枯草芽孢杆菌微胶囊的功能选择

1 绪论
微胶囊技术是指以天然或合成的高分子材料作为囊壁，通过化学法、物理法或物理化学法将固体或液体材料包囊成直径为1-5000µm [1]的微小囊状物的技术。微胶囊的优势在于形成微胶囊时，囊心被包覆而与外界环境隔离，它的性质几乎能毫无影响的被保留下来，微囊的囊膜具有透膜或半透膜的特性，因此其所包含的囊心物质可借压力、pH值、酶解、温度或提取等一系列方法完全释放出来[2—3]。
1.1 微胶囊技术的作用[4—7]
无论物质具有亲水性还是具有亲油性，大多数气体、液体、固体、甚至具有生命活性的细菌、酶等均可以被包囊。广义地说，微胶囊具有改善和提高物质外观及其性质的能力。
上述功能使得微胶囊化成为许多工业领域中的一种有效的商品化方法，具体可主要分为7个方面。
1.1.1 改善物质的物理性质
    改变物质的状态:将液态物质或气态物质微胶囊化后，可得到微细的粉状物质，在外形及使用上具有固体特征，但其内部仍然是液体或气体，因而仍具有原来液体或气体的性质。
    改变物质的质量和体积：物质的表观密度经微胶囊化后可以变小，也可制成含有空气或空心的微胶囊而使体积增大。
    改变物质的性能：通过微胶囊化可以改变物质对所处介质的亲和性，常用的方法是将疏水性药物用亲水性壁材微胶囊化，使其变得亲水。
1.1.2 控制释放
在可以人为控制的条件下，微胶囊中活性组分的释放可以采用立即释放、延时释放等各种释放方式。
缓释：将一些药物或活性物质制成微胶囊后，不但方便口服或注射，更重要的是能使药物缓慢释放，使药效持久，从而可减少服用次数和服用量，减少生理副作用。
1.1.3隔离活性成分
微胶囊化后囊壁可以将囊内外物质隔离，故能阻止活性物质之间发生化学反应。在医药中，可将药物与其他敏感物质隔离，如红霉素遇酸易变质，微胶囊化后可在一定时间内避免与胃液接触，从而使其保持活性。
1.1.4 改善稳定性
易挥发、易氧化、光敏性和热敏性的物质经微胶囊化后，可避免直接与光、热或空气接触，抑制其挥发，氧化，降低光(热)敏性。有些物质很容易受氧气、温度、水分、紫外等各种环境因素的影响，通过微囊化，使囊心物与外界环境相隔离。在食品、化妆品和洗涤剂行业中，经常将香料、香精微胶囊化，以降低其挥发性，保持长久散发香气。
1.1.5降低对健康的危害、减少毒副作用
   硫酸亚铁、阿司匹林等药物包囊后可以通过控制向消化系统得释放速度来减轻肠胃副作用。长期服用氨节青霉素对人体有严重的副作用，微胶囊化可弥补这一缺陷；抗癌药物化疗剂一般用甲基乙二醛，但对人体毒性大，微胶囊化后可以迅速从体内排出，降低副作用。对于制药工业来说，就可以采用微胶囊技术来制造靶制剂，达到定向释放的效果。
1.1.6屏蔽味道和气味
微胶囊化可以用于掩饰某些化合物的令人不愉快地味道。抗生素磺胺类药物苦味太大，微胶囊化可掩盖其苦味。氨基酸有维持机体生长发育的氨平衡功能，能治疗肝病及乙基砷、苯中毒，但其奇特的臭味使人难以接受，微胶囊化后，就可掩盖其臭味将有色泽和气味的中草药液微胶囊化后，可以掩蔽服用时的不良味道。
1.1.7 用于特殊目的的不相容物质的分离
微胶囊化后可以隔离各种成分，阻止活性成分之间的反应。故可以将两者一起保存。但是当微胶囊破碎以后两者就能进行反应。可以达到某些特殊的目的。
1.1.8 菌体微胶囊的特点
对于制备菌体微胶囊，最主要的就是防止外界不良条件对菌体的破坏以提高菌体的稳定性，提高菌体的保存时间。一些菌体，在环境中受到不良环境的影响（紫外线、pH等）其存活率很低。而通过微胶囊技术可以将菌体与不良环境隔离，达到提高菌体稳定性的作用。
例如胃中的pH只有1.8左右，对枯草芽孢杆菌活性具有比较大的破坏。而制成微胶囊可以减少胃酸与菌体的接触，提高菌体的稳定性[8]。
另外通过微胶囊技术将菌体包埋，使得菌体某些不良的气味难以释放到外界，而达到容易口服等的效果。

1.2 微胶囊的制备方法
微胶囊制备方法通常根据其性质、囊壁形成的机制和成囊条件分为物理法、物理化学法、化学法等3大类[9]。在每大类方法中依据不同的操作工艺又可进一步分成若干种制备方法。各种制备方法都具有各自的特点、适用范围和适用对象，现将各种微胶囊制备方法归纳如表1所示。
表1 物理法制备微胶囊
方法               工艺特点               优缺点                适用范围
喷雾干燥法    芯材均匀分散于壁材溶液中，     优点：处理量大，     适于热敏性、疏水                                        
          经雾化器雾化成小液滴使溶液       适宜工业化生产     性、亲水性及与                                          
          壁材的溶剂迅速蒸发凝固成凝     缺点：包埋率低，     水反应的物质。                                                        
          固成微胶囊。                     设备大，价格高，                                     
                                           耗能大等。                      
喷雾冷却法   芯材均匀分散于壁材中，加热     优点：对水溶性风味物  敏感性物质、食品                                                                     
         熔融后迅速降温凝固成微胶囊。      质具有良好的缓释   添加剂、油脂等。                                                          
                                           和保护作用。                                
  挤压法      糖类物，然后通过压力将其挤   优点：防止风味物质挥发  适于热敏感性芯材   
              入冷却介质中，迅速脱水降温，                                                                                  
              形成玻璃态微胶囊。            缺点：产率低。                                                           
包络接合法  先将芯材与壁材各制成带相反    优点：干燥下产品稳定。  油脂等物质。                                           
         电荷的气溶胶微粒，而后使它                                                                           
         们相遇，通过静电吸引凝结成                                                                     
         微胶囊。                                                                             溶剂蒸发法  芯材、壁材依次分散于有机相      优点：操作方便，可以   适于非水溶             
        中，加热使溶剂蒸发，壁材析       大规模生产。          性聚合物对活                    
        出而成微胶囊。                                         性物质的包裹                             
物理化学法的共同特点是改变条件使溶解状态的成膜材料从溶液中聚沉出来，并将囊心包覆形成微胶囊。即通过改变温度、pH值、加入电解质等，使溶解状态的成膜材料从溶液中聚沉，并将芯材包覆形成微胶囊。凝聚法又称相分离法，根据芯材的水溶性不同可分为水相分离法;依据凝聚机理的不同又分为单凝聚法和复凝聚法。化学方法和物理化学方法一般通过反应釜即可进行，因此应用较多，见表2。

