高产SOD菌株HB25的发酵条件的前提分析和探讨

1．绪论
1.1 SOD的种类及分布
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutise）简称SOD，是一种普遍存在于生物体的金属酶。1938年Mannt和Kelin在进行牛血红细胞的分级分离时，发现一种淡蓝色的含铜蛋白，命名为血球铜蛋白，但当时对其生理功能并不了解。1968年Fridovich发现超氧阴离子能使细胞色素C的还原受到一种蛋白因子的抑制，1969年Mccord和 Fridovich[1]发现该抑制因子与血铜蛋白活性相同，因其能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应由此更名为超氧化物歧化酶。后来又发现，该酶不仅含铜而且含锌，即Cu/ZnSOD，随后有人又发现另外两类SOD：Fe-SOD和Mn-SOD。最近Kim等发现在链霉菌天蓝菌（Streptomyces Coelicolor Muller）中还存在新的SOD：Ni-SOD，Fe/Zn-SOD[2]。另据文献报道，在哺乳动物的细胞外液中发现一种分子量高达13万对氰化物敏感且具有SOD活性的因子，称胞外SOD：EC-SOD，该因子对清除细胞外液中的超氧阴离子起着重要作用[3]。
超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，因此它对热，PH，蛋白酶及某些理化性质表现出异常的稳定性，是迄今发现的最稳定的球蛋白之一。根据其结合的金属离子的不同，主要分为Cu/ZnSOD，Fe-SOD和Mn-SOD，三者的理化性质也各不相同。
Cu/ZnSOD:呈蓝绿色，主要存在于真核细胞的细胞质中，分子量为32000/65000，分子结构为二或四聚体，构象多为-折叠，特征吸收峰为260nm/680nm。金属含量为每分子中含有2个Cu原子和2个Zn原子[4]。研究表明Cu与Zn的作用是不同的，Cu与催化活性有关，透析去除Cu则酶活性全部丧失，重新加入后其活性又可以重新恢复；而Zn对维持酶分子结构的完整性有着重要的作用，一旦与Zn结合的组氨酸和天冬氨酸被丙氨酸取代，则酶的折叠结构及完整性遭到破坏[5]。此类酶抑制剂为 CN-和H2O2+EDTA，目前我国开发的SOD大部分是此类[6]。
Mn-SOD:呈紫红色，主要存在于原核细胞及真核细胞的线粒体中，分子量为42000/85000，分子结构为二或四聚体。任何生物来源的Mn-SOD的一级结构的同一性都很高，且均不同于Cu/ZnSOD的序列，构型多为-螺旋，Mn不仅对蛋白质结构有稳定作用，而且与其活力直接相关。Mn-SOD的结构特征是含有较多的色氨酸和酪氨酸，因此紫外吸收光谱类似一般的蛋白质，在280nm附近有最大吸收峰，可见吸收光谱在475nm附近有最大吸收。Mn-SOD对乙醇-氯仿溶液敏感，对氰化物不敏感，可以借此与Cu/ZnSOD和Fe-SOD相区分[7]。 Mn-SOD在动物的不同组织中含量不同，肝脏含量最高，其次是心脏，肾上腺和胰脏[8]。
Fe-SOD:呈黄褐色，主要存在于原核细胞及少数植物中，分子量为42000/85000，分子结构为二或四聚体，构象多为-螺旋，特征吸收峰为280nm，Fe-SOD对R（N3），H2O2+EDTA敏感[9]。不同来源的Fe-SOD和Mn-SOD具有相似的物理化学性质及同源性，因此推测它们可能由同一原始酶进化而来，而不同来源的Cu/ZnSOD具有较高的同源性，它们可能由另一原始酶进化而来[10]。我国目前研究的Fe-SOD有菠菜，螺旋藻，棕色固氮菌，伤寒沙门菌等。
1.2 SOD的催化机理及活性中心
