生物保鲜剂在明虾制品中的价值探讨
生物保鲜剂在明虾制品中的应用研究
学生姓名：陈 圆
（生物与化学工程学院 指导教师：袁秋萍）
摘 要：乳酸链球菌素(Nisin)是某些乳链球菌产生的一种多肽物质，是一种高效、无毒副作用的天然生物防腐剂。Nisin对大多数革兰氏阳性菌具有抑制作用，而对革兰氏阴性菌、酵母没有作用。聚赖氨酸是赖氨酸残基通过α羧基和ε氨基形成的酰胺键连接而成的短肽，具有抑菌谱广，水溶性好，安全性高，热稳定性好，抑菌PH范围广等优点。本次课题研究了乳酸链球菌素、聚赖氨酸对明虾制品防腐的作用效果，通过正交实验、感官评定和微生物分析等实验手段，全面研究了乳酸链球菌素、聚赖氨酸及相关因素对明虾制品的影响，找出了用乳酸链球菌素、聚赖氨酸保藏明虾制品的最佳工艺条件。
关键词：乳酸链球菌素；聚赖氨酸；抑菌；正交实验
Abstract: Nisin is antibacterial multipeptide produced by certain strain of lactococcus lactis. It is a high-efficiency and nonpoisonous effect natural biopreservative. Nisin is effective against Gram-positive bacterium, however, there is no effect on the inhibition of Gram-negative bacterium and yeast. Poly-lysine, a kind of a peptide polymerized by the amid e bond between α-carboxyl and ε-amino groups, shows a wide rang of antimicrobial activity, water solubility, high safety, stability at high temperatures and wide pH range. Nisin and Poly-lysine in extending the shelf life of prawn was studied in this paper. The results showed that, the effect of Nisin, and related factors on the quality of the prawn had been investigated with orthogonal test, sense assess and microbiological analysis. Therefore, the optimum processing for preserving prawn with Nisin has been determined.
Keywords: Nisin; Poly-L-lysine; antimicrobial activity; orthogonal test
1 绪 论
食品及其原料本身具有丰富的营养，但在生产、运输、销售和贮存过程中，许多因素都能引起食品的腐败变质。除了使用许多传统的保藏方法以及近些年发展起来的食品保藏方法之外，在食品加工过程中还大量的使用食品防腐剂，这些防腐剂有很大一部分是化学合成的，其安全性越来越受到人们的关注。因此大力开发安全无毒、高效、经济的新型食品防腐剂对于食品工业的发展具有重大的意义。随着生物技术的不断发展，利用动植物或微生物的代谢产物等为原料经提取、酶法转化或者发酵等技术生产的天然生物性食品防腐剂逐渐受到人们的重视。
乳酸链球菌素（Nisin）是一种高效、无毒的天然防腐剂，也是一种唯一可作为防腐剂应用于食品的细菌素。乳酸链球菌素是一种由微生物代谢所产生的具有很强杀菌作用的天然代谢产物。乳酸链球菌素由于天然、高效、安全、无毒副作用、无抗药性、与其他抗生素无交叉抗性、在食品中易扩散、使用方便、无污染，是一种绿色的食品添加剂。
聚赖氨酸是由Shina等人在1977年发现的，作为天然防腐剂，它具有抑菌谱广、水溶性好、安全性高、热稳定性好、抑菌PH范围广等优点[1]。目前，聚赖氨酸是天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大商业潜力的生物类食品防腐剂。它是一种天然的微生物代谢产物。是经分离提取精制而获得的发酵产品[3]。
明虾以其美味及高营养价值深受人们的喜爱，但是明虾很容易腐败，现在除了冷冻储藏明虾、及时食用，产业化生产的明虾产品大都采用抽气真空包装、高温灭菌，使其达到一定的保质期。但是这种加工方式，高温灭菌的温度较高、时间较长，对明虾的口味的破坏较大，生产成本也比较大。因此，人们在明虾制品中尝试添加一些防腐剂，以降低灭菌温度、灭菌时间，从而保证明虾的真正风味，降低生产成本。
1.1 生物防腐剂的发展情况
过去常常采用在食品中加入合成防腐剂的方法来延长食品的货架期。这些防腐剂包括苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯、亚硝酸盐和硝酸盐等，他们均具有较好的抗菌作用，但经长期的研究发现，一些合成防腐剂有致癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题。同时他们还存在一些其他的明显的弊端，如：苯甲酸和山梨酸在PH值较低的介质中才表现出抗菌活性，而此时二者在水中的溶解度较小，而且苯甲酸盐可能引起食物中毒；对羟苯甲酸类物质在水中通常难溶，因此对生长在水中的微生物效果不理想；更重要的是，随着科技的进步和检测手段的完善，过去被认为安全的防腐剂现在发现有致癌性或潜在致癌的可能性，如用于肉类防腐和着色的亚硝酸盐可形成强致癌剂—N-亚硝胺类[4]。