表2 物理法制备微胶囊
方法                工艺特点                    优缺点            适用范围
界面聚合法     将两种带有不同活性基团  优点：包封率高，能很好的  适于活性物                                                            
                  的单体分别溶解在互不相        保护活性物质。      质。                                          
                  溶的溶剂中，当一种溶液  缺点：要求被包裹物能耐酸                                                       
                  被溶解在另一种溶液中时，      碱性，不能与单体发                                                   
                  两种溶液中的界面会形成        生反应，并对多余单                                                 
                  聚合物膜 。                    体要认真对待。                                    
   原位聚合法     单体、引发剂或催化剂以  缺点：要求单体是可溶的，  适于气态、液                                                             
                  原位处于介质中，加入单        而聚合物是不可溶的。态，水溶性和                                    
                  体的非溶剂使单体沉积在                           油溶性的单体                 
                  原位颗粒表面上，引发聚                                              
                  集形成微胶囊。                                                         
   锐孔法         聚合物溶解，加入活性物  优点：操作简单，不使用有  适于对紫外光                                                                      
                  质分散其中，将分散液用        溶剂。无需高速搅拌，敏感的物质。                                                               
                  锐孔装置加到另一液体中        微胶囊机械性好。                                                          
                  胶囊析出。                                                                    

1.2.1微胶囊芯材
芯材是微胶囊中起主要功能的物质。它可以是单一的固体、液体或气体，也可以是固一液、液一液、固一固或气一液混合物。根据不同的行业，不同的用途，芯材有不同的选择。它可以是化工产品、医药用品，也可以是食品添加剂或是食品的天然组份。现己用作芯材的物质有：胶粘剂、催化剂、除垢剂、增塑剂、稳定剂、油墨、涂料、染料、颜料、溶剂、液晶、金属单体、油脂、香料等。微生物作为一类特殊的活性物质，也开始广泛用于芯材，发挥其特有的功效。表3为常用的微胶囊的芯材[10]。

表3 常用的囊芯材料
类别                                    物质
食品                              油、脂肪、调味品、香料
药物                              阿司匹林、维生素、氨基酸
香料                              香精、薄荷油、专用组分
农药                              杀虫剂、除草剂、肥料
色素                              燃料颜料、无碳复写纸的无色染料
生物品                  细胞、酵母、酶、血红蛋白、病毒、纤维素
其他                    相变材料、无机粉体、金属、粘土、纤维素

