姜黄素－壳聚糖纳米粒的制备过程全文

姜黄素－壳聚糖纳米粒的制备
学生姓名：汪颖颖        指导老师：黄娟
（浙江科技学院生物与化学工程学院）

摘要：制备姜黄素壳-聚糖纳米粒，并对其制备工艺进行考察。以壳聚糖(CS)作载体，与三聚磷酸钠(TPP)发生离子交联反应，把药物包裹在里面，制备具有缓释效能的姜黄素-壳聚糖纳米粒，并以载药量、颗粒粒径为指标，研究一系列壳聚糖纳米粒的制备影响因素，通过正交实验得出纳米粒的最佳制备工艺条件，并应用激光散射测定仪测定纳米粒的粒径分布。成功制备姜黄素-壳聚糖的纳米粒，平均粒径220nm，包封率10%左右，平均载药量30%。壳聚糖浓度、体系的pH值、TPP浓度，冻干保护剂是影响制备工艺的主要因素。
关键词：姜黄素；壳聚糖；纳米粒；三聚磷酸钠

Preparation of Curcumin-Chitosan Nanoparticles
Student’ s name: Wang Yingying   Advisor: Huang juan
（School of Biological and Chemical Engineering Zhejiang University of Science and Technology）

Abstract: To prepare Curcumin-chitosan nanoparticles and study their preparation method.  The drugs Curcumin- Chitosan(CS) Nanoparticles have been formed based on ionic gelation process of tripolyphosphate (TPP) and chitosan. Drug-loading rate and particle size as the indices to study a series of preparation effect factors of chitosan nanoparticles. The orthogonal experimental design applied to optimize the preparation procedure of the nanoparticles. The particle size distribution of nanoparticles was measured by laser scattering apparatus. The stable Curcumin-chitosan nanoparticles was prepared. Average size of 220 nm, Encapsulation efficiency 10%，Average Drug-loading rate 30%. Chitosan concentration, pH value of the system, Sodium Tripolyphosphate(TPP) concentration, Lyoprotectents are all the main effect factors of nanoparticles preparation.
Keywords:  Curcumin；Chitosan；Nanoparticles；Sodium Tripolyphosphate
 
目  录
中文摘要………………………………………………………………………………………… I
英文摘要 ……………………………………………………………………………………… II
目录  ………………………………………………………………………………………… III
1．绪论 ………………………………………………………………………………………… 1
    1.1 前言…………………………………………………………………………………… 1
1.1.1姜黄素的结构与性质………………………………………………………… 1
1.1.2姜黄素的研究现状……………………………………………………………1
     1.1.3壳聚糖的结构与性质…………………………………………………………2
     1.1.4壳聚糖作为药物载体的优点…………………………………………………3
     1.1.5壳聚糖作为药物载体的应用…………………………………………………3
1.2研究方法现状 …………………………………………………………………………5
1.2.1共价交联法……………………………………………………………………5
1.2.2沉淀法或凝聚法………………………………………………………………5
1.2.3喷雾干燥法………………………………………………………&hell ip;…………5
1.2.4模板聚合法……………………………………………………………………5
1.2.5乳滴聚结法……………………………………………………………………6
1.3实验课题方案 …………………………………………………………………………6
2. 实验部分 …………………………………………………………………………………… 8
2.1 实验仪器与试剂……………………………………………………………………… 8
2.2 实验内容  …………………………………………………………………………… 9
2.2.1姜黄素的测定  ……………………………………………………………… 9
2.2.2壳聚糖纳米粒的制备………………………………………………………… 9
2.2.3姜黄素-壳聚糖纳米粒的制备 ……………………………………………… 9
2.2.4优化工艺……………………………………………………………………… 9
2.2.5包封率、载药量的测定 ……………………………………………………10
2.2.6纳米粒径的测定…………………………………………………………… 10
2.2.7稳定性分析 ………………………………………………………………… 11
3. 结果与讨论………………………………………………………………………………… 12
3.1 姜黄素标准曲线 …………………………………………………………………… 12
3.2 单因素考察结果 …………………………………………………………………… 12
3.2.1 壳聚糖浓度对制备载药纳米粒的影响…………………………………… 12
3.2.2 TPP浓度对制备载药纳米粒的影响 ……………………………………… 13
3.2.3 溶液pH值对制备载药纳米粒的影响 …………………………………… 14
3.2.4 姜黄素浓度对制备载药纳米粒的影响  ………………………………… 14
3.2.5 TPP滴加速度对制备载药纳米粒的影响 ………………………………… 15
3.2.6搅拌速度、时间对制备载药纳米粒的影响………………………………… 15
3.2.7冻干保护剂对制备载药纳米粒的影响 …………………………………… 16
3.3姜黄素-壳聚糖纳米粒径大小分布…………………………………………………17
3.3.1壳聚糖空白纳米粒径大小分布 …………&helli p;………………………………17
3.3.2载药壳聚糖纳米溶液粒径大小分布 ………………………………………17
3.3.3载药壳聚糖纳米冻干粉末粒径大小分布 …………………………………18
3.3.4载药壳聚糖纳米粒径稳定性分析 …………………………………………22
4. 总结与展望  ………………………………………………………………………………24
    4.1总结  …………………………………………………………………………………24
4.2展望  …………………………………………………………………………………24
致谢 ……………………………………………………………………………………………25
参考文献 ………………………………………………………………………………………26
 