生物体内的自由基来源有外源和内源两类。外源性自由基产生的主要原因是物理或化学的原因，内源性自由基的产生主要是由体内代谢反应产生。一般说来，内源性自由基主要是指氧自由基及其活性衍生物。氧自由基是一类非常活跃的不稳定的代谢产物，能使一些重要的生物分子包括蛋白质，类脂和核酸发生突变。所有SOD同工酶共同的生物学作用都是催化超氧阴离子自由基O2-,歧化为H2O2和O2，从而阻止其在需氧生物体内积聚和阻遏其通过Hales sweiss反应产生•OH，其反应式如图1-1：

      图1.1  生物体内的抗氧化酶体系
CAT：过氧化氢酶（Fe）    GSH：还原型谷胱甘肽
GSSG：氧化型谷胱甘肽     GSH-PX：谷胱甘肽过氧化物酶（Se）
可见，SOD是机体内的唯一以O2-为底物的酶，是人体防御自由基的第一道屏障，它可以使氧自由基产生歧化反应，维持细胞内氧自由基处于无害水平，是进行需氧代谢的生物维持生存所必需的酶[11]。
    三种类型SOD的活性中心都含有金属离子。Cu/ZnSOD的活性中心形态象一个椭园形的口袋，口袋底部的Cu与4个His和一个Asp配位，Cu和Zn之间通过共同连接1个His而构成咪唑桥结构，底物O2- 就结合于口袋之中。Mn-SOD和Fe-SOD的活性中心的金属离子与3个His，1个Asp和H2O配位。三类SOD的活性中心均含有金属离子，His，Asp和H2O，可见它们均与催化功能密切相关[9]。
1.3 SOD的主要应用
1.3.1 SOD在人体防御系统中的地位
现已证实，氧来源的自由基在炎症机制中起着十分重要的作用，并与人的许多疾病有关。人体有许多防御自由基链反应的体系，自由基O2-，H2O2和自由基•OH相继由血液中的三种酶所代谢，它们是SOD，谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转移酶。这些酶在血浆中的水平与它们作为自由基代谢者的重要程度相一致，在正常健康人血液中的含量SOD为90mg/L，谷胱甘肽过氧化物酶为9mg/L，谷胱甘肽转移酶为1mg/L，可见SOD之重要性。当O2-产生过多或酶浓度降低时，一些超氧自由基就会逃脱酶的歧化作用而引起疾病，给以外源性的SOD可有效地清除过量的超氧自由基[12]。
1.3.2 SOD在医药上的应用
1.3.2.1 SOD与衰老的相关性
有关衰老的学说有很多，它们全都与自由基有关联，Harman[13]最早提出衰老与自由基有关，有生理情况下，机体内产生的少量的氧自由基能被体内的抗氧化酶或抗氧化剂迅速清除，一般不会产生细胞损伤作用。但随着年龄的增长，由于抗氧化酶活性不断下降，体内产生的过量氧自由基无法得到及时清除，以至大量的O2。—迅速与机体内的核酸，蛋白质，氨基酸和脂质等产生反应生成氧化物或过氧化物。生物膜中不饱和脂肪酸被氧化生成过氧化物时，可使细胞膜的通透性改变，线粒体，微粒体膜膨胀破裂造成细胞代谢和功能形态的改变，从而引起细胞的衰老和死亡；脂质过氧化作用，能使结缔组织中的胶原蛋白产生交联而收缩，使皮肤发皱，酶活力降低，蛋白质变性；过氧化脂质与蛋白质发生交联形成脂褐素，沉积于脑，心肌，肾上腺，肝肾等细胞内，加速细胞乃至整个机体的衰老进程。此外许多衰老学说都提到细胞DNA或基因的损伤是导致衰老的原因，DNA受到活性氧的攻击后产生8-羟基去氧鸟嘌呤核苷，该物质的含量越低，人 的寿命也越高[14]。因此SOD在抗衰老中起着重要作用。
1.3.2.2 SOD与肿瘤的相关性
Szent-Guorgyi早就指出只有需氧的高级生物才患癌，因此癌与氧之间必有某种关系，现已发现癌变的两个阶段（诱癌与促癌）都有氧自由基的参与，致癌物质必须经过代谢，经物理化学因素作用使之成为自由基后才致癌[15-16]。生成自由基的能力与致癌能力之间有平行关系，无论致癌或抗癌，其分子基础都是相同的，即自由基使DNA损伤，改变了细胞原有的状态，就会产生致癌或抗癌的结果。1975年Dionst[17]等在活体中第一次发现肝癌线粒体中不含SOD，后来还有人发现白血病细胞，小鼠C3，乳腺癌，S91黑色素瘤均无Mn-SOD。1981年瑞典Marklund发现各种癌Mn-SOD含量均小于相应的正常器官。总之，癌细胞特有的普遍性规律为无论自发的，移植的，病毒引起的离体或在体的癌细胞中Mn—SOD均有缺失或极少，几乎任何癌的Mn-SOD都明显低于正常，因此测定Mn-SOD的水平对癌症的早期诊断有重要的临床价值；而Cu-SOD，Zn-SOD含量在一些癌细胞中也有减少。