1.2.2壁材（囊材）
制作微胶囊可用的壁材很多，一般为天然高分子材料或有机合成材料，可以是亲水性的或疏水性的高分子材料，也可以是无机化合物。这些材料的最大特点是具有一定的成膜性，且在常温下比较稳定[11]。表4为常用的壁材[12]。
表4 常用的囊材材料
类别                  物质                       优势
天然高分子材料        明胶、阿拉伯胶、淀粉、果胶     稳定性好、成膜性好、生
                      糊精、海藻酸钠盐、糖类         物相容性好、力学性能差
合成高分子材料        羧甲基纤维素、甲基纤维素、    
                      乙基纤维素、聚乙烯、聚苯乙      成膜性好、化学稳定性好、
烯、聚醚、聚脲、聚乙二醇、     生物相容性差
聚乙烯醇、聚酰胺、聚丙烯酰
胺、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯    成膜性好、化学稳定性好、
无机材料              铜、镍、银、吕、硅酸盐、玻璃、 生物相容性差
                      陶瓷 
天然高分子材料是最常用的囊材与载体材料，因其稳定、无毒、成膜性或成球性较好。目前在饲料行业应用较多的有明胶、海藻酸、氢化植物油等。
(1)明胶：明胶是氨基酸与肤交联形成的直链聚合物，通常平均相对分子质量在1500-2500之间。可生物降解，几乎无抗原性，用作微囊的用量为20-100g/L，用作微球的量可达200g/L以上。
(2)海藻酸盐：系多糖化合物，常用稀碱从褐藻中提取而得。海藻酸钠可溶于不同温度的水中，不溶于乙醇、乙醚及其它有机溶剂；不同相对分子质量的粘度有差异。可与甲壳素或聚赖氨酸合用作复合材料。因海藻酸钙不溶于水，故海藻酸钠可用CaCl2固化成微胶囊。
(3)蛋白类：常用作载体材料的有白蛋白(如人血清白蛋白、小牛血清白蛋白)、玉米蛋白(玉米肮)、鸡蛋白、小牛酪蛋白等，可生物降解，无明显的抗原性，常采用加热固化或化学交联剂(如甲醛、戊二醛或丁二烯)固化，通常用量在300g/L以上。
(4)氢化植物油：以植物来源的油，也包括从鱼和其它动物来源的油经过精制、漂白、氢化脱色和除臭喷雾干燥得。在药剂中起润滑、缓释作用[13]。半合成高分子多系纤维素衍生物，如梭甲基纤维素、邻苯二甲酸纤维素等。其特点是毒性小、粘度大、成盐后溶解度增大；由于易水解，故不宜高温处理，需临用时现配。现在市面上用的较多的是乙基纤维素。
合成高分子材料常用的有两类，可生物降解和不可生物降解的。近年来，可生物降解并可生物吸收的材料受到普遍的重视并得到广泛的应用。如聚氨基酸、聚乳酸、聚丙烯酸树脂等。
在选择壁材时还要考虑壁材本身的性能，如渗透性、稳定性、机械强度、溶解性、可聚合性、电性能、吸湿性及成膜性等，对于生物活性物质的芯材，还要着重考虑壁材的毒性，与芯材的相容性。此外，微胶囊的制备，以天然高分子材料作壁材制备微胶囊的很多，这类壁材具有无毒、成膜性或成球性较好、免疫原性低、生物相容性好、可降解且产物无毒副作用等优点，其资源丰富、制备简单、价格便宜，极具开发潜力，因此，它是目前最常用的微胶囊制备材料。
1.2.3微生物微胶囊
从20世纪80年代开始就有研究者进行微生物细菌微胶囊的探索，研究较多的细菌有双歧杆菌、乳酸菌、苏云金杆菌、白僵菌等。目前，国内外已经有多种微胶囊化技术应用在微生物领域，主要包括:
(1)锐孔一凝固浴法[14]
革兰氏阴性菌微胶囊制备技术的研究国外利用锐孔一凝固浴法制备，最早主要是海藻酸钙的单层包埋，逐渐发展成为多层包埋。
(2)流化床包膜法
将菌体浓缩液或经冷冻干燥后的干菌粉通过挤压制成球状干颗粒，在流化床上用肠溶性材料(海藻酸钠等)喷雾涂膜，产品室温贮藏时涂膜的比未涂膜的存活率高40倍，在低pH下贮藏时涂膜的存活率也较高。
(3)熔化分散冷凝法
例如将双歧杆菌菌粉分散于融点高于体温的硬化油中，搅拌均匀后喷雾，能够得到一定粒径，且菌体较稳定的微胶囊。
(4)乳化交联法
例如将双歧杆菌冻干粉与壳聚糖溶液混匀，并悬浮于大豆色拉油中(以SPan85为乳化剂)，乳化后加入对苯二甲酞氯交联反应，制备了双歧杆菌微胶囊[15]。
(6)喷雾干燥法
喷雾干燥是食品工业应用最为悠久、最为广泛，也是成本极为廉价的一种微胶囊方法。不少研究也尝试了应用于益生菌的微胶囊化。例如在魏华等[16-17]喷雾干燥微胶囊化保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的研究中，喷雾干燥的同时形成微胶囊有利于提高菌体在喷雾干燥过程中的性，从而提高活菌存活率，达到78%；而且喷雾干燥的微胶囊产品活菌数随保藏时降的速度缓慢，活菌保存期显著延长。
(7)吸附法
以淀粉和碳酸钙粉末吸附微囊化的双歧杆菌在干燥过程中死亡率明显下降，在室温条件下保存其存活率比未微囊化的有较大提高[16]。
(8)原位聚合法
袁青梅等[18]以蜜胺树脂作为囊壁材料，使用原位聚合法对生物农药阿维菌素进行制备微胶囊制剂.结果表明蜜胺树脂是较好的生物农药用微胶囊缓释剂型的囊壁其制备工艺简单，具有良好的的外观形貌、粒径大小分布、稳定性、悬浮性等，包封83.24%， 与未经包囊的阿维菌素相比具有良好的缓释性能。
(9)双层包埋法(复凝聚法)
陈健凯等[19]采用双层包埋法，以牛奶蛋白为内层包埋剂，卡拉胶和刺槐豆胶为包埋剂对嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌进行双层包埋。乳酸菌在pH=2.1胃酸环境的存包埋嗜酸乳杆菌为87%，包埋干酪乳杆菌为90%，未包埋乳杆菌不耐强酸，几乎全部死亡。包埋乳酸菌加入到酸奶中，在储藏期的第9天，包埋嗜酸乳杆菌存活率为57%，包埋干酪乳杆菌存活率为50%，而是热链球菌存活率为3.2%，保加利亚乳杆菌存1.3%。显示出包埋后的乳酸菌稳定的生物活性。
1.2.4 枯草芽孢杆菌介绍
枯草芽胞杆菌( B a c i l l u s  s u b t i l i s )是一种自然界广泛存在的杆状，单细胞，无荚膜能运动的革兰氏阳性菌，芽胞小于或等于细胞宽，椭圆至圆柱状，中性或近中性，严格好氧。在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
枯草芽胞杆菌其作用的机理主要为消耗肠道内多余的氧，并能产生过氧化氢、细菌素，建立微生态平衡，促进有益厌氧微生物的繁殖，抑制有害细菌（大肠杆菌、沙门氏杆菌）的生长，从而预防腹泻、下痢等肠胃道疾病。
菌体在快速繁殖过程中，能产生大量多种维生素、有机酸、氨基酸、蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶等酶类，能降解植物性饲料中复杂的有机物，从而促进消化吸收，提高饲料利用率，防止动物消化不良，出现“饲料便”等状况发生[20]。
由于枯草芽孢杆菌以上作用，其在动物饲料添加剂中的研究和应用，一直都是畜牧、水产养殖业科研和生产人员关注的焦点。
随着人们对饲料中添加抗生素作为生长促进剂的弊端认识的加深, 作为饲用抗生素替代品的益生菌制剂受到了众多关注并获得了广泛的应用。由于饲料加工及贮运过程中对菌体的灭活作用, 近年来研究热点都集中在如何提高益生菌制品的稳定性上 [21]。
    通过不断的科学研究发现，将菌体微胶囊化能够很大程度的提高菌体的稳定性。经过微胶囊化后的枯草芽孢杆菌在外界同样条件下能够保持较高的菌体稳定性和活性。