为此，人们将目光转向了选择能够抑制食品致病菌的天然材料（如天然植物物质或食品级微生物的代谢产物）上，即所谓的生物型防腐剂上，以期改善的安全性。国际上较多使用由食品级（food grade）微生物—乳酸菌（Lactic acid bacteria, LAB）产生的细菌素，最近聚赖氨酸作为一种新型的生物防腐剂，也越来越受到人们的重视。乳酸菌产生的细菌素所具有的以下特点，使其成为天然食品防腐剂的开发对象：①其产生菌生产繁殖快，生产周期短，适合工业化生产；②能被人体内的蛋白酶降解，不在体内蓄积，不会对肠道的正常菌群产生影响；③不会产生耐药性，不会诱发食品病原菌等微生物对治疗用抗生素的抗性；④便于用现代基因工程技术对细菌素基因进行修饰和克隆。作为天然防腐剂，聚赖氨酸具有抑菌谱广、水溶性好、安全性高、热稳定性好、抑菌PH范围广等优点，是具有优良防腐性能和巨大商业潜力的生物类食品防腐剂。
1.2 Nisin特性的和抑菌作用
乳酸链球菌素（Nisin）是一种高效、五毒的天然防腐剂。Nisin又称乳酸链球菌肽，是以蛋白质原料经过发酵提制的一种多肽抗菌素类物质，是由Lactococcus Lactic菌株产生的。
1928年，L. A. Rogers等美国研究人员首先报道了乳链球菌代谢物能抑制其它乳酸菌的生长。1933年，Witehead等在新西兰观察到，野生乳链球菌能抑制干酪制作中乳酸菌的生长和酸的产生，并发现这种抑制物的本质是一种多肽。1947年，A. T. k等人从乳酸链球菌发酵液所产生的抑菌物质，并命名为Nisin(取自Ninhibitory substance)[9]。1951年Hirsc
h首先将其用作食品添加剂成功地抑制了引起Emmental Cheese膨胀腐败的肉毒梭菌。到1953年，Nisin的第一种商业化产品在英国面世，英国的Aplin＆Barrett 有限公司生产出了具有高而稳定性的Nisin浓缩物，商业上通称为Nisaplin。1969年FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会确认Nisin可作为食品添加剂。自1951年首次应用以来，至今以在五十多个国家得到应用。1990年，我国卫生部食品监督厅签发了在国内使用乳酸链球菌素作为食品保藏剂的使用合格证明书，并将其列入国标GB2760-86的1990年增补品中，可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品等[4]。
我国对Nisin的研究始于1989年，中国科学院微生物研究所等单位从Nisin生产菌的筛选、Nisin的分离纯化鉴定和生物学特性、Nisin的发酵条件研究、Nisin生物合成的调控和遗传学及Nisin的研究方法和应用等各方面进行了较为全面系统的研究，取得了较多成果[10]。中国科学院微生物研究所与浙江天台制药厂及轻工部食品发酵工业科学研究所协作，进行了2500L发酵罐的放大试验及中视产品的应用实验，中视产品的各项指标均符合我国食品添加剂卫生标准。2000年，Nisin已在浙江天台制药厂投产。
1.2.1 Nisin的分子结构
七十年代初期，Gross和Morell就搞清了Nisin分子的全结构。1988年，Fukase等报道了Nisin的人工化学合成。Nisin是一种多肽类细菌素，成熟分子仅含有34个氨基酸残基，其分子量为3510 Da。另外，其二聚体和四聚体已有报道，分子量分别为7000 Da和14000 Da。对于Nisin单体，含有5种稀有氨基酸，分别是ABA（氨基丁酸）、DHA（脱氢丙氨酸）、DHB（β-甲基脱氢丙氨酸）、ALA-S-ALA（羊毛硫氨酸）、ALA-S-ABA（β-甲基羊毛硫氨酸），通过硫醚键形成5个环，其结构如图[6]。
在转译水平上，Nisin前体分子含有57个氨基酸，其中23个残基位于引导区，34个残基在结构区，通过一系列的转译后修饰作用，去掉引导区部分，结构区的丝氨酸和苏氨酸在特殊位点脱水，形成DHA和DHB，脱水氨基酸和半胱氨酸间通过硫醚键形成羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨键。
Nisin天然状态下主要有两种形式，分别为NisinA和NisinZ，他们之间的差别在于氨基酸顺序中第27位氨基酸之间，在NisinA中是组氨酸，在NisinZ中是天冬氨酸，其基因核苷酸序列的第143位上的脱氧核苷酸不同是造成差别的根本原因。一般而言，在同样浓度下，NisinZ的溶解度和抑菌能力比NisinA要强[11]。
Nisin分子结构图
1.2.2 Nisin的溶解度及稳定性
实验证明，影响Nisin稳定性的主要因素有温度、PH、基质等，在高温和高PH下Nisin的损失最大；Nisin在酸性条件下呈现最大稳定性，随着PH的升高其稳定性大大降低，在PH为2.0或更低的稀盐酸中，经115.6℃高压灭菌，仍能稳定存在，而在PH为5.0时，其活力损失40%，当PH为9.8时其活力损失超过90%[12]。当Nisin加入带食品中，则受到介质的保护，一些大分子事物如牛奶、肉汤等可使其稳定性大大增强。另外，Nisin的稳定性还与事物货架期的温度及时间有关，Nisin对蛋白水解酶如蛋白酶、胰酶等消化酶特别敏感，但对粗制凝乳酶、脂酶、淀粉酶不敏感[2]。
Nisin的水溶性依赖于溶液的PH值，在PH值较低的情况下溶解性较好，在PH为2.5时其溶解度为12%，PH5.0时为4%，在中性及碱性条件下几乎不溶解。Nisin最好的溶剂为0.02%的盐酸，在应用时，一般先用0.02%盐酸溶解，再加入至食品中[12]。
1.2.3 Nisin的抑菌性能
1.2.3.1抑菌谱
Nisin与其他细菌素一样对一定范围微生物有抗菌能力。Nisin对G-菌、酵母和霉菌没有作用，仅对大多数G+有作用，其抑菌谱见表。从表中可以看出，Nisin可以抑制葡萄球菌、链球菌等食品中常见的污染菌，尤其是对梭菌和芽孢杆菌的抑制作用，这些产生内生孢子的细菌是食品的主要腐败微生物[13]。
由于Nisin的杀菌谱比较窄，所以它在使用中多与其他防腐手段联合使用，以弥补其抗菌谱窄的缺点，发挥广泛的防腐作用。最近的研究表明，Nisin与螯合剂EDTA联合使用对沙门氏菌和其他G-亦具有抑制作用[5]。Nisin与热处理可相互促进，Nisin也可与辐射处理结合使用，也可与其他防腐剂如山梨酸、聚赖氨酸等联合使用，以起到相互补充与相互促进的作用。
表1 Nisin的抑菌谱
Inhibitory speetrum of nisin
不形成芽孢的细菌 形成芽孢的细菌