1  绪论
 
1.1 前言
1.1.1 姜黄素的结构和性质
姜黄为常用传统中药, 具有破血行气、通经止痛的功能。姜黄素(Curcumin) 是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种黄色酸性酚类物质，长期以来作为食物中的添加剂使用，对人体无毒副作用，是姜黄发挥药理作用的主要活性成分。
 
图1.1 姜黄素结构式
姜黄素分子式为C21 H20O6，相对分子质量368.37，熔点183℃。姜黄素既有2个邻甲基化的酚，又有一个β-二酮功能基团，姜黄素的这种结构特性与其多种生物活性都高度相关。姜黄素几乎不溶于水，易溶于乙醇、碱、醋酸、丙酮和氯仿等溶剂。姜黄素在高温或强酸、强碱环境中稳定性差，且体内代谢半衰期短，姜黄素还是一种光敏性很强的物质，应避光保存。姜黄素具有广泛的药理性质，如抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗突变、抗艾滋病病毒等。

1.1.2姜黄素的研究现状
自1985年Kuttan[1]等首次提出姜黄与姜黄素可能具有抗肿瘤活性以来，有关这方面的研究已成为国内外医学界研究的热点，其中姜黄素已被美国NCI列为第三代防癌药进行研究，并于2000年列入美国药典，很有开发应用前景。抗肿瘤血管生成化学合成药物来源有限且价格昂贵，结合我国国情，应发挥中国传统医药的优势。近年来，中药在抗肿瘤中的应用受到越来越多的关注。
姜黄素具有良好的防癌和抗癌活性，又来源广泛，价格低廉，且毒副作用小，因此是理想的可供筛选的新型抗肿瘤药物。但是它在水溶液中溶解度低、体外稳定性差，以及口服给药后能被吸收到血循环中的量很少，大部分被肠道消化液和肝脏微粒体酶代谢,限制了其临床应用。
姜黄色素分子结构中的-OH、-OCH3等基团所含氢为活性氢，在体外容易被氧化而不稳定。更大的问题是姜黄色素难溶于水，在很大程度上限制了其使用。目前对于姜黄素的研究大多数以姜黄素的混合物为主，缺乏针对活性单体的研究，而且给药途径都以口服为主，尚无静脉注射给药报道。但是试验研究发现，口服姜黄色素能被吸收到血循环中的量很少，大部分被肠道消化液和肝脏微粒体酶代谢。另报道指出，姜黄色素口服给药后对结肠癌等肠道肿瘤效果好，但对化学致癌物诱导的鼠肺癌模型和乳腺癌模型没有影响或只有很少的影响。
姜黄素的制剂研究进展缓慢，目前以口服为主要给药途径，如散剂。有研发部分就姜黄素脂质体新制剂的制备工艺申报国家专利。我们考虑把姜黄素制备成纳米载体药物。这样与传统的药剂相比，会具有明显的缓释作用，可大大减少服药次数，屏蔽药物的刺激性气味，并有延长药物活性、控制药物释放剂量、提高药物疗效及拓宽给药途径等优点。

