技术，固定化酶与游离酶相比有许多优点，首先固定化酶具有可重复使用的特点克服了游离酶只能使用一次的弊端，而且固定化酶无污染和低成本适用于工业化大规模生产。因此这项技术从60年代开始就倍受人们关注，现在固定化技术正广泛应用于医疗，食品，化工等各大重要领域并起着无可替代的作用。经过了前人的努力，这项技术在酶的固定方法和载体的选择方面都有很大的进展。
我所做的研究主要是采用的是包埋法固定蛋白酶，并将固定化酶用于水解黄鱼，初步确定固定化酶水解黄鱼的最适条件。
论文主要介绍了实验过程中所用到的材料和实验仪器，并详细介绍了实验过程中所采用的测量氨基酸含量的方法和NaOH的标定方法，以及酶的固定方法，实验的流程，具体操作以及整个工艺过程。
    实验过程中，主要采用单因素实验确立了酶解过程的主要影响因素，并采用正交实验的方法确立了水解的最佳条件为：酶浓度1.5%，水解温度50℃，水解时间5h和pH为7。还通过一系列对比实验，得出以下结论：酶在经过包埋以后活力会下降而且下降幅度较大；固定化酸性蛋白酶不适用水解黄鱼。最后还通过实验得知酶的使用次数至少可以达到8次以上。
    本实验相关文献几乎没有，是一次探索性实验。通过实验初步确立了实验水解的最佳条件，但不能排除还有其他的因素的作用。而且实验结果表明：固定化酶在使用过程中酶活力和游离酶相比还有很大的差距。如何改变固定方法或水解过程以提高固定化酶的活力，提高固定化酶的使用次数成了至关重要的内容。将实验成果用于实际中还有很长的路要走，然而这项技术一旦趋于完善，固定化技术将带来氨基酸产业新的突破，大大提高氨基酸的产率弥补氨基酸产量不足的现状。

致  谢
   首先感谢我的恩师王克明老师在学习上对我的谆谆教导，在工作上对我的支持和帮助。王克明老师在承担繁忙的教学工作和科学研究的同时，仍然对我们的实验进行细心的指导并给予了很大的帮助。本文的选题，资料的收集，实验的开展和论文的修改都凝聚了导师的心血。
    恩师王克明教授严谨的治学态度、明锐的科学洞察力、和兢兢业业的工作作风是我学习榜样。同时恩师的言行也让我明白了很多做人的道理，在人生的道路上，导师的言行就 像我生命中的一盏明灯。
    在此还要由衷的感谢我的搭档毛敏、程慧和朱伟三位同学，在整个实验过程中，他们给了我很多帮助和鼓励，让我可以顺利的完成实验和毕业论文。如果没有他们的共同努力也就没有我现在所取得的成绩。
还要感谢浙江科技学院生化系的所有老师和同学，谢谢你们一直以来对我无微不至的关怀和帮助，是你们让我体会到团结的力量和人与人之间情感的温馨。大学四年来，在所有老师和同学的共同努力下，为我们创造了一个很好的学习和生活的环境。在这样的环境中，我学到不仅仅是科学知识同时还学会了如何做人。可以说这四年学到的可能以后花四十年都无法学会的东西。
此外，还要感谢我的爸爸、妈妈。谢谢你们对我的养育之情。在我最需要帮助的时候总是能得到你们的支持和帮助。
再一次感谢！感谢所有关心我和帮助过我的人！

                                                            程斌
                                                       2007年6月17日

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