(Strains no forming spores ) (strains forming spores)
乳酸链球菌乳脂亚种 凝结芽孢杆菌
无乳链球菌 蜡状芽孢杆菌
酿脓链球菌 枯草芽孢杆菌
金黄色葡萄球菌 嗜热脂肪芽孢杆菌
藤黄微球菌 地衣芽孢杆菌
短乳杆菌 肉毒梭菌
保加利亚乳杆菌 生孢梭菌
干酪乳杆菌 双酶梭菌
植物乳杆菌 产气荚膜梭菌
布氏乳杆菌 巴氏芽孢梭菌
肠膜明串珠菌 梭状芽孢杆菌
洒明串珠菌 嗜温糖解菌
乳酸片球菌 酪丁酸梭菌
有害片球菌
戊糖片球菌
单核增生利斯特氏菌
李斯特氏菌
1.2.3.2 抑菌机制
最近研究表明，Nisin对营养细胞的作用点是细胞质膜。它能抑制细胞壁中肽聚糖的生物合成，使细胞质膜和磷脂化合物的合成受阻，从而导致细胞内物质外泄甚至引起细胞裂解。Ralph-WJ等人认为Nisin具有潜在的跨膜序列及高的偶极矩能使膜产生孔道，同时使膜内外电位差和梯度丧失，破坏细胞通过电子传递链产生能量的能力。
Nisin对芽孢的作用是在芽孢萌发前期及芽孢膨胀期破膜，以抑制其发芽过程，因此必须保持足够的乳酸链球菌素残留量，以提供热加工食品在整个货架期中对残存孢子的连续作用。乳酸链球菌素对细菌孢子的作用随着加热时间和温度的增加，孢子的减少、PH的降低而提高。而且孢子越受到热损伤，就变得对乳酸链球菌素越敏感。
1.2.3.3 安全性、优越性
Nisin对蛋白酶特别敏感，在消化道中很快被α-胰凝乳蛋白酶分解。它对人体基本无毒性，也不与医用抗生素产生交叉抗药性，能在肠道中安全的降解。对Nisin的毒性、致癌性、存活性、再生性、血液化学性、肾功能、应激反应以及动物器官病毒学等生物学研究表明，Nisin是安全的[14]。
1962年日本的Hara等人证实，Nisin的半数致死量（LD50）约为7000mg/kg，与普通食盐接近。同年，英国的Frezer等人证明Nisin在正常使用的范围内是无毒的，即使大剂量使用也是无毒的。由于Nisin是一种多肽，食入后能在人体消化道中被蛋白质水解酶降解，因而不会改变肠道的正
常菌群，也不会像其他抗生素出现抗性过敏问题。
Nisin作为一种纯天然生物防腐剂，用于食品加工是基于它的以下优点：〔1〕它是一种多肽，可被人体内酶降解消化，不会产生不良副作用；〔2〕对食品的色、香、味、口感无影响；〔3〕它的使用可降低杀菌温度，减少热处理时间，故能改进食品的营养价值、风味、结构、颜色等性状。同时能节能，增加有效工作时间，从而间接增加产量；〔4〕它的酸性、热稳定性和低温贮藏稳定性，使它具有独特的使用特性[2]。
1.2.4 Nisin在食品工业中的应用
1969年，联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）食品添加剂联合专家委员会确认Nisin为食品添加剂，这也是第一个被[批准用于食品中的细菌素，1988年，美国食品与药品管理局将Nisin确定为公认安全的产品（GRAS，generally-recognized-as safe）[24]。到目前为止，已有50多个国家和地区批准Nisin作为一种天然食品防腐剂使用。1990年1月19日，我国卫生部食品监督厅签发了在国内使用Nisin作为食品保藏剂的使用合格证明书；1990年3月29日，Nisin被列入国标GB2760-86的1990年增补品种中[29]。虽然许多国家对Nisin用作食品添加剂在添加数量和所适用食品的范围有所不同，但是不少国家，如英国、法国、澳大利亚等对其添加量则不作任何限制。
目前，Nisin作为一种安全、无毒、天然的食品防腐剂和抗菌添加剂已被许多国家和地区广泛应用于乳制品、罐头食品、蔬菜制品、肉制品、水产制品及饮料。
〔1〕乳制品 Nisin最早用于干酪的防腐，以后又推广到牛奶和风味奶制品中。巴氏灭菌精制乳酪糊状食品中添加Nisin可有效抑制A、B型肉毒杆菌菌株的生长及毒素的产生。Nisin也可用于防止奶油制品中葡萄球菌引起的中毒。添加产Nisin的发酵剂可以防止瑞士奶酪由于丁酸梭状芽孢杆菌和酪丁酸梭状芽孢杆菌生长引起的品质不良。Nisin的作用还可以增加一些细菌对热的敏感性，使消毒奶热处理消毒更加温和，既节省了大量能源，又改善了消毒牛奶的营养价值[15]。
〔2〕肉制品 高温肉制品通常用的杀菌温度是121℃，20-30分钟。它的理论依据是：要杀死耐热性芽孢杆菌，必须采用高温、高压。由于Nisin对肉毒杆菌有强烈的抑制作用，故可降低杀菌温度，又能达到延长保质期的目的。在肉制品中添加Nisin，可以起到以下两个作用：
①灭菌温度降低或杀菌时间缩短，可以提高肉制品的使用品质；
②灭菌温度降低或杀菌时间缩短，可减少营养成分的损失，又节约了能源。
肉制品的主要污染菌是G+菌，Nisin作为G+菌抑制剂广泛应用于在肉类加工过程中。Rayman指出，Nisin可作为腌制肉制品中硝酸盐的替代剂，以减少或避免亚硝胺类物质对人体健康的威胁。经研究表明，当Nisin添加量为0.3g/kg时，绝大部分G+菌受抑制，肉制品在色、香、味上与添加亚硝酸盐相比无差异。乳酸链球菌素与加热杀菌相结合保藏即食腊肉的最佳工艺条件为：乳酸链球菌素浓度为1 g/L，加热温度80℃，加热时间8min[16]。
〔3〕罐头食品 罐头食品中经常污染一些极为耐热的细菌孢子，如嗜热脂肪芽孢杆菌，一旦条件适宜，他们将会生长并引起腐败。将Nisin用于罐头食品不仅可保证罐头的安全性，良好的外观和质地，并能节省能量、降低热处理强度、改善罐头食品的营养价值。在蔬菜罐头制品中，Nisin可以控制一些G+腐败菌如西红柿罐头中的巴氏芽孢梭菌和软化芽孢杆菌的生长，而且在罐头产品中添加Nisin还有可能降低菌条件。Nisin已成功地应用于胡萝卜、蘑菇、土豆、豌豆、番茄、汤汁、谷物布丁及许多其他罐头食品中。Nisin亦可用于火腿、牛舌及各种肉类和鱼类三明治这些高蛋白食品，过分热处理会明显改变其质地和外观，加入Nisin后仅需45%的热处理就可延长其贮存期。近年来，有人用Nisin代替亚硝酸盐的研究，结果表明75 mg/kg Nisin的抑制效果要优于150 mg/kg亚硝酸盐的作用。有人建议用少量亚硝酸盐作发色剂，配合Nisin的防腐作用，可以降低亚硝酸盐的用量[26]。