2 实验部分
本实验所涉及到的主要实验材料见表5，实验仪器见表6 实验仪器

表5 实验材料
试剂               纯度                        生产厂家
明胶              化学纯                国药集团化学试剂有限公司
海藻酸钠          化学纯                福建泉州市全港化工厂
壳聚糖            化学纯                浙江大学微生物实验室提供
黄原胶            化学纯                浙江大学微生物实验室提供
吐温 80           分析纯                上海化学试剂有限公司
Span 85           化学纯                国药集团化学试剂有限公司
无水氯化钙        分析纯                中国衢州巨化试剂有限公司
磷酸氢二钾        分析纯                上海化学试剂有限公司
无水硫酸钠        分析纯                上海化学试剂有限公司
甲醛              37-40%                国药集团化学试剂有限公司
冰乙酸            >99.5%                国药集团化学试剂有限公司
硫酸锰            >99.0%                天津市博迪化工有限公司
孔雀石绿                                中国上海标本模型厂

表6 实验仪器
仪器              型号                        生产厂家
数显恒温水浴锅        HH-4                 上海精风仪器有限公司
恒温磁力搅拌器        85-2                 上海志威电器有限公司
 生化培养箱            SPX-250              上海跃进医疗器械厂
恒温培养振荡器        SKY-2100C            上海苏坤实业有限公司
电热鼓风干燥箱        GZX-9023MEB          上海市实验仪器总厂
电子天平              BS-110S              北京赛多利斯天平有限公司
洁净工作台            SB-JC-LB-Z     上海博讯实业有限公司医疗设备厂     
生化培养箱            SPX-250B-Z     上海博讯实业有限公司医疗设备厂
立式压力蒸汽灭菌器    YXQ-LS-SII     上海博讯实业有限公司医疗设备厂
生物显微镜            XSD—9               上海光学仪器厂

2.1 菌种
本实验所使用的菌种——枯草芽孢杆菌，由浙江科技学院微生物实验室提供——斜面、半固体保藏菌种。
2.2 培养基
斜面培养基：牛肉膏3g；蛋白胨10g；氯化钠5g；琼脂20g；水1000ml；pH7.0-7.2。
平板培养基：牛肉膏3g；蛋白胨10g；氯化钠5g；琼脂20g；水1000ml；pH7.0-7.2。
液体培养基：牛肉膏3g；蛋白胨10g；氯化钠5g；水1000ml；pH7.0-7.2。
促芽孢培养基：
：土壤浸出液1000mL；牛肉膏6g；蛋白胨5g；pH7.0-7.2[24]。
：蛋白胨10g；氯化钠3g；水1000ml；MnSO4 2.0g；pH7.0-7.2。
：牛肉膏12g；氯化钠5g；水1000ml；MnSO4 0.5g；pH7.0-7.2。
2.3 微胶囊芯材制备
实验分别制备了枯草芽孢杆菌固体粉末以及枯草芽孢杆菌芽孢固体粉末作为制备微胶囊的芯材。
2.3.1 菌种芯材制备
取保藏备用的试管斜面菌种接种于试管斜面培养基上活化备用，活化后接入平板培养基。为了获得大量的菌体，将平板上的菌体刮下接种到液体培养基（250ml锥形瓶），在200r/min，37℃条件下摇床培养2d。离心（5000r/min）获得菌体，并在鼓风干燥箱30℃条件下烘干，制得枯草芽孢杆菌菌体干粉备用。
2.3.2芽孢芯材制备
将活化后的菌株分别接种于促芽孢液体培养基中。在200r/min，37℃条件下摇床培养2d。离心（5000r/min）获得菌体，并在鼓风干燥箱30℃条件下吹干，制得枯草芽孢杆菌芽孢干粉备用。
2.4  微胶囊的制备方法
为了比较不同方法制备得到的微胶囊的性能，本实验分别采用锐孔法以及倾注法制备单凝聚微胶囊和复凝聚微胶囊[25]。
2.4.1 单凝聚法制备微胶囊
以明胶作为囊材
称取一定量的明胶用去离子水泡胀，并于50℃水浴下溶解，将0.1g枯草芽孢杆菌固体粉末加入到明胶水溶液中，搅拌形成乳化分散体系。保持体系温度为50℃,用10%醋酸溶液调节体系的pH为3.5-3.8，然后向体系缓缓加入20%浓度的硫酸钠溶液[26]。
锐孔法：待溶液冷却到30℃后，吸取溶液并用注射针头将溶液滴入到10%浓度的5℃的甲醛溶液中。
倾注法：待溶液冷却到30℃后，吸取溶液并将其喷雾到10%浓度的5℃的甲醛溶液中。
将得到的微胶囊用水洗除去甲醛，即得到成品微胶囊。
以壳聚糖为囊材
吸取1ml的乳化剂吐温80于含有100ml去离子水的烧杯中，温度保持在50℃。称取一定质量的壳聚糖加入上述的烧杯中，用10%的乙酸溶液溶解配置成溶液，加入0.1g枯草芽孢杆菌固体粉末混合均匀[27]。
锐孔法：吸取混合均匀后的混合液，用不同孔径大小的针头将其分别滴入Na2SO4、K2HPO4溶液中固化。
倾注法：吸取混合均匀后的混合液，将其分别喷入20%浓度的Na2SO4和20%浓度的K2HPO4溶液中固化。
以海藻酸钠为囊材
   吸取1ml的乳化剂吐温80于有100ml去离子水的烧杯中，温度保持在60℃。称取一定质 量的海藻酸钠加入上述烧杯中配制成溶液，加入0.1g枯草芽孢杆菌固体粉末混合均匀 [28]。
锐孔法：以CaCl2作为固化剂，吸取混合均匀后的混合液，用不同孔径大小的针头将其分别滴入1.5M的CaCl2溶液中固化。
倾注法：吸取混合均匀后的混合液，将其分别喷入CaCl2溶液中固化。
„以黄原胶为囊材
吸取1ml乳化剂吐温80到烧杯中，加入100ml去离子水，温度保持在60℃。称取一定质量的黄原胶加入烧杯中配置成溶液，加入0.1g枯草芽孢杆菌粉末混合均匀。
锐孔法：以CaCl2作为固化剂，吸取混合均匀后的混合液，用不同孔径大小的针头将其分别滴入CaCl2溶液中固化。
倾注法：吸取混合均匀后的混合液，将其分别喷入CaCl2溶液中固化。
⑤以琼脂作为囊材
配置不同浓度的琼脂溶液，待冷却到50℃后加入0.1g菌体粉末/芽孢混匀。分别用锐孔法、倾注法制备微胶囊。
锐孔法：将混合液用不同孔径大小的针头滴入到冰水中。
倾注法：吸取混合液，将其喷入冰水中。
2.4.3 复凝聚法制备微胶囊
通过单因子试验获得了单凝聚法制备微胶囊的数据，通过分析发现微胶囊的机械性能有待进一步改进，为了提高微胶囊的机械性能和菌体的稳定性能，选择两种或者两种以上囊材来制备微胶囊。
壳聚糖与黄原胶组合
配置不同浓度的壳聚糖溶液和黄原胶溶液，等体积混合均匀后加入0.1g枯草芽孢杆菌固体粉末混合均匀，并分别以锐孔法和倾注法制备微胶囊。以Na2SO4作为固定剂。
壳聚糖与海藻酸钠组合
配置不同浓度的壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液，等体积混合后加入0.1g枯草芽孢杆菌粉末，以CaCl2为固化剂，并分别以锐孔法和倾注法来制备微胶囊。     
海藻酸钠与明胶组合
配置不同浓度的海藻酸钠和明胶溶液，等体积混合均匀后加入0.1g枯草芽孢杆菌粉末。以CaCl2为固化剂，并分别以锐孔法和倾注法来制备微胶囊。
„明胶与黄原胶、海藻酸钠组合
配置不同浓度的黄原胶、明胶、海藻酸钠溶液，将黄原胶与明胶等体积混合后加入等体积的海藻酸钠。以CaCl2为固化剂，并分别以锐孔法和倾注法来制备微胶囊。
2.5 微胶囊品质检验方法
包埋率=〔a-b〕/a×100%                        公式（1） [29-30]
式中： a—制备微胶囊前溶液中细菌的浓度
      b—微胶囊制备后所测得固定剂中菌体的浓度。
微胶囊直径测定方法：
倾注法微胶囊粒径测定方法：在光学显微镜下，取微胶囊用显微测微尺随机测定20颗微胶囊粒径，并取其平均值即为粒径( 单位为µm)。
锐孔法微胶囊粒径测定方法：用精度为1mm的直尺测量，随机测取20颗微胶囊的直径，并取其平均值( 单位为mm)。
活菌数测定方法：分别测定微胶囊化枯草芽孢杆菌活菌数和未经微胶囊化的活菌数。
测定微胶囊化的活菌数：称取0.1g微胶囊粉碎，置于10ml生理盐水中。稀释一定的倍数后涂平板测定活菌数[31]，并做3次平行试验。
测定未微胶囊化的活菌数：在平板上取菌，并置于10ml生理盐水中。稀释一定的倍数后涂平板测定活菌数，并做3次平行试验取平均值。