1.1.3壳聚糖的结构和性质
早在1811年，法国人H. braconnot从菌类中提取了一种类似纤维素的物质。由于它大量存在于低等动物，特别是节肢动物的甲壳中，故称甲壳素(Chitin)，又名壳蛋白、几丁质。甲壳素脱除乙酰基后，称为可溶性甲壳质(Chitosna)，又名可溶性甲壳素、脱乙酞几丁质或壳聚糖[2]。
壳聚糖是一种天然生物高分子聚合物，其化学名称为聚-(1，4)-2-胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖[3，4]。在化学结构上与纤维素十分相似，差别仅在于纤维素分子链中C-2上的羟基被胺基所取代，如图1.2所示。由图可见，由于壳聚糖中游离氨基的存在，其反应活性要比原来的甲壳素强得多，这正是壳聚糖受到广泛应用的主要原因。
作为天然多糖中唯一的碱性多糖，在酸性条件下，壳聚糖是一种线性高分子电解质，其溶液具有一定的粘度。壳聚糖的分子量越大，溶液的浓度越高，粘度就越大。壳聚糖因含有游离氨基，其氮原子上还有一对未结合的电子，使氨基呈弱碱性，能结合一个氢离子，从而使壳聚糖成为带正电荷的电解质。壳聚糖的氨基属于一级氨基，氨基上的氢较活泼，在中性介质中壳聚糖能与芳香醛或脂肪醛形成西佛碱(Schiff’s base)。因此，壳聚糖可用具有双官能团的醛或酸酐等交联，其交联产物不易溶解， 溶胀也小，性质较稳定[5]。

 
图1.2  分子结构图
1.1.4 壳聚糖作为药物载体的优点
壳聚糖作为一种天然高分子材料已用于药物载体的研究，这是因其具有以下优点:
(l)、壳聚糖是取之不尽的天然高分子聚合物。其前体甲壳素在自然界的资源非常丰富，每年地球上的自然生成量可达1014吨，是地球上仅次于纤维素的最丰富的天然聚合物。
(2)、壳聚糖具有良好的生物降解性和生物相容性。它可以被壳聚糖酶、溶菌酶、蜗牛酶等水解，水解的最终产物氨基葡萄糖是生物体内大量存在的一种成分，因此无毒。由于壳聚糖在体内可以被降解，不会有蓄积作用，降解产物也不与体液反应，对组织无排异性，因而具有良好的生物相容性。
(3)、壳聚糖在酸性环境下的正电性对肿瘤的治疗很有意义，因为肿瘤细胞具有比正常细胞表面更多的负电荷，因此载药壳聚糖在酸性环境中对肿瘤细胞表面具有选择性吸附和电中和作用[6]。
(4)、壳聚糖还具有直接抑制肿瘤细胞的作用，通过活化免疫系统显示抗癌活性，与现有的抗癌药物合用可增强后者的抗癌效果。