〔4〕酒精饮料 腐败乳酸菌对Nisin敏感，但酵母几乎不受其影响，Nisin与酵母一起在生产啤酒、果酒等酒精饮料时加入，用来抑制G+菌。Nisin对苹果汁、橘子汁和葡萄汁中的泛酸芽孢杆菌有抑制作用，结果发现，3种果汁中Nisin的添加量仅为5 IU/ml，即可抑制芽孢杆菌的生长。在巴氏灭菌前添加适量的Nisin能有效地防止果汁饮料的腐败[17]。
1.2.5 Nisin的前景展望
在食品工业中，各类食品的防腐保鲜始终是一个亟待解决的重要问题，据估计，全世界每年约有10%～20%的食物损失于各种腐败。为了延长食品的保藏期限，人们在加工工程中，采用了多种办法，例如高温处理、冷藏或冻结、降低水分活度、酸化和防腐剂处理等[2]。其中添加防腐剂是一种极为有效的手段，最初，人们普遍使用的是化学防腐剂，但是这些化学防腐剂都对人体有或多或少的毒害作用，对自然界的生态环境也会产生不利影响。随着人们生活水平的提高，健康食品、绿色食品的概念已经越来越被大从接受，对高效、无毒的天然防腐剂的研究和应用也越来越引起人们的重视。Nisin是一种高效无毒的天然发防腐剂，具有抗菌广谱性、无毒性、稳定性好、适用范围广等优良性质，因此已被广泛应用于多种食品的防腐保鲜，可以说，Nisin是一种比较理想的天然食品防腐剂，对Nisin这种天然食品防腐剂进行大力研究和开发无疑具有广阔的应用前景，将会带来重大的经济效益和社会效益。
1.3 聚赖氨酸的特性及抑菌作用
聚赖氨酸（Polylysine缩写为PL）是由链霉菌属生产菌产生代谢产物，经分离提取精制而获得发酵产品。赖氨酸含有两个氨基，聚合时有α位和ε位两个位点聚合产物。研究证明由于ε-聚赖氨酸比α-聚赖氨酸有更强的抑菌活性，而且α-聚赖氨酸有一定毒性，目前在国际市场上ε-聚赖氨酸作为食品防腐剂已经取代了α-聚赖氨酸。
作为新型的天然防腐剂，聚赖氨酸已于2003年10月被FDA批准为安全食品保鲜剂。迄今为止，聚赖氨酸的微生物发酵在日本已实现工业化生产，年产千吨的聚赖氨酸的现代化工业化生产装置已建成投产，目前国内的浙江天台银象生物工程有限公司也已经能够工业化生产聚赖氨酸。
1.3.1 聚赖氨酸理化性质
ε-聚赖氨酸（ε-PL）聚合度一般为25～30，数平均分子量（Mn）为4090，重量平均分子量（Mw）4
700；分子量分布（Mw/Mn）1：1.14；融点172.8℃；转晶点88℃。ε-聚赖酸分子结构图如下：
聚赖氨酸分子结构图
ε-PL为淡黄色粉末、吸湿性强、略有苦味，是赖氨酸直链状聚合物。其不受PH值影响，对热稳定（120℃，20min）。但遇酸性多糖类、盐酸盐类、磷酸盐类、铜离子等可能因结合而使活性降低。与盐酸、柠檬酸、苹果酸、甘氨酸和高级脂肪甘油酯等合用又有增效作用。分子量在3600～4300之间ε-聚赖氨酸其抑菌活性最好，当分子量低于1300时，ε-聚赖氨酸失去抑菌活性。由于聚赖氨酸是混合物，所以没有固定熔点，250℃以上开始软化分解。ε-聚赖氨酸溶于水，微溶于乙醇。对其表征进行红外光谱分析表明：在1680～1640cm-1和1580～1520cm-1有强吸收峰[18]。
1.3.2 聚赖氨酸的稳定性
聚赖氨酸热稳定性非常好，聚赖氨酸水溶液在80℃处理60分钟、100℃处理30分钟、120℃处理20分钟后对大肠杆菌最小抑制浓度不变，即说明其在高温情况下不分解，不失活。聚赖氨酸能承受一般食品加工过程中热处理，可随原料一同进行灭菌处理，防止二次污染。
1.3.3 聚赖氨酸的抑菌性
1.3.3.1 抑菌谱
ε-聚赖氨酸抑菌谱广，对于酵母属的尖锐假丝酵母菌、法红酵母菌、产膜毕氏酵母、玫瑰掷孢酵母；革兰氏阳性菌中的耐热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌；革兰氏阴性菌中的产气节杆菌、大肠杆菌等引起食物中毒与腐败的菌有强烈的抑制作用。研究表明：ε-聚赖氨酸对革兰氏阳性的微球菌，保加利亚乳杆菌、热链球菌，革兰氏阴性的大肠杆菌，沙门氏菌以及酵母菌的生长有明显抑制效果，聚赖氨酸与醋酸复合试剂对枯草芽孢杆菌有明显抑制作用。
1.3.3.2 抑菌机制
聚赖氨酸的抑菌机制主要表现在破坏微生物的细胞膜结构，引起细胞的物质、能量和信息传递中断，最终导致细胞死亡。因为细胞膜是微生物进行能量转化、物质代谢的主要场所之一，所以ε-聚赖氨酸吸附到细胞膜上，可破坏膜结构完整性，使细胞丧失对物质的选择性，可导致细胞内溶酶体膜破裂而诱导微生物产生自溶作用，最终导致细胞死亡[19]。
1983年Vaara M等发现聚阳离子能破坏G-细菌的外膜，并进一步杀死这些细菌。1922年Vaara M进一步发现，聚赖氨酸是通过吸附到G-细菌的外膜上，释放出大量的脂多糖，破坏细菌外膜，而起到抑菌作用的。
1984年S Shina等对ε-PL的进一步研究发现当其浓度为1～8mg/L-1时，即对G+、G-细菌有抑制作用，且抑菌能力强，ε-PL必须含有10个以上赖氨酸残基才具有抑菌活性，对氨基的化学修饰会降低其抑菌能力[20]。ε-PL通过与细胞膜作用影响微生物细胞的呼吸，与胞内的核糖体结合影响生物大分子的合成[21]。
1.3.4 聚赖氨酸的安全性
聚赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肽，这种生物防腐剂在80年代初由日本学者腾井正弘、平木纯首次应用于食品防腐。聚赖氨酸能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体所必需氨基酸之一，也是世界各国允许在食品中强化的氨基酸。因此聚赖氨酸是一种营养型抑菌剂，安全性高于其他化学防腐剂，其急性口服毒性为5 g/kg[22]。
1.3.5 聚赖氨酸在食品中的应用
ε-聚赖氨酸添加于食品中仅需微量就产生效果，且不会影响味感，可做食品的天然保鲜剂。它天然安全，符合消费者的健康需求。在日本，利用ε-聚赖氨酸作为食品保存剂的生产规模发展迅速，市场规模达数十亿日元。ε-聚赖氨酸应用于糕点、面包食品中，能有效的抑制耐热性芽孢杆菌的增殖，延长保存期；应用于低糖低热量食品，如乳蛋白冰淇凌，奶油制品等，可改善其保存性；在低温软罐头食品中加微量ε-聚赖氨酸可防止杀菌后产生异味；在冷藏食品中添加ε-聚赖氨酸能起到保证质量的效果。