1.3.2.3 SOD的临床应用
（1）治疗缺血再灌流综合症：缺血缺氧是临床常见的一种病理过程，近年研究证明，急性缺氧造成的损伤，主要不是发生在缺血的当时，而是发生在再灌流的一瞬间，此时出现的系列症状称为再灌流综合症。越来越多的研究表明，缺血再灌流时会产生大量氧自由基尤其是超氧阴离子自由基，过量的自由基会导致组织损伤，这种缺血再灌流现象不仅见于心脏，也见于小肠，肾，肝等器官保存和移植，以及断肢再植，整形和美容等手术过程。SOD是氧自由基清除剂，可有效防治综合症的出现，美国Chiron公司和日本化药公司等已进入II期临床，我国这方面研究已进入实用阶段[18]。
（2）治疗氧中毒：人体氧中毒有三种表现：肺型氧中毒，神经型氧中毒和眼型氧中毒。氧中毒中最常见为急性肺气肿，组织内过多的氧会增加亚细胞器产生O2-，并抑制了细胞对氧自由基的防卫功能，致使细胞损伤或死亡。治疗肺气肿最好将SOD制成喷雾剂，直接吸入肺部[19]。
（3）治疗自身免疫性疾病；各种类型的自身免疫性疾病的发病机理虽都有各自的特点，但超氧阴离子自由基，前列腺素以及由巨噬细胞，白细胞产生出来的水解酶类在病变上起着重要作用，动物实验已证实SOD和其它一些氧自由基清除剂能抑制自身免疫性疾病的慢性发病过程，给予外源性SOD都可减轻或延缓这些疾病，也可治愈某些疾病[20]。
（4）治疗和防止老年性白内障的形成：白内障是老年人较普通的眼疾之一。人衰老时活性氧自由基在眼内积累增多，引起眼内酶及膜蛋白氧化及晶体蛋白过氧化，脂质过氧化物产物丙二醛与晶体蛋白交联形成白内障，故用SOD等抗氧酶能有效防止和治疗白内障[21]。
（5）治疗炎症：临床上用SOD治疗炎症取得了满意的效果，且SOD不会损伤软骨组织，比类固醇类药物更佳[22]。
SOD还可用于治疗一些皮肤病，如银屑病，皮炎，射线光致敏皮肤病[23]。
1.3.3 SOD在化妆品中的应用
作为化妆品的添加剂是SOD的另一个重要应用，该应用大大促进了我国SOD的生产。SOD添加于化妆品中可起到以下四方面的作用：有明显的防晒效果，光照使皮肤变黑的主要原因是氧自由基损害，SOD可有效防止皮肤受电离辐射（特别是紫外线）的损伤，从而起到防晒效果；SOD作为抗氧酶，能有效防止皮肤衰老，祛斑，抗皱；有明显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定疗效；具有一定的防治瘢痕形成的作用[24]。
国内外不少化妆品中都添加有SOD，可制成面膜等形式的化妆品，作为SOD化妆品，每1克基质中SOD的活性不应低于100u，添加的SOD的纯度不应低于3000u/mg蛋白[25]。
1.3.4 SOD在食品工业中的应用
SOD在食品工业中的应用也是其应用的一个重要方面，主要包括以下四个方面：作为保健食品的功效因子或食品营养强化剂，目前已有添加SOD的蛋黄酱，牛奶，可溶性咖啡，果汁饮料，酸牛奶，冷饮等类型的保健食品面市；制成多种剂型的SOD或复合型食品，已有SOD胶囊，片剂，口服液，脂质体，颗粒剂等形式的SOD保健食品；用作抗氧剂，与其它抗氧剂一样，SOD可作为罐头食品，果汁，等的抗氧剂，防止过氧化酶引起的食品变质及腐败现象，此外，还可作为水果，蔬菜的保鲜剂；以富含SOD的原料加工制成保健食品，如大蒜饮料，刺梨SOD汁等。
尽管SOD在食品及化妆品方面得到了广泛的应用，但其口服有效性及其稳定性仍是研究的热点。SOD吸收机理研究表明，SOD口服后可能通过降解的外源SOD片段诱发内源SOD的产生和完整生物大分子的进入等途径使血红细胞中SOD活性升高[25]。通过SOD的化学修饰，可以增加其稳定性、延长半衰期、降低抗原性，所用的修饰剂包括聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、玻璃酸、环糊精、活性肝素等。此外SOD脂质体也在研究。