1.1.5 壳聚糖作为药物载体的应用
由于壳聚糖作为药物载体的诸多优越性，其在药物载体上的应用已引起各国学者的重视，壳聚糖纳米粒在以下方面的应用正日益展开。
(l) 药物缓释和控释作用[7]
药物包封于壳聚糖纳米粒后，其释放主要决定于壳聚糖的生物降解和溶蚀，因此药物的释放明显延长。Calvo等[8]用聚环氧乙烷一聚环氧丙烷共聚物等交联的壳聚糖纳米粒，用于破伤风类毒素的口服给药载体，抗原释放缓慢，18d后有20%的破伤风类毒素被释放。梁桂媛等[9]采用乳化交联法及先制备白蛋白微球再在其表面固定壳聚糖的方法制备了两种5-氟尿嘧啶壳聚糖微球，体内释放实验表明，在PH7.4磷酸盐缓冲溶液中，微球具有显著的缓释作用。
(2) 增加药物的吸收作用
壳聚糖纳米粒已被证实能有效地增强药物通过鼻腔和肠道粘膜上皮的吸收。Femnadez等[10]对糖尿病兔进行鼻腔给药，结果表明在同样的给药剂量下，胰岛素壳聚糖纳米粒组比对照组的降血糖作用更加强烈和持久。Moorne等[11]研究了泼尼松龙壳聚糖纳米粒通过小肠上皮粘膜的情况，结果表明，壳聚糖纳米粒能提高药物通过上皮细胞的通过率。这是因为壳聚糖本身是一种安全有效的吸收促进剂，且能够粘附于粘膜上皮，增加药物与上皮组织的接触时间，减少药物清除，从而提高药物的生物利用度。
(3) 增加药物靶向性和降低药物的毒副作用
研究表明，肿瘤细胞具有比正常细胞表面更多的负电荷，因此壳聚糖所带的正电荷对肿瘤细胞表面具有选择性吸附和电中和作用。此外，壳聚糖还具有直抑制肿瘤细胞的作用，并通过活化免疫系统促进人体抗肿瘤作用，从而与抗肿瘤药发挥协同作用。对多柔比星壳聚糖纳米粒的研究表明，肿瘤细胞对纳米粒具有选择性吞噬作用，从而增加疗效，降低药物外周毒副作用[12]。Mrtia等[13]对右旋糖配-多柔比星壳聚糖纳米粒用于肿瘤靶向释放研究，结果右旋糖配-多柔比星壳聚糖纳米粒不但减少外周毒副作用，还能大大提高对实体瘤的治疗效果。
因此，作为一种具有广阔前景的新型药物载体，壳聚糖纳米粒可携带多种药物，可用于器官靶向，胞内靶向等药物传递系统或口服，眼用和透皮制剂中。另外，它还可用作为固定化酶载体，还可与合成高分子制成敏感性水凝胶膜而用作药物释放载体[14]。
但在国内，对于壳聚糖载体材料的研究的重点还是在壳聚糖载药微球的研究，而且国内外仍非常缺乏对影响纳米粒粒径的因素的研究和报道。而纳米粒更小，其直径通常在10～500nm之间，它们具有特殊的医疗价值，经典的药物剂型(如片剂、软膏、注射剂)不能调整药物在体内的行为(分布和消除)，药物是根据其化学结构决定其物理性质和化学性质，从而影响其生物特性。而药物与纳米囊(球)载体结合后，可隐藏药物的理化特性，因此其体内过程依赖于载体的理化特性。
1.2 研究方法现状
近年来，壳聚糖纳米粒作为许多种抗癌药物和生物大分子(如蛋白质、DNA)的控释载体，其制备方法的研究也受到重视，现已有以下几种制备方法。

1.2.1 共价交联法[15]
将药物溶解或分散于壳聚糖醋酸溶液中，混合均匀后，将此溶液加入到含有表面活性剂(如HLB值较小的司盘类)的有机溶剂中，经搅拌或超声处理，形成W/O型乳液，再用戊二醛，甲醛等进行化学交联，通过离心，纯化即可制得壳聚糖纳米粒。该法是常用的制备方法，对于疏水性药物可将其首先溶于有机溶液中，然后再分散于壳聚糖醋酸溶液中，形成O/W乳液，再将0/W乳液滴加到有机相中制成O/W/O型复乳后再交联的方法制备。

1.2.2 沉淀法或凝聚法[16]
在壳聚糖醋酸溶液中，加入吐温一80等表面活性剂作为分散剂，将硫酸钠溶液滴入搅拌的壳聚糖溶液中，超声处理，通过溶液的浊度来判定微粒的形成，所得微粒粒径介于微球与纳米粒之间。壳聚糖纳米粒也可以通过梭甲基纤维素钠(CMC)与壳聚糖起复凝聚作用而制备。

1.2.3 喷雾干燥法[17]
将药物、壳聚糖溶于冰醋酸一水一丙酮中得到不同浓度的壳聚糖溶液，在惰性的热气流中进行喷雾干燥，在干燥过程中冰醋酸一水一丙酮迅速蒸发，从而形成壳聚糖微球。