3 实验结果与讨论
3.1 芯材的选择
3.1.1促芽孢培养基的优化
为了提高枯草芽孢杆菌在制备微胶囊以及保存过程中的稳定性，选择使用枯草芽孢杆菌芽孢作为微胶囊的芯材。
实验对三种促芽孢培养基：
：土壤浸出液1000mL；牛肉膏6g；蛋白胨5g；pH7.0-7.2。
：蛋白胨10g；氯化钠3g；水1000ml；MnSO4 2.0g；pH7.0-7.2。
：牛肉膏12g；氯化钠5g；水1000ml；MnSO4 0.5g；pH7.0-7.2。
进行了实验分析。通过实验观察以及每6小时一次的芽孢染色发现促芽孢培养基对促进枯草芽孢杆菌产芽孢没有明显的效果；促芽孢培养基在接种24小时候才明显有菌生长，而且促产芽孢能力也不强；促芽孢培养基能够非常有效地促进枯草芽孢杆菌产芽孢，详见表7。
通过表7得到促芽孢培养基：牛肉膏12g；氯化钠5g；水 1000ml；MnSO4 0.5g；pH7.0-7.2，能够非常有效地促进枯草芽孢杆菌具体的生长以及促进芽孢的产生。在培养12h后就有75%的菌体产生了芽孢。

表7不同培养基促产芽孢比较（以芽孢率表示）
培养基\培养时间\h       6      12      18      24     30     36
牛肉膏蛋白胨培养基                      7%     30%     55%    70%
号促芽孢培养基                        15%     50%    60%    70%
号促芽孢培养基                        30%     40%    60%
号促芽孢培养基                50%     75%     80%    90%    90%
注：芽孢率——芽孢染色后随机选取5个视野，计算芽孢数量和菌体数量并各取平均值。芽孢数/（菌体数+芽孢数）即为芽孢率。
3.1.2  芯材的选择
     芽孢与菌体相比，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。而实验也证明了选择枯草芽孢杆菌芽孢作为枯草芽孢杆菌微胶囊的芯材也提高了菌体在制备、保存等过程中的稳定性。
在实验过程中，分别比较了枯草芽孢杆菌菌体和芽孢在制备过程中对制备操作的影响。通过实验比较，在制备过程中使用的芯材都是菌体和芽孢的固体粉末，外观等性质几乎相同，对制备过程中各个环节的影响几乎没有明显的区别。
通过微胶囊稳定性的比较以及制备过程中菌体和芽孢对制备的影响等综合因素的考虑得出：选择枯草芽孢杆菌芽孢作为枯草芽孢杆菌微胶囊的芯材有利于提高微胶囊中菌体的稳定性，延长保存时间。
3.2 固定剂的选择
实验分析了不同浓度的固化剂：甲醛、Na2SO4、K2HPO4、CaCl2对微胶囊机械性能的影响。通过实验发现：
以明胶作为囊材时，以10%甲醛作为固化剂最佳。在高于10%浓度情况下固话效果有一定的提高。但是在材料使用、去除微胶囊表面甲醛等因素综合影响下，选择10%浓度的甲醛作为固化剂最佳。
以壳聚糖桑为囊材时，以20%的K2HPO4作为固化剂制备得到的微胶囊较均一，以20%的Na2SO4作为固化剂制备得到的微胶囊颗粒，机械性能较差，且不均一。
分别以海藻酸钠、黄原胶为囊材时，1.5M CaCl2的固话效果最佳。以壳聚糖和黄原胶作为囊时，以20%的K2HPO4作为固化剂的效果最佳，制备得到的微胶囊比较均一。
3.3包埋率的测定
实验中分别利用锐孔法和倾注法制备微胶囊。通过测定包埋前后菌体的数量来测定所制得的微胶囊的包埋率。其中分别测定了以黄原胶、琼脂、壳聚糖等几种高分子材料为囊材制备得到的微胶囊的包埋率。分别对比了各组倾注法和锐孔法制备 得到微胶囊包埋率的区别。并以囊材浓度为横坐标，包埋率为纵坐标作图分析。