1.4 国内外研究概况
从SOD正式命名到现在的三十年间，一直是各学科共同关注的研究热点，国内外研究学者对其分子结构，理化性质，生理功能，应用基础理论及作用机理等方面进行了大量的研究，近几年每年都有上千篇论文发表，是2000多种酶中研究报导最多的一种[25]。
国外对SOD的研究起步较早，有关的研究论文，专利报道及成果很多。最初生产SOD的原料是动物血，由于原料来源有限，产品质量不稳定及安全性等问题，加之提纯SOD经典工艺工艺繁琐，操作困难，污染环境，得到的产品活力，纯度较低，因此近年来不少学者积极探索用微生物发酵法生产SOD。八十年代末，美国和日本先后开发了用发酵法生产SOD，大大降低了生产成本[26]。国外实践证明发酵法生产SOD是一条经济可行的途径[27]。 
 国内从80年代初开始对SOD的研究，目前从事SOD研究的单位很多，但在学科分布上偏重于动、植物细胞提取、纯化，有关微生物SOD的研究不多。北微所张博润等人从300多株不同种属的酵母菌中经初筛，单倍体分离，诱变杂交这一育种途径选育出一株SOD高产菌株ZDF-48，其细胞SOD含量为1350U/g湿菌体(325nm法)[28]，对其培养条件优化后，产量提高至2075U/g湿菌体[29]； 屠幼英等人筛选到一株嗜热细菌ATCC27634，其产生的Mn-SOD热稳定性较好，经纯化后，该酶比活力为2606.9u/mg(NBT光化还原法)[30]；沈阳农业大学迟乃玉等人从200多株不同种属的乳酸菌中筛选到一株SOD产量较高的菌株，经复合诱变，在优化培养条件下，SOD含量9100u/g湿菌体（NBT光化还原 法）[31]；华南理工大学张航等人采用固体发酵从少孢根霉RT-3胞外提取到SOD，虽活性不高，但其产酶方式可能为胞外产酶，从简化生产工艺，降低成本角度考虑，也是一条值得探索的途径[32]。
1.5 本项目的研究目的及意义    
鉴于超氧化物歧化酶独特的生物学功能及在医药，临床，食品及化妆品方面的广泛应用，近年来一直是各学科关注的热点，是2000多种酶类研究报道最多的一种。目前国外已有多种药用SOD应用于临床，国产药用SOD（以猪血红细胞为原料）也在研制报批阶段。目前应用的SOD主要以动物血液及脏器为原料，提取工艺复杂、成本较高，在应用中受到原料来源、收率、环境污染，产品安全性等因素的限制，特别是由于疯牛病的影响，欧盟规定从1997年1月开始，不准使用牛血SOD作为食品添加剂使用后，大力开发从微生物中提取超氧化物歧化酶成为很有前景的产业化方向。
微生物发酵法生产SOD具有成本低、周期短、易于规模化生产以及安全性高的特点，根据文献，真核微生物的SOD含量一般高于原核微生物，其中酵母菌含有丰富的线粒体，是细胞氧化还原的中心，菌体呼吸系统最完整，因而其SOD含量高于其它丝状真菌，因此可以作为SOD的主要生产菌种。本研究通过对经过初筛的产SOD的酵母菌菌株HB25培养条件、培养基组成等进行研究，优化其发酵条件。
 
2．实验部分
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
2.1.1.1 菌种：菌种HB25
2.1.1.2 培养基
斜面培养基：麦芽汁培养基
  种子培养基：葡萄糖1.0%，70Be麦芽汁10%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，pH5.5
    发酵培养基：葡萄糖2.0%，蛋白胨1.0%，酵母膏1.0%，pH5.5
2.1.1.3 主要仪器与设备
超净工作台：SW-CJ-IF型单人双面净化工作台，苏净集团制造