1.2.4 模板聚合法
南京大学的胡勇等[18]用一种新的方法制备了壳聚糖一聚丙烯酸(PAA)纳米粒。将壳聚糖溶解于丙烯酸(AA)溶液中，在N2保护，70℃下用K2S2O8引发丙烯酸以壳聚糖为模板产生聚合，所得聚合物PAA的梭基与壳聚糖的氨基交联，导致壳聚糖高分子链卷曲而成纳米粒。该方法反应条件温和，纳米粒粒度小，分布均匀，并且具有一定的pH敏感性。
1.2.5 乳滴聚结法[19]
将壳聚糖溶液加入药物溶液中，加入乳化剂，经高速搅拌得乳剂A;同样将NaOH溶液加入乳化剂，经高速搅拌得乳剂B。然后将A和B两种乳剂混合，经搅拌而发生乳滴聚结，离心从而得到壳聚糖纳米粒。
上述制备方法虽然各有特点，但是也存在一些问题。如共价交联法，使用大量的有机溶剂和表面活性剂，而且戊二醛，甲醛等化学交联剂具有细胞毒性以及对大分子的灭活作用;沉淀法和喷雾干燥法得到的产物粒径偏大，分布不均匀，结果重现性差;模板聚合法条件苛刻，过程复杂。因此，近年来有人将离子交联法[20]引入壳聚糖纳米粒制备过程，产生了良好的效果。
离子交联的原理是壳聚糖分子中存在大量的氨基，在酸性条件下其表面带有正电荷，一些聚阴离子(如三聚磷酸盐 (TPP)阴离子、硫酸葡聚糖、海藻酸钠等)在水溶液中带有负电荷。控制一定的条件下使二者相互混合，利用壳聚糖的游离氨基与阴离子发生分子间或分子内交联反应而制得壳聚糖纳米级微粒(反应示意过程如图1.3)。该方法过程简单，作用时间短，条件温和，不使用有机溶剂，得到的纳米粒粒径小，分布均匀，且结果重现性较好。同时，由于静电相互作用是一种弱作用力，不涉及热交联过程中的高温及化学交联过程中的共价键形成，因而对所包载药物，尤其是生物制品的性质无较大影响。离子交联法制备壳聚糖纳米粒中虽己有报道，但大多集中在纳米粒的应用上，对纳米粒制备过程中影响纳米粒形成的因素研究的较少。
 
                          图1.3壳聚糖纳米粒制备过程
1.3 实验课题方案
姜黄素具有广泛的药理性质，如抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗突变、抗艾滋病病毒等，可抑制核转录因子、环氧化酶、脂氧化酶和诱生型一氧化氮合酶。由于姜黄素在高温或强酸、强碱环境中稳定性差，在水中不易溶解，且体内代谢半衰期短，姜黄素还是一种光敏性很强的物质，应避光保存。姜黄素的制剂研究进展缓慢，目前以口服为主要给药途径，如散剂。有研发部分就姜黄素脂质体新制剂的制备工艺申报国家专利。
纳米粒的直径通常在10～500nm之间，呈固态或胶态。将溶解药物包裹于纳米粒的内部或吸附在纳米粒的表面，可制成纳米载体药物。综合各种文献，我们选择以壳聚糖为载体，三聚磷酸钠为交联剂，采用离子交联法制备姜黄素-壳聚糖纳米粒。与传统的药剂相比，会具有明显的缓释作用，可大大减少服药次数，屏蔽药物的刺激性气味，并有延长药物活性、控制药物释放剂量、提高药物疗效及拓宽给药途径等优点。
本课题主要研究姜黄素-壳聚糖纳米粒的制备，由于影响纳米粒形成有多方面的因素，如药物浓度、壳聚糖浓度、体系pH值、交联剂浓度及用量、搅拌速度、冷冻干燥的保护剂等等，所以试途通过正交实验得出纳米粒的最佳制备工艺条件，并对纳米粒进行检测分析。

2  实验部分
2.1 实验仪器与试剂
实验仪器：
电子天平，烧杯，量筒，玻璃棒，铁架，广口瓶，锥形瓶，西林瓶，注射针，小漏斗，胶头滴管，移液管，吸耳球，磁力搅拌器，超声清洗器。