徐红华[23]等通过饱和试验设计研究了ε-聚赖氨酸和甘氨酸对牛奶保鲜作用，结果表明单独使用ε-聚赖氨酸和甘氨酸，其抑菌能力明显低于二者混合使用的效果。混合使用时其增效随二者用量的增加而增加；但当ε-聚赖氨酸用量过高时，这种增效作用会有所减弱。其中添加420 mg/L-1ε-聚赖氨酸和2%的甘氨酸抑菌效果最佳[27]。
日本学者腾井正弘在米饭中添加0.4%～0.6%的ε-聚赖氨酸-醋酸制剂研究对米饭的防腐作用结果显示：30℃培养48 h后，添加ε-聚赖氨酸防腐剂的样品中细菌总数为6.0×103个/g，而空白样品中细菌总数为3.6×108个/g，表明ε-聚赖氨酸-醋酸制剂有明显的抑菌作用[23]。
1.4 课题内容、要求
1.4.1 内容
本课题主要内容是了解乳酸链球菌素和聚赖氨酸的应用特性，了解明虾制品生产工艺，并通过对不同条件下乳酸链球菌素和聚赖氨酸在明虾制品中抑菌效果的研究，得到乳酸链球菌素和聚赖氨酸在明虾制品中的最佳应用方案。
1.4.2 要求
设计明虾制品生产工艺及明虾制品生产工艺条件；
掌握乳酸链球菌素和聚赖氨酸在明虾制品中的几种不同应用方案及灭菌消毒的基本操作和微生物检测的基本方法。
掌握有关仪器设备的正确使用，如高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、真空包装机。
通过正交实验，得到乳酸链球菌素和聚赖氨酸在明虾制品中的最佳应用方案，得到最佳的明虾制品生产工艺。
1.5 本章小结
在食品工业中，各类食品的防腐保鲜始终是一个亟待解决的重要问题，据估计，全世界每年约有10%～20%的食物损失于各种腐败。为了延长食品的保藏期限，人们在加工工程中，采用了多种办法，例如高温处理、冷藏或冻结、降低水分活度、酸化和防腐剂处理等[2]。其中添加防腐剂是一种极为有效的手段，最初，人们普遍使用的是化学防腐剂，但是这些化学防腐剂都对人体有或多或少的毒害作用，对自然界的生态环境也会产生不利影响。随着人们生活水平的提高，健康食品、绿色食品的概念已经越来越被大从接受，对高效、无毒的天然防腐剂的研究和应用也越来越引起人们的重视。Nisin是一种高效无毒的天然发防腐剂，具有抗菌广谱性、无毒性、稳定性好、适用范围广等优良性质，因此已被广泛应用于多种食品的防腐保鲜。聚赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肽，聚赖氨酸能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体所必需八种氨基酸之一，也是世界各国允许在食品中强化的氨基酸。可以预计，两
种生物防腐剂必将在食品工业中得到广泛的应用。
2 实验部分
2.1 实验材料
2.1.1 实验用主要仪器设备和试剂
2.1.1.1实验用主要仪器设备:
SPX-100B-2型恒温微生物培养箱 、高压灭菌锅、真空充气包装机、SW-CJ-1B单人单面净化工作台、电磁炉、500型电子天平、SPX-100B-2型恒温微生物培养箱、高压灭菌锅、真空充气包装机、SW-CJ-1B单人单面净化工作台、电磁炉、500型电子天平、GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱、
2.1.1.2实验用主要试剂:
Nisin, 由浙江天台银象生物工程有限公司提供
聚赖氨酸, 由浙江天台银象生物工程有限公司提供
2.1.2 实验用样品
新鲜明虾 购于杭州古荡农贸市场
2.1.3 实验用培养基
牛肉膏蛋白胨培养基（500 mL）: 牛肉膏1.5 g，蛋白胨5.0 g，NaCl2.5 g，固体加9 g琼脂，调节pH 7.2±0.2，121℃，灭菌15 min
2.2 实验方法
2.2.1 Nisin的制备
Nisin（乳酸链球菌素，又称乳球菌肽或乳链菌肽）是某些乳酸球菌代谢过程中合成和分泌的具有很强杀菌作用的小分子肽。它可以广泛应用于食品防腐，是高效无毒的天然防腐剂。聚赖氨酸（Polylysine缩写为PL）是由链霉菌属生产菌产生代谢产物，经分离提取精制而获得发酵产品。ε-聚赖氨酸添加于食品中仅需微量就产生效果，且不会影响味感，可做食品的天然保鲜剂。它天然安全，符合消费者的健康需求。
乳酸链球菌素和聚赖氨酸的开发和利用将对促进我国绿色食品的发展和保障人民健康具有重要的意义，它能有效的延长食品货架期，并且对人体无害，有明显的社会和经济效益。
Nisin（乳酸链球菌素）在0.02mol/LHCL中溶解度最大，因此一般先将Nisin溶于0.02mol/L HCL中，配置成溶液，再应用于明虾制品中。
2.2.2 明虾制作工艺
水产品产业是朝阳产业，每年的增长速度都是很惊人的。但是水产品，比如明虾很容易腐败变质。而乳酸链球菌素和聚赖氨酸的使用可解决明虾制品中的防腐问题，也可使明虾制品在加工中降低灭菌温度，保持其原有的营养、色香味，还可以降低能耗，为明虾销售提供安全保障。
2.2.2.1 明虾中辅料的配方
以下配方以明虾50 g作为基量。
明虾：50 g
盐：6 g
味精：1.2 g
醋：根据PH值而定
2.2.2.2 明虾加工工艺
新鲜明虾 ———→ 烧熟、剥壳 ———→ 添加保鲜液 ———→ 冷却、装入袋内 ———→ 真空包装 ———→ 37℃贮存
2.2.3 抑菌性的正交实验
本课题主要研究Nisin和聚赖氨酸对明虾制品最佳抑菌效果，从而最大限度地延长明虾制品的货架期。本实验采用正交实验，确定防腐剂量、PH值、杀菌温度为三因素，做三因素三水平正交实验，最终找到明虾制品最佳抑菌效果的防腐方案。
表1 Nisin的正交实验表
水平 Nisin PH值 灭菌温度（℃）
1 1/10000 5.3 108℃（20min）
2 3/10000 6.0 115℃(15min)
3 5/10000 6.5 121℃（10min）
表2 聚赖氨酸的正交实验表
水平 聚赖氨酸 PH值 灭菌温度（℃）
1 1/10000 5.3 108℃(20min)
2 3/10000 6.0 115℃(15min)
3 5/10000 6.5 121℃(10min)
表3 Nisin和聚赖氨酸复合防腐剂的正交实验
水平 Nisin和聚赖氨酸 PH值 灭菌温度（℃）
1 1/10000 5.3 108℃(20min)
2 3/10000 6.0 115℃(15min)