霉菌培养箱：MJX-250B-Z型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂    
电子天平：BS 224S型，北京赛多利斯系统有限公司
分光光度计：UV-2102 PC型，龙尼柯仪器公司
高压蒸汽灭菌锅 ：上海博迅实业有限公司医疗设备厂          
震荡培养箱：BS-ZEA型，国华电器有限公司
电炉：SX2-2.5-10型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂
恒温水浴锅：DKS-12型，嘉兴市中新医疗仪器有限公司
高速组织捣碎机：DS-1型，上海标本模型厂
恒温摇床：BS-ZEA型，太仓市实验设备厂
电热鼓风干燥箱：GZX-9023MBE型，通州市测量仪器仪表厂
旋转蒸发器：ZFQ 85A型，上海医械专机厂
循环水式真空泵：SHZ-P（Ⅲ）型，巩义市英峪予华仪器厂
手持糖量计：WYT-4型，泉州中友光学仪器有限公司
其它常规玻璃仪器如温度计、酒精计等
2.1.2  试验方法
2.1.2.1 培养方法
菌株经斜面培养基活化后，接一环于种子培养基于28C培养14h，以15%接种量接种于发酵培养基，28C摇床培养24小时，离心收集菌体；
2.1.2.2 生物量测定
培养结束后将发酵液以3000r/min离心10分钟，水洗菌体2次，收集湿菌体，称重。
2.1.2.3 SOD含量测定
以甲苯法破壁提取SOD粗酶液：采用甲苯破壁法破壁，每克酵母加入0.8ml甲苯，35℃破壁45min,以磷酸缓冲液（pH7.8,含0.1mmol/L EDTA）提取5h，4000r/min离心5min，分离出水相，10000r/min离心15min，收集上清液，此即粗提液。
用国标邻苯三酚法测定SOD酶活力。
2.1.2.4 SOD产量计算
生物量（g湿菌体/100ml） SOD含量（u/g湿菌体）
2.2 试验设计
2.2.1发酵工艺条件研究
利用正交试验法，对摇瓶装量、接种量、培养时间、初始pH 4种因素对生物量、SOD含量及SOD产量的影响进行了4因素3水平的正交试验L9（34），试验所选因素及水平见表1。
表1    正交试验因素水平的选取
水平 因素
 A装量（ml） B初始pH C接种量(%) D培养时间（h）
1 75 5.0 5% 16
2 100 5.5 10% 20
3 125 6.0 15% 24
2.2.2 培养基组成单因子条件试验
在正交试验基础上，对不同C源，N源，C/N及微量元素对生物量，SOD含量及SOD产量进行了研究，确定了最佳培养基组成
2.2.2.1不同C源对Strain HB25发酵产酶的影响
 选择7种不同的C源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、山梨醇、甘露醇、20%麦芽汁、葡萄糖+9%麦芽汁），浓度均为2%，麦芽汁浓度为体积比，研究C源对Strain HB25菌体生物量、SOD含量及产量的影响。
2.2.2.2 不同N源对Strain HB25发酵产酶的影响
 在上述试验基础上，确定碳源为9%麦芽汁（V/V）+2%葡萄糖，再选择6种不同的N源（蛋白胨、牛肉膏、(NH4)2SO4、NaNO3 、草酸铵、酒石酸铵），浓度均为1%，研究N源对Strain HB25菌体生物量、SOD含量及产量的影响。
2.2.2.3 不同C/N对Strain HB25发酵产酶的影响
 确定9%麦芽汁（V/V）+2%葡萄糖作为碳源，蛋白胨作为氮源，研究不同蛋白胨浓度（0.5%,1.0%,2%,3%,4%）对Strain HB25菌体生物量、SOD含量及产量的影响。
2.2.2.4 不同微量元素对Strain HB25发酵产酶的影响
 在发酵培养基中添加不同的微量元素（Cu,Zn,Fe,Mn），研究微量元素对Strain HB25菌体生物量、SOD含量及产量的影响。
2.2.2.5 不同浓度H2O2对Strain HB25发酵产酶的影响