 
图1 黄原胶为囊材微胶囊包埋率
由图1可以得到，黄原胶浓度在0.1-1.5%之间时，随着囊材浓度的升高微胶囊的包埋率也随之提高。且锐孔法包埋率高于倾注法得到微胶囊的包埋率。

 
图2 琼脂为囊材微胶囊包埋率
    由图2得到琼脂浓度为40%时得到的包埋率较20%和30%高，且锐孔法的包埋率高于倾注法制备得到微胶囊的包埋率。
 
图3 明胶为囊材微胶囊包埋率
由图3可以得到锐孔法的包埋率高于倾注法，且在2.0-5.0%浓度之间随着浓度的提高包埋率随之提高。

 
图4 海藻酸钠为囊材微胶囊包埋率
    由图4得到以0.5-2.0%浓度海藻酸钠为囊材制备得到的微胶囊包埋率随着浓度的升高而升高，且锐孔法包埋率高于倾注法。
 
图5 壳聚糖为囊材微胶囊的包埋率
通过实验分析得到图5，由图5得到当壳聚糖浓度超过3.0%时，溶液粘度较高使用倾注法制备微胶囊时得到的微胶囊形状、粒径很不均一。当浓度超过4.0%时由于溶液粘度高而无法使用倾注法制备微胶囊。
通过图1-图5可以明显的看到，在实验使用的囊材浓度范围内，单凝聚法制备得到的微胶囊随着囊材浓度的升高其包埋率可以得到提高。而且锐孔法制备得到的微胶囊包埋率要高于倾注法制备得到的微胶囊。
实验也分析了复凝聚法制备得到微胶囊的包埋率，实验最终得到6组较好的实验结果。为别为:
1.壳聚糖2.0%+黄原胶0.5%；2.壳聚糖2.0%+海藻酸钠0.5%；3.黄原胶0.5%+海藻酸钠0.7%+明胶2.0%；4.海藻酸钠0.5%+明胶4.0%；5.黄原胶0.5%+海藻酸钠1.0%；6.壳聚糖2.5%+黄原胶0.3%。图6为相对应各组的包埋率。
 
图6 复凝聚法微胶囊的包埋率
由图6也可以看到锐孔法制备得到的微胶囊包埋率要高于倾注法，其中第2组（2.0%壳聚糖+0.5%海藻酸钠）和第6组（2.5%壳聚糖+0.3%黄原胶）包埋率最高，分别是76%和78%。
3.4 微胶囊粒径观察
倾注法制备得到的微胶囊在光学显微镜下随机测定微胶囊的粒径，并取20次测得粒径的平均值作为该微胶囊的粒径。
锐孔法制备得到的微胶囊使用直尺（精度1mm）来测定粒径，并取20次测定得到的平均值作为粒径。
3.4.1单凝聚法制得微胶囊粒径的测定
3.4.1.1 锐孔法微胶囊粒径分析
 
图7 壳聚糖为囊材锐孔法微胶囊粒径变化趋势
    由图7得到1.5%壳聚糖制备得到的微胶囊粒径在3.8-4.4mm之间波动；2.0%壳聚糖制备得到的微胶囊粒径在3.6-4.3mm之间波动；2.5%壳聚糖制备得到的微胶囊粒径在2.8-3.5mm之间波动。并且随着壳聚糖浓度的升高粒径有减小的趋势。
 
图8黄原胶为囊材锐孔法微胶囊粒径分析
    由图8得到浓度为0.3%和0.5%黄原胶制备得到的微胶囊粒径分别在1.9-2.6mm和1.6-2.3mm之间波动，而且随着浓度的升高粒径减小。
 
图9海藻酸钠为囊材锐孔法微胶囊粒径分析
    图9得到浓度为0.5%和1.0%的海藻酸钠制备得到的微胶囊粒径分别在2.1-3.0mm和1.8-2.6mm之间波动。同时随着浓度的升高粒径减小。

3.4.1.2 倾注法微胶囊粒径分析
 
图10壳聚糖为囊材倾注法微胶囊粒径分析
    图10得到1.5%和2.0%浓度壳聚糖制备得到的微胶囊粒径分别在17-25µm和13-17µm之间波动。
 
图11黄原胶为囊材倾注法微胶囊粒径分析
    由图11得到0.3%和0.5%浓度黄原胶制备得到的微胶囊粒径在15-25µm和9-21µm波动。0.5%黄原胶制备得到的微胶囊粒径波动范围较大。
 
图12海藻酸钠为囊材倾注法微胶囊粒径分析
    由图12得到0.5%和1.0%海藻酸钠制备得到的微胶囊粒径在6-9µm和8-18µm之间波动。而且1.0%海藻酸钠制备得到的微胶囊粒径较0.5%海藻酸钠的大，波动范围也较大。
 
图13明胶为囊材倾注法微胶囊粒径分析
与图10-12相比图13得到的以明胶为囊材得到的微胶囊粒径较大，浓度为3.0%和4.0%明胶制备得到的微胶囊粒径在30-48µm和29-41µm之间波动，且波动范围较大。
通过实验及分析，由图7-13得到囊材在一定浓度范围内随着浓度的升高粒径反而减小（除以倾注法制备得到的海藻酸钠微胶囊）。