3 5/10000 6.5 121℃(10min)
表4 正交实验安排表
实验号 防腐剂量（C） PH值(H) 杀菌温度(T)
1 C1 H1 T1
2 C1 H2 T2
3 C1 H3 T3
4 C2 H1 T2
5 C2 H2 T3
6 C2 H3 T1
7 C3 H1 T3
8 C3 H2 T1
9 C3 H3 T2
2.2.4 微生物检验
本课题的细菌检验采用中华人民共和国国家标准GB4789.2—94食品卫生微生物学检验菌落总数测定。
2.2.4.1 营养琼脂培养基制备
㈠ 溶解：将培养基按配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入500ml锥形瓶（牛肉膏常用玻璃棒挑取），加入500ml水，全部溶解后，再加入9g琼脂。
㈡ 调PH：将PH调至PH7.0～7.2，以利于细菌的生长繁殖。
㈢ 培养基配完后，棉塞包好牛皮纸，121℃灭菌20min即可。
2.2.4.2 细菌总数的测定
㈠ 以无菌操作，将检样1g剪碎放于含有9ml灭菌生理盐水的灭菌钵内，经充分摇振或研磨做成1：10的均匀稀释液。
㈡ 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。
㈢ 另取1ml灭菌吸管，按上条操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
㈣ 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿，每个稀释度做两个平皿。
㈤ 稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基（放置于46±1℃水浴保温）注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照。
㈥ 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃恒温箱内培养48±2h。
㈦ 做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。再记下个平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定总则。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应已无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其中一半中菌落分布又不均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落，如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。
3 结果与分析
3.1 正交实验计算方法
正交实验结果的极差分析方法是指在各列中个水平对应的实验指标平均值的最大值与最小值之差。在试验范围内，各列对试验指标的影响从大到小的排队。某列的极差最大，表示该列的数值在试验范围内变化时，使试验指标数值的变化最大。所以各列对试验指标的影响从大到小的排队，就是各列极差D的数值从大到小的排队。
表5 L9（33）正交试验计算表
1 2 3 试验指标
1 1 1 1 y1
2 1 2 2 y2
3 1 3 3 y3
4 2 1 2 y4
5 2
2 3 y5
6 2 3 1 y6
7 3 1 3 y7
8 3 2 1 y8
9 3 3 2 y9
Ⅰj Ⅰ1= y1+ y2+ y3 Ⅰ2= y1+ y4+ y7 Ⅰ3= y1+ y6+ y8
Ⅱj Ⅱ1= y4+ y5+ y6 Ⅱ2= y2+ y5+ y8 Ⅱ3= y2+ y4+ y9
Ⅲj Ⅲ1= y7+ y8+ y9 Ⅲ2= y3+ y6+ y9 Ⅲ3= y3+ y5+ y7
Kj K1=3 K2=3 K3=3
Ⅰj/ Kj Ⅰ1/K1 Ⅰ2/ K2 Ⅰ3/K3
Ⅱj/ Kj Ⅱ1/K1 Ⅱ2/ K2 Ⅱ3/K3
Ⅲj/ Kj Ⅲ1/K1 Ⅲ2/ K2 Ⅲ3/K3
极差（Dj） max－min max－min max－min
注：
Ⅰj —— 第j列“1”水平所对应的试验指标的数值之和；
Ⅱj —— 第j列“2”水平所对应的试验指标的数值之和；
Kj —— 第j列同一水平出现的次数。等于试验的次数（n）除以第j列的水平数；
Ⅰj/Kj —— 第j列“1”水平所对应的试验指标的平均值；
Ⅱj/Kj —— 第j列“1”水平所对应的试验指标的平均值；
Dj —— 第j的极差。等于第j列各水平对应的试验指标平均值中的最大值减去最小值，即
Dj=max{Ⅰj/Kj，Ⅱj/Kj ，…}—min{Ⅰj/Kj，Ⅱj/Kj ，…}
3.2 Nisin对明虾制品最佳抑菌条件的确定
3.3.1 Nisin的正交实验结果
将对加入Nisin的明虾制品做为期7天的细菌检测，第2天做第一次检测，第4天做第二次检测，第7天做第三次检测。
表6 Nisin抑菌检测正交实验结果
组号 细菌数（个/g）
二天后 四天后 七天后
一 75 140 190
二 50 80 95
三 30 60 100
四 0 30 30
五 35 10 30
六 30 45 70
七 0 10 20
八 0 0 0
九 0 0 10
3.3.2 Nisin正交实验结果分析
表7 Nisin正交实验结果分析表（2天后）
序号 A（Nisin量） B（PH） C（杀菌温度）
Ⅰj Ⅰ1=155 Ⅰ2=75 Ⅰ3=105
Ⅱj Ⅱ1=65 Ⅱ2=85 Ⅱ2=50
Ⅲj Ⅲ1=0 Ⅲ3=60 Ⅲ3=65
K j K1=3 K2=3 K3=3
Ⅰj/K j Ⅰ1/K 1=52 Ⅰ2/K 2=25 Ⅰ3/K 3=35
Ⅱj/K j Ⅱ1/K 1=22 Ⅱ2/K 2=28 Ⅱ2/K 2=16
Ⅲj/K j Ⅲ1/K 1=0 Ⅲ2/K 2=20 Ⅲ3/K 3=21
极差（D j） D1=52 D2=8 D3=19
根据表8中各因素极差值的大小，排出第2天影响乳酸链球菌素对明虾制品抑菌效果的主次因素是A〉B〉C，同样就水平来说，B水平比较好。
表8 Nisin正交实验结果分析表（4天后）