发酵培养至20小时，加入不同浓度的H2O2，研究其对Strain HB25菌体生物量、SOD含量及产量的影响。
 
3．结果与讨论
3.1 发酵工艺条件实验结果
采用正交试验法，对摇瓶装量、接种量、培养时间、初始pH 4种因素对Strain HB25菌体生物量、SOD含量及SOD产量的影响进行了4因素3水平的正交试验L9（34）。图2为正交试验结果。
                 表2  正交试验结果
  A B C D 组 合 生物量
(g/100ml) SOD含量
(u/g湿菌体) SOD产量（u/100ml）
1 1 1 1 1 A1B1C1D1 2.75 1968 5412
2 1 2 2 2 A1B2C2D2 4.96 2004 9940
3 1 3 3 3 A1B3C3D3 5.24 1990 10428
4 2 1 2 3 A2B1C2D3 5.05 1930 9747
5 2 2 3 1 A2B2C3D1 3.02 1894 5720
6 2 3 1 2 A2B3C1D2 4.44 1902 8445
7 3 1 3 2 A3B1C3D2 4.65 1904 8854
8 3 2 1 3 A3B2C1D3 4.83 1866 9013
9 3 3 2 1 A3B3C1D1 2.87 1780 5109
生 k1
物 k2
量 k3
R   4.31 4.15 4.01 2.88  1=4.20 2=1915 3=8074
 4.17 4.27 4.29 4.68 DCAB   最佳组合A1B2C3D3

 4.11 4.18 4.30 5.04 
 0.2 0.12 0.29 2.16 
SODk1
含 k2
量 k3
R 1987 1934 1912 1881 
ADCB   最佳组合A1B1C3D2

 1909 1921 1904 1937 
 1850 1891 1929 1929 
 160 13 25 56 
SODk1
产 k2
量 k3
R  8592 8004 7623 5413 
DACB   最佳组合A1B2C3D3

 7970 8224 8265 9080 
 7659 7994 8334 9729 
 933 230 711 431 6 
综合生物量，SOD含量，SOD产量的极差分析结果，四个因素的最佳组合为：A1B2C3D3，即摇瓶装量75ml，初始pH5.5，接种量15%，培养时间24小时，可获得最高的SOD产量。此最优条件组合不在此次试验内，因此对其进行验证。结果如表3。
                   表3  最优组合条件对Strain HB25发酵产酶的影响
 生物量（g/100ml） SOD含量（U/g） SOD产量（U/100ml）
验证值（3次平均） 5.10 1976 1.01104

3.2 培养基组成单因子条件试验结果
在正交试验结果的基础上，确定了最佳发酵工艺条件后，研究培养基组成及微量元素的添加对Strain HB25菌体生物量、SOD含量及SOD产量的影响。
3.2.1 不同C源对Strain HB25发酵产酶的影响
7种浓度均为2%的不同C源对Strain HB25的影响结果见表4（麦芽汁浓度为体积比）。
表4 不同C源对Strain HB25发酵产酶的影响
 葡萄糖 蔗糖 乳糖 山梨醇 甘露醇 20%麦芽汁 葡萄糖+9%麦芽汁
生物量（g/100ml） 5.10 5.03 2.97 3.57 3.68 5.10 5.25
SOD含量
（u/g湿菌体） 1976 1742 1789 2176 1716 1911 2080
SOD产量（u/100ml） 10100 8762 5313 7768 6314 9746 10920
酵母菌能利用多种糖类作碳源，对糖浓度的适应范围也较广，但不同碳源其代谢产物不同。从表4可知，山梨醇作碳源，菌体SOD含量最高，而以葡萄糖+9%麦芽汁为复合碳源时，SOD产量最高，综合菌体生物量，SOD含量及产量，确定9%麦芽汁+2%葡萄糖为最佳C源。