3.4.2复凝聚法制得微胶囊粒径测定

表8 微胶囊粒径的观察
材料                                    浓度%
壳聚糖                 2.0                   2.5
黄原胶                 0.5       0.5         0.3
海藻酸钠                         1.0                   0.5
明胶                                                   4.0
锐孔法直径mm        3.0-4.4    1.5-2.3    3.1-4.2   1.3-2.5
倾注法直径µm        15-30       10-20      20-30

由图7-13和表8得到实验结果：锐孔法和倾注法相比，倾注法能够制备几微米到几十微米大小的微胶囊，而锐孔法制备得到的粒径较大。但是通过改变锐孔法的滴加装置，在装置内部施加高压等都可以制备粒径微小的微胶囊。
锐孔法制备得到的微胶囊比倾注法制备得到的微胶囊包埋率要高。其主要原因是锐孔法制备得到的微胶囊粒径较大，而倾注法制备得到的微胶囊粒径小。在相同质量的情况下倾注法制备得到的微胶囊表面积总和较大，菌体（芽孢）粘附囊材表面而未被包埋的数量就会增多，从而造成了倾注法制备得到的微胶囊包埋率较低。
3.5 微胶囊稳定性的分析
3.5.1微胶囊稳定性
将以壳聚糖、明胶、海藻酸钠、黄原胶等为囊材制备得到的微胶囊分别通过两种方法保存。并通过实验分析微胶囊的稳定性。
3.5.1.1 固化剂中保存
将制备得到的微胶囊保存在固化剂中（明胶微胶囊保存在水溶液中），每隔一周观察一次。实验发现以壳聚糖、海藻酸钠、黄原胶、琼脂为囊材制备得到的微胶囊在保存三个月之后外观、机械性能都没有明显的变化。而明胶为囊材制备的微胶囊其微胶囊表面以及固定剂中有大量的菌体生长，部分明胶已经被消耗，不适合长期保存。

3.5.1.2 干燥环境保存
将制备得到的微胶囊至于鼓风干燥箱中，30℃处理24小时，得到干燥的微胶囊，每周观察一次。
实验发现在30℃处理24小时后，微胶囊由于脱水粒径明显缩小，只有原来的50-70%左右。通过三个月的观察发现各种材料制得的微胶囊在机械性能、外观上面都没有明显的变化。
3.5.2微胶囊化枯草芽孢杆菌的稳定性
在实验过程中各种材料的性质、浓度、制备方法、制备条件都会影响微胶囊的制备。从微胶囊的制备方法，微胶囊的机械性能，微胶囊的稳定性等这几个方面综合考虑，分别选择：壳聚糖2.0%；壳聚糖2.5%；壳聚糖2.0%+黄原胶0.5%；这三组为囊材所制备得到的微胶囊来分析经过微胶囊化与没有经过微胶囊化的枯草芽孢杆菌（芽孢）的稳定性，见表9-1 1。（单位：107/g-1）

表9  壳聚糖2.0%，微胶囊化与未胶囊化稳定性的比较
条件\处理条件                                  60°C
                                         起始     3d      7d     10d      15d      20d
微胶囊化（锐孔法）活菌个数/107个/g-1     1.7      1.6      1.5     1.4      1.3     1.3
微胶囊化（倾注法）活菌个数/107个/g-1     1.3      1.3      1.1     1.0      1.0     1.0                    
未微胶囊化活菌个数/107个/g-1             47       7.8      6.4     6.0      5.9     4.7  

表10  壳聚糖2.5%，微胶囊化与未胶囊化稳定性的比较
条件\处理条件                                  60°C
                                         起始     3d      7d     10d      15d      20d
微胶囊化（锐孔）活菌个数/107个/g-1       2.4      2.3      2.0     2.0      1.8     1.8
微胶囊化（喷雾）活菌个数/107个/g-1       2.1      2.1      2.0     1.9      1.9     1.7                       
未微胶囊化活菌个数/107个/g-1             47       7.8      6.4     6.0      5.9     4.7   

表11  壳聚糖2.0%+黄原胶0.5%，微胶囊化与未胶囊化稳定性的比较
条件\处理条件                                        60°C
                                         起始     3d      7d     10d      15d      20d
微胶囊化（锐孔）活菌个数/107个/g-1       2.3      2.2     2.1     2.0      1.8      1.8
微胶囊化（喷雾）活菌个数/107个/g-1       1.9      1.8     1.7     1.7      1.7      1.6                       
未微胶囊化活菌个数/107个/g-1             47      7.8      6.4     6.0      5.9      4.4

通过表9-11可以发现经过微胶囊化得枯草芽孢杆菌在保存20天后活性仍然很高，存活率分别为76.5%、76.9%、75.0%、80.9%、78.3%、84.2%，平均存活率在75%以上。而未经微胶囊化得枯草芽孢杆菌在保存7天后只存活了13.6%，20天后存活率只有9.36%。
通过以上实验说明枯草芽孢杆菌经过微胶囊化处理后稳定性有了非常大的提高。
3.6 乳化剂的影响
在以壳聚糖、海藻酸钠、黄原胶为囊材制备微胶囊时，研究了乳化剂span 85对制备的影响。实验得到用锐孔法和倾注法制备微胶囊时，添加span 85后使溶液的粘度降低可制得较高浓度囊材的微胶囊。且制得的微胶囊粒径较小，形状较稳定。
3.7 微胶囊产品图片展示
    实验制备了大量的微胶囊，对其进行了机械性能、包埋率、微胶囊稳定性以及菌体稳定性等多因子的分析。
3.7.1锐孔法制备得到的微胶囊
    
图14  壳聚糖2.0% 微胶囊            图15 壳聚糖2.5%微胶囊
图14是利用2.0%壳聚糖为囊材制备得到的微胶囊，平均粒径为4.0mm，图15是利用2.5%壳聚糖为囊材制备得到的微胶囊，平均粒径为3.4mm。
由图15可以得到以2.5%壳聚糖为囊材制备得到的微胶囊粒径较一致，微胶囊的颜色较均一。而图14所示微胶囊粒径在3.6-4.3mm之间浮动，颜色不够均一。
   