序号 A（Nisin量） B（PH） C（杀菌温度）
Ⅰj Ⅰ1=280 Ⅰ2=180 Ⅰ3=185
Ⅱj Ⅱ1=85 Ⅱ2=90 Ⅱ2=110
Ⅲj Ⅲ1=10 Ⅲ3=105 Ⅲ3=80
K j K1=3 K2=3 K3=3
Ⅰj/K j Ⅰ1/K 1=93 Ⅰ2/K 2=60 Ⅰ3/K 3=61
Ⅱj/K j Ⅱ1/K 1=28 Ⅱ2/K 2=30 Ⅱ2/K 2=36
Ⅲj/K j Ⅲ1/K 1=3 Ⅲ2/K 2=35 Ⅲ3/K 3=26
极差（D j） D1=90 D2=30 D3=25
根据表8中各因素极差值的大小，排出第2天影响乳酸链球菌素对明虾制品抑菌效果的主次因素是A〉B〉C，同样就水平来说，B水平比较好。
表9 Nisin正交实验结果分析表（7天后）
序号 A（Nisin量） B（PH） C（杀菌温度）
Ⅰj Ⅰ1=385 Ⅰ2=240 Ⅰ3=260
Ⅱj Ⅱ1=130 Ⅱ2=125 Ⅱ2=135
Ⅲj Ⅲ1=30 Ⅲ3=180 Ⅲ3=150
K j K1=3 K2=3 K3=3
Ⅰj/K j Ⅰ1/K 1=128 Ⅰ2/K 2=80 Ⅰ3/K 3=86
Ⅱj/K j Ⅱ1/K 1=43 Ⅱ2/K 2=41 Ⅱ2/K 2=45
Ⅲj/K j Ⅲ1/K 1=10 Ⅲ2/K 2=60 Ⅲ3/K 3=50
极差（D j） D1=118 D2=29 D3=41
根据表8中各因素极差值的大小，排出第2天影响乳酸链球菌素对明虾制品抑菌效果的主次因素是A〉B〉C，同样就水平来说，B水平比较好。
综合分析比较，影响Nisin对明虾制品抑菌效果的主次因素是：A〉B〉C，抑菌效果较好的组合为A3B1C3，即Nisin浓度为5/10000，PH值为5.3，杀菌温度为115℃，杀菌时间为15min。
3.3 聚赖氨酸对明虾制品最佳抑菌条件的研究
3.3.1 聚赖氨酸正交实验结果
将对加入聚赖氨酸的明虾制品做为期2天的细菌检测，第2天做第一次检测，第4天做第二次检测，第7天做第三次检测。
表10 聚赖氨酸抑菌检测正交实验结果
组号 细菌数（个/g）
2天后 4天后 7天后
一 70 105 145
二 20 30 75
三 10 25 50
四 15 30 55
五 10 25 50
六 10 30 40
七 0 0 0
八 0 0 25
九 0 10 25
3.3.2 聚赖氨酸正交实验结果分析
表11 聚赖氨酸正交实验结果分析表（2天后）
序号 A（聚赖氨酸量） B（PH） C（杀菌温度）
Ⅰj Ⅰ1=100 Ⅰ2=85 Ⅰ3=80
Ⅱj Ⅱ1=35 Ⅱ2=30 Ⅱ2=35
Ⅲj Ⅲ1=0 Ⅲ3=20 Ⅲ3=20
K j K1=3 K2=3 K3=3
Ⅰj/K j Ⅰ1/K 1=33 Ⅰ2/K 2=28 Ⅰ3/K 3=27
Ⅱj/K j Ⅱ1/K 1=12 Ⅱ2/K 2=10 Ⅱ2/K 2=11
Ⅲj/K j Ⅲ1/K 1=0 Ⅲ2/K 2=7 Ⅲ3/K 3=6
极差（D j） D1=33 D2=21 D3=21
根据表8中各因素极差值的大小，排出第2天影响聚赖氨酸对明虾制品抑菌效果的主次因素是D1〉D2〉D3，同样就水平来说，B、C水平比较好。
表12 聚赖氨酸正交实验结果分析表（4天后）
序号 A（聚赖氨酸量） B（PH） C（杀菌温度）
Ⅰj Ⅰ1=160 Ⅰ2=135 Ⅰ3=135
Ⅱj Ⅱ1=85 Ⅱ2=55 Ⅱ2=70
Ⅲj Ⅲ1=10 Ⅲ3=65 Ⅲ3=50
K j K1=3 K2=3 K3=3
Ⅰj/K j Ⅰ1/K 1=46 Ⅰ2/K 2=45 Ⅰ3/K 3=45
Ⅱj/K j Ⅱ1/K 1=28 Ⅱ2/K 2=18 Ⅱ2/K 2=23
Ⅲj/K j Ⅲ1/K 1=3 Ⅲ2/K 2=21 Ⅲ3/K 3=16
极差（D j） D1=43 D2=27 D3=29
根据表8中各因素极差值的大小，排出第2天影响聚赖氨酸对明虾制品抑菌效果的主次因素是D1〉D2〉D3，同样就水平来说，B水平比较好。
表13 聚赖氨酸正交实验结果分析表（7天后）
序号 A（聚赖氨酸量） B（PH） C（杀菌温度）
Ⅰj Ⅰ1=270 Ⅰ2=225 Ⅰ3=210
Ⅱj Ⅱ1=145 Ⅱ2=150 Ⅱ2=155
Ⅲj Ⅲ1=50 Ⅲ3=115 Ⅲ3=100
K j K1=3 K2=3 K3=3
Ⅰj/K j Ⅰ1/K 1=90 Ⅰ2/K 2=75 Ⅰ3/K 3=70
Ⅱj/K j Ⅱ1/K 1=48 Ⅱ2/K 2=50 Ⅱ2/K 2=51
Ⅲj/K j Ⅲ1/K 1=16 Ⅲ2/K 2=38 Ⅲ3/K 3=33
极差（D j） D1=74 D2=37 D3=37
根据表8中各因素极差值的大小，排出第2天影响聚赖氨酸对明虾制品抑菌效果的主次因素是D1〉D2〉D3，同样就水平来说，B、C水平比较好。
综合分析比较，影响聚赖氨酸对明虾制品抑菌效果的主次因素是：A〉B〉C，抑菌效果较好的组合为A3B1C3，即聚赖氨酸浓度为5/10000，PH值为5.3，杀菌温度为121℃，杀菌时间为10min。
3.4 复合保鲜剂对明虾制品最佳抑菌条件的研究
3.4.1 复合保鲜剂正交实验结果
将对加入复合保鲜的明虾制品做为期7天的细菌检测，第二天做第一次检测，第四天做第二次检测，
第七天做第三次检测。
表14 复合保鲜剂抑菌性检测正交表
组号 细菌数（个/g）
二天后 四天后 七天后
一 10 20 30
二 0 10 20
三 0 0 10
四 0 0 0
五 0 0 0
六 0 10 20
七 0 0 0
八 0 0 0
九 0 0 0
3.4.2 复合保鲜剂正交实验结果分析
表15 复合保鲜剂正交实验结果分析表（2天后）
序号 A（复合保鲜剂量） B（PH） C（杀菌温度）
Ⅰj Ⅰ1=30 Ⅰ2=10 Ⅰ3=10
Ⅱj Ⅱ1=10 Ⅱ2=0 Ⅱ2=0
Ⅲj Ⅲ1=0 Ⅲ3=0 Ⅲ3=0
K j K1=3 K2=3 K3=3
Ⅰj/K j Ⅰ1/K 1=10 Ⅰ2/K 2=3 Ⅰ3/K 3=3
Ⅱj/K j Ⅱ1/K 1=3 Ⅱ2/K 2=0 Ⅱ2/K 2=0
Ⅲj/K j Ⅲ1/K 1=0 Ⅲ2/K 2=0 Ⅲ3/K 3=0
极差（D j） D1=7 D2=3 D3=3