3.2.2 不同N源对Strain HB25发酵产酶的影响
固定碳源为9%麦芽汁（V/V）+ 2%葡萄糖后，6种1%浓度的不同N源对菌体生物量、SOD含量及产量的影响结果如表5。
                      表5  不同N源对Strain HB25发酵产酶的影响          
 蛋白胨 牛肉膏 (NH4)2SO4 NaNO3 草酸铵 酒石酸铵
生物量（g/100ml） 5.25 2.71 2.93 3.85 2.70 2.88
SOD含量
（u/g湿菌体） 2080 1898 1898 822 1784 1056
SOD产量（u/100ml） 10920 5143 5561 3163 4815 3040
从表5可知，氮源对酵母菌SOD的含量影响较大，不同N源菌体SOD含量差异较大，有机氮源好于无机氮源，1%蛋白胨作为N源，其菌体生物量及SOD含量明显优于其它N源。
3.2.3 不同C/N对Strain HB25发酵产酶的影响
固定碳源浓度为2%，不同蛋白胨浓度（0.5%,1.0%,2%,3%,4%）对菌体生物量、SOD含量及产量的影响结果见表6。
表6  蛋白胨浓度对Strain HB25发酵产酶的影响
 0.5% 1.0% 2% 3% 4%
生物量（g/100ml） 3.91 5.25 5.29 5.1 4.11
SOD含量
（u/g湿菌体） 2119 2080 2208 2158 1790
SOD产量（u/100ml） 8285 10920 11680 11027 7357
由表6可知，在培养基中添加氮源有利于菌体生物量的增加，但当氮源浓度增加至1%后，SOD含量增加不大，而当氮源增至4%时，菌体生物量及SOD含量均又下降。因此选择适合的氮源（蛋白胨）浓度为2%，即C/N为1时，Strain HB25发酵产SOD产量最高。
3.2.4 不同微量元素对Strain HB25发酵产酶的影响
在发酵培养基中添加Cu、Zn、Fe、Mn四种微量元素，分别研究添加微量元素对菌体生物量、SOD含量及产量的影响，结果如表7。  
表 7  金属离子对Strain HB25发酵产酶的影响
 生物量
（g/100ml） SOD含量
（u/100ml） SOD产量
（u/g湿菌体）
对照组 5.29 2208 11680
CuSO4
75 mmol/ml 5.24 2501 13105
ZnSO4
25 mmol/ml 5.27 2451 12916
FeCl3
100 umol/ml 4.54 1578 7990
MnCl2
50 umol/ml 4.65 1784 8294
SOD为金属酶，金属辅基对SOD的合成及酶活性有十分重要的影响，微量的金属离子对菌体生物量也有一定的影响。由表7可知，培养基中添加75 mmol/ml CuSO4和25 mmol/ml ZnSO4对SOD的活力和产量有很大的提高，且不影响菌体的生长。而FeCl3 及MnCl2对菌体的生长及SOD的合成均有一定的抑制作用。
3.2.5 不同浓度H2O2对菌体Strain HB25发酵产酶影响
不同浓度的H2O2对菌体Strain HB25菌体生物量、SOD含量及产量的影响见表8。
表8  不同H2O2浓度对Strain HB25发酵产酶的影响
 0% 0.5% 1.0% 1.5%
生物量（g/100ml） 5.29 5.28 5.26 5.20
SOD含量（u/g湿菌体） 2520 2582 2662 2660
SOD产量（u/100ml） 13330 13632 14002 13832
表8可知，H2O2能刺激酵母细胞SOD含量上升，但过量的H2O2对菌体有毒害作用，因此选择H2O2终浓度为1%为宜。
3.3 优化培养条件的结果
通过以上培养条件的逐步优化，对Strain HB25发酵产酶的影响结果见表9。