    
图16  海藻酸钠0.5% 微胶囊         图17  黄原胶0.5%微胶囊
    图16、图17分别是以0.5%海藻酸钠和0.5%黄原胶为囊材制备得到的微胶囊。以0.5%黄原胶为囊材制备得到的微胶囊颜色均一，但是粒径不够均一。以0.5%海藻酸钠为囊材制备得到的微胶囊粒径均一性较好。
 
图18  2.0%壳聚糖+0.5%黄原胶微胶囊
    图18是以2.0%壳聚糖和0.5%黄原胶为囊材用复凝聚法制备得到的微胶囊。所得微胶囊颜色均一，粒径在3.0mm到4.4mm之间。

3.7.2倾注法制备得到的微胶囊
     
图19  4.0%明胶微胶囊                 图20 1.0%海藻酸钠微胶囊 
图19是以4.0%明胶为囊材制备得到的微胶囊。所制备得到的微胶囊机械能较差，颜色不均一，微胶囊的形状不规则。图20是以1.0%海藻酸钠为囊材制备得到的微胶囊，粒径在8-18µm之间。部分微胶囊颗粒聚集成团。
    
图21  1.5%壳聚糖                          图22  2.0%壳聚糖
图21、图22分别是以1.5%和2.0%壳聚糖为囊材制备得到的微胶囊。其中2.0%壳聚糖为囊材制备得到的微胶囊颜色较均一。以1.5%壳聚糖为囊材制备得到的微胶囊大部分聚集成团。
 
图23  0.3%黄原胶微胶囊
    图23是以0.3%黄原胶为囊材制备得到的微胶囊，所得微胶囊颜色均一且都都单个存在。
注：图20- 23皆为光学显微镜放大400倍条件下拍摄，其他为常规拍摄。

4 总结与展望
本文研究了采用锐孔法和倾注法制备微胶囊——枯草芽孢杆菌微胶囊。分别利用明胶、壳聚糖、海藻酸钠、黄原胶、琼脂等制备单凝聚以及复凝聚微胶囊。并从微胶囊的制备方法、包埋率、机械性能、微胶囊稳定性以及菌体稳定性等几个方面进行了研究分析。并优化促芽孢培养基，促进枯草芽孢杆菌产芽孢，利用抗逆性能更好的芽孢最为微胶囊的芯材，以提高微胶囊的菌体稳定性。通过实验分析得到以下结论：
1、通过枯草芽孢杆菌在几种培养基中的生长情况，以及利用孔雀石绿对枯草芽孢杆菌进行芽孢染色观察得到培养基：牛肉膏12g；氯化钠5g；水1000ml；MnSO4 0.5g；pH7.0-7.2，既能够使枯草芽孢杆菌迅速生长又能促进枯草芽孢杆菌产芽孢。在12小时就有75%的菌体产了芽孢。
2、分别利用枯草芽孢杆菌菌体和芽孢作为微胶囊的芯材来制备微胶囊，实验得到选择枯草芽孢杆菌芽孢作为制备微胶囊的芯材有利于提高微胶囊中菌体的稳定性，延长保存时间。
3、实验分别利用了锐孔法和倾注法制备枯草芽孢杆菌微胶囊，在现有的条件以及技术情况下，利用锐孔法制备得到的微胶囊粒径较大（1.5-5.0mm）而利用倾注法制备得到的微胶囊的粒径在3.0-45µm之间。在包埋率上面锐孔法制备得到的微胶囊比倾注法制备得到的微胶囊包埋率要高。
4、通过实验分析微胶囊的机械性能、包埋率、稳定性以及菌体稳定性等性能，得到：2.0%壳聚糖2.5%壳聚糖2.0%壳聚糖+0.5%黄原胶，这三组的综合性能最佳。
5、实验分析经过微胶囊化的枯草芽孢杆菌（芽孢）和未经微胶囊化的枯草芽孢杆菌的稳定性，得到经过微胶囊化的菌体在保存20天后菌体平均存活率在75%以上，而未经微胶囊化的菌体在相同条件下保存20天后存活率只有9.36%
目前实验室制备微胶囊主要材料为壳聚糖，但是壳聚糖价格昂贵。为了未来的大规模生产工业化生产，使用价廉易得的囊材如明胶、琼脂等来制备微胶囊将是今后主要探讨的。而因为利用两种或者两种以上的囊材使用复凝聚法制备微胶囊将能很大程度上提高微胶囊的机械性能以及菌体稳定性，也是下一步重点研究方向[32]。
目前流化床发、多孔分离法 都是工业化制备高性能微胶囊的方法[33]。随着生物材料和化工等技术的发展，以及微胶囊独特的性能和优点，微胶囊技术将会逐渐步入人们的日常生活。
同时，我们注意到，微胶囊在不同条件下的稳定性也是影响其性能与应用的重要因素，提高微胶囊的普适性，是扩大其应用范围的关键因素之一。在提高微胶囊的普适性的同时，我们也注意到，微胶囊以其独特的性质能适应一些特殊的环境，所以开发针对特殊环境的专用微胶囊应该也是今后工作重点之 一。

致谢
在浙江科技学院的四年马上就要划上一个句号。在这里感谢浙江科技学院的每一位教职工为学校建设的付出，以至于向我们提供了那么一个良好的学习、实践的平台。
本论文是在我的导师——徐晖老师的悉心指导下完成的，徐晖老师在我毕业设计的过程中多次亲临指导，并且也多次组织同学交流汇报自己的课题，让大家互相交流、互相学习。同时魏婄莲老师也对我实验过程中存在的问题进行了多次的指导，在此一并表示感谢。同时非常感谢浙江科技学院生化学院微生物实验室为我提供了良好的实验环境，感谢生化学院的老师对我的悉心指导。也非常感谢在微生物实验室里面的每一位同学，你们无论在生活还是学习上，都会向我伸出温软的热情之手，实验的结果也离不开他们的帮助和配合。
在这里还要感谢丁香园论坛、小木虫论坛中各位资深会员在我课题设计过程中，在论文写作中给我的意见以及建议。在我毕业设计的过程中你们的意见和建议给我带来很很大的帮助。
同样没有任何语言能够表达我对父母的感激之情，感谢你们对我倾注的无私的爱。祝你们健健康康。

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