根据表8中各因素极差值的大小，排出第2天影响复合保鲜剂对明虾制品抑菌效果的主次因素是A〉B=C。
表16 复合保鲜剂正交实验结果分析表（4天后）
序号 A（复合保鲜剂量） B（PH） C（杀菌温度）
Ⅰj Ⅰ1=10 Ⅰ2=20 Ⅰ3=30
Ⅱj Ⅱ1=0 Ⅱ2=10 Ⅱ2=10
Ⅲj Ⅲ1=0 Ⅲ3=10 Ⅲ3=0
K j K1=3 K2=3 K3=3
Ⅰj/K j Ⅰ1/K 1=3 Ⅰ2/K 2=6 Ⅰ3/K 3=10
Ⅱj/K j Ⅱ1/K 1=0 Ⅱ2/K 2=3 Ⅱ2/K 2=3
Ⅲj/K j Ⅲ1/K 1=0 Ⅲ2/K 2=3 Ⅲ3/K 3=0
极差（D j） D1=3 D2=3 D3=7
根据表8中各因素极差值的大小，排出第4天影响复合保鲜剂对明虾制品抑菌效果的主次因素是A=B〈C，就水平来说，A水平比较好。
表17 复合保鲜剂正交实验结果分析表（7天后）
序号 A（复合保鲜剂量） B（PH） C（杀菌温度）
Ⅰj Ⅰ1=60 Ⅰ2=30 Ⅰ3=50
Ⅱj Ⅱ1=20 Ⅱ2=20 Ⅱ2=20
Ⅲj Ⅲ1=0 Ⅲ3=30 Ⅲ3=10
K j K1=3 K2=3 K3=3
Ⅰj/K j Ⅰ1/K 1=20 Ⅰ2/K 2=10 Ⅰ3/K 3=16
Ⅱj/K j Ⅱ1/K 1=6 Ⅱ2/K 2=6 Ⅱ2/K 2=6
Ⅲj/K j Ⅲ1/K 1=0 Ⅲ2/K 2=10 Ⅲ3/K 3=3
极差（D j） D1=14 D2=4 D3=13
根据表8中各因素极差值的大小，排出第7天影响复合保鲜剂对明虾制品抑菌效果的主次因素是A〉C〉B，就水平来说，A水平比较好。
综合分析比较，影响复合保鲜剂对明虾制品抑菌效果的主次因素是：A〉B〉C，抑菌效果较好的组合为A3B1C3，即复合保鲜剂浓度为3/10000，PH值为5.3，杀菌温度为115℃，杀菌时间为15min。
3.5 本章小结
保鲜剂浓度、灭菌温度、灭菌时间都会影响到保鲜剂对明虾制品的抑菌作用，综合来说，较大的影响因素是保鲜剂浓度，其余依次为灭菌温度、时间和PH值。Nisin单独应用的最佳抑菌条件为：Nisin的浓度为5/10000，PH为5.3，灭菌温度115℃，15min。聚赖氨酸单独应用的最佳抑菌条件为：聚赖氨酸浓度为5/10000，PH为5.3，灭菌温度为121℃，10min。复合保鲜剂的最佳抑菌条件为：保鲜剂浓度为3/10000，pH5.3，灭菌温度为115℃，15min。
4 总结与展望
4.1 生物保鲜剂对细菌的作用
综合实验表明，Nisin和聚赖氨酸的浓度对明虾制品抑菌作用影响最大，当两者组合成复合保鲜剂时，保鲜剂浓度和灭菌温度对明虾制品抑菌作用较大。Nisin对细菌的作用，首先是对其细胞膜的吸附，带有正电荷的乳酸链球菌素吸附在敏感菌的膜上，利用离子间的相互作用及其分子的C末端、N末端对膜结构产生作用，在细胞膜上产生通透孔道，导致胞内物质泄漏，细胞解体死亡，从而起到抑制细菌生长的作用。
4.2 杀菌温度、时间对抑菌效果的影响
实验表明，明虾制品的杀菌温度、时间对Nisin的活性起到了重要作用，明虾制品的杀菌温度越高、时间越长，Nisin的抑菌效果越好。但是，也不是越高越好，太高的温度会降低Nisin的活性，所以导致相同条件下的明虾制品在121℃下灭菌效果比在115℃时灭菌效果差。而聚赖氨酸的耐热性较强，在121℃的高温，也可以保持它的活性，这个性质可以在高温灭菌食品中得到广泛的应用。
4.3 生物保鲜剂在食品中应用的展望
Nisin作为一种纯天然生物防腐剂，用于食品加工，可被人体内酶降解消化，不会产生不良副作用；对食品的色、香、味、口感无影响；可降低杀菌温度，减少热处理时间，故能改进食品的营养价值、风味、结构、颜色等性状。同时能节能，增加有效工作时间，从而间接增加产量；酸性、热稳定性和低温贮藏稳定性，使它具有独特的使用特性。
聚赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肽，能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体所必需锝中氨基酸之一，也是世界各国允许在食品中强化的氨基酸。因此聚赖氨酸是一种营养型抑菌剂，安全性高于其他化学防腐剂。
两种组成的复合保鲜剂应用到明虾加工中，可以有效降低灭菌温度与灭菌时间，减少生产成本。
4.4 实验总结
保鲜剂浓度、灭菌温度、灭菌时间都会影响到保鲜剂对明虾制品的抑菌作用，综合来说，较大的影响因素是保鲜剂浓度，其余依次为灭菌温度、时间和PH值。Nisin单独应用的最佳抑菌条件为：Nisin的浓度为5/10000，PH为5.3，灭菌温度115℃，15min。聚赖氨酸单独应用的最佳抑菌条件为：聚赖氨酸浓度为5/10000，PH为5.3，灭菌温度为121℃，10min。复合保鲜剂的最佳抑菌条件为：保鲜剂浓度为3/10000，PH5.3，灭菌温度为115℃，15min。
相信在将来，Nisin和聚赖氨酸这两种生物保鲜剂在食品工业中可以得到更广泛的应用。Nisin是一种高效无毒的天然发防腐剂，具有抗菌广谱性、无毒性、稳定性好、适用范围广等优良性质，因此已被广泛应用于多种食品的防腐保鲜，可以说，Nisin是一种比较理想的天然食品防腐剂。ε-聚赖氨酸添加于食品中仅需微量就产生效果，且不会影响味感，可做食品的天然保鲜剂。它天然安全，符合消费者的健康需求。
对Nisin和聚赖氨酸这两种天然食品防腐剂进行大力研究和开发无疑具有广阔的应用前景，将会带来重大的经济效益和社会效益。
致 谢
首先要感谢我的导师袁秋萍老师在学习上对我的谆谆教导、工作上的关心和支持。在承担繁重事务的同时，仍对我们实验进行细心的指导。袁老师严谨的治学态度、敏锐的科学洞察力、渊博的学识给了我许多启迪，同时导师的言行也让我学会了许多做人的道理。
十分感谢我们一起做实验的赵巧灵、周丽娜和李锋同学，他们给了我很大的帮助，我们一起探讨课题，同时又给了很大的鼓励。还要感谢袁海娜老师给了我很大的帮助，帮我解决了不少实验中碰到的难题。还要感谢生化学院所有曾经教导过、帮助过我的老师和同学们，更要感谢默默支持着的我的家人，他们一直给予我鼓励、帮助、理解。今后我将更加努力，
取得更大的成绩。
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