表9 逐步优化培养条件对STRAIN HB25发酵产酶的影响
项目 生物量（g/100ml） SOD含量
（u/g湿菌体） SOD产量（u/100ml） 产量提高率  （%）
对照 3.76 1872 7038 
正交试验 5.10 1976 10078 43%
优化C源 5.25 2080 10920 55%
C/N 5.29 2208 11680 66%
微量元素 5.29 2520 13330 90%
1% H2O2 5.26 2662 14002 99%
3.4 小结
综上所述，初步确定酿酒酵母菌株HB25产SOD的培养优化条件为：培养基组成为葡萄糖2%，蛋白胨1%，麦芽汁9%（V/V），CuSO4 75mmol/ml，ZnSO4 25mmol/ml,pH5.5，摇瓶装量为75 ml/500 ml三角瓶，接种量为15%，28C培养20小时加H2O2至终浓度为1%，继续培养至24小时。在此条件下，细胞生物量为5.26g/100ml，SOD含量为2662u/g湿菌体，SOD产量为14002u/100ml，SOD产量较出发菌提高99%。

4．结论与展望

综上所述，初步确定酿酒酵母菌株HB25产SOD的培养优化条件为：培养基组成为葡萄糖2%，蛋白胨1%，麦芽汁9%（V/V），CuSO4 75mmol/ml，ZnSO4 25mmol/ml,pH5.5，摇瓶装量为75 ml/500 ml三角瓶，接种量为15%，28C培养20小时加H2O2至终浓度为1%，继续培养至24小时。在此条件下，细胞生物量为5.26g/100ml，SOD含量为2662u/g湿菌体，SOD产量为14002u/100ml，SOD产量较出发菌提高99%。
超氧化物歧化酶独特的生物学功能及在医药，临床，食品及化妆品方面的广泛应用，近年来一直是各学科关注的热点，是2000多种酶类研究报道最多的一种。目前国外已有多种药用SOD应用于临床，国产药用SOD（以猪血红细胞为原料）也在研制报批阶段。目前应用的SOD主要以动物血液及脏器为原料，提取工艺复杂、成本较高，在应用中受到原料来源、收率、环境污染，产品安全性等因素的限制，特别是由于疯牛病的影响，欧盟规定从1997年1月开始，不准使用牛血SOD作为食品添加剂。微生物发酵法生产SOD具有成本低、周期短、易于规模化生产以及安全性高的特点，根据文献，真核微生物的SOD含量一般高于原核微生物，其中酵母菌含有丰富的线粒体，是细胞氧化还原的中心，菌体呼吸系统最完整，因而其SOD含量高于其它 丝状真菌，因此可以作为SOD的主要生产菌种。本研究通过对经过初筛的产SOD的酵母菌菌株HB25培养条件、培养基组成等进行研究，优化其发酵条件。大力开发从微生物中提取超氧化物歧化酶成为很有前景的产业化方向
致谢

本研究及学位论文是在我的导师胡伟莲老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。她严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。她知识渊博、学术思想独到精辟、治学态度严谨、待人真诚，我从她身上学到了许多知识。我认识到做实验一定要有科学严谨的态度，认真分析真实的结果。作为一名即将迈入社会大门的毕业生，这种精神对我将来的人生都有很大的指导和启示作用。
从课题的选择到项目的最终完成，胡老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。在此，谨向胡老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意！
在论文进行过程中，得到了戴德慧老师的帮助，在此一并表示感谢！
    论文工作中，还要感谢林海洋、戴薇薇同学的大力支持，在此表示深深的谢意。

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