分析检测仪器：
真空冷冻干燥机：Labconco Bl
紫外分光光度计： UV-7504C
激光散射粒度分析仪： NlCOMPTM 380 ZLS

表2.1 实验试剂
名   称 规格  格 产  地
姜黄素 AR 天津市化学试剂研究所
壳聚糖 AR 浙江金壳生物化学有限公司
无水乙醇 AR 安徽安特生物化学有限公司
乙酸36% AR 上海化学试剂采购供应五联化工厂
多聚磷酸钠TPP AR 浙江省温州市东升化工试剂厂
葡萄糖 AR 广东•汕头市西陇化工厂
麦芽糖 AR 中国医药（集团）上海化学试剂公司
蔗糖 AR 广东光华化学厂有限公司
乳糖 AR 上海伯奥生物科技有限公司
明胶 AR 国药集团化学试剂有限公司
聚乙二醇1000 AR 国药集团化学试剂有限公司
聚乙二醇2万 AR 国药集团化学试剂有限公司

2.2 实验内容
2.2.1姜黄素的测定
用无水乙醇配制的姜黄素溶液呈黄色，准确称取20mg姜黄素标准品于50ml容量瓶，用无水乙醇溶解并定容，配制成400μg/mL的黄色姜黄素溶液。再从配好的溶液中分别取0.025ml，0.05ml，0.075ml，0.1ml，0.125ml溶液于10ml容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，则所配制的姜黄素标准溶液的浓度分别为1μg/ml，2μg/ml，3μm/l，4μg/ml，5μg/ml，以无水乙醇溶液做空白对照，用紫外可见分光光度计于姜黄素的最大吸收波长420nm处，分别测定一系列标准溶液的吸光度值，做标准曲线，并进行线性回归分析。

2.2.2壳聚糖纳米粒的制备[21]
在制备载药壳聚糖纳米粒之前，本实验先进行了空白(不载药)纳米粒的制备。基于离子交联法的基本原理，考虑到在酸性条件下壳聚糖是表面带有正电荷的聚合物大分子，三聚磷酸钠(TPP)在水溶液中带有负电荷，由于静电作用二者易交联凝聚成纳米级微粒，通过控制一定条件可以得到壳聚糖纳米粒。
称取适量壳聚糖样品（脱乙酰度90%），加入一定量的1%醋酸溶解，配制成2mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，取其溶液10ml并调节其pH值至5，磁力搅拌下，逐滴滴加1mg/mlTPP水溶液4ml，反应10min，即可得到具白色乳光的壳聚糖纳米粒。

2.2.3姜黄素-壳聚糖纳米粒的制备
本实验采用离子交联法，配制适宜浓度的壳聚糖醋酸溶液，调节pH至合适的值，再往高速搅拌的壳聚糖溶液中滴加适量姜黄素的乙醇溶液，然后往搅拌的溶液中滴加一定浓度的三聚磷酸钠溶液，搅拌一定时间，通过静电作用得到载药纳米粒悬浮液，再经超声、透析，加入冻干保护剂进行冷冻干燥，得到干粉状纳米粒。

2.2.4优化工艺
实验中以减小粒径为目的，考察了药物浓度、壳聚糖和TPP浓度、搅拌时间、pH值、冻干保护剂等多种因素对壳聚糖纳米粒平均粒径的影响，以望得到最佳制备条件。
选取影响纳米粒制备的几个主要因素：壳聚糖的浓度，TPP的浓度，姜黄素的浓度，pH值，搅拌时间、速度、TPP滴加速度、冻干保护剂等进行单因数考察，实验又发现冻干步骤对粒径影响较大，又选取3种冻干保护剂，做复合处方，按表2.2正交实验设计表L9(33)安排实验，每种成分取3种不同的加入比例进行实验，综合评价。
表2.2 正交实验设计表
因素       葡萄糖     麦芽糖     蔗糖
实验1      10%       10%       10%
实验2      10%       30%       30%
实验3      10%       60%       60%
实验4      30%       10%       30%
实验5      30%       30%       60%
实验6      30%       60%       10%
实验7      60%       10%       60%
实验8      60%       30%       10%
实验9      60%       60%       30%

2.2.5包封率、载药量的测定
取透析后的纳米粒溶液0.2ml，加入无水乙醇20ml稀释100倍后，于紫外分光光度计λ=420nm处测定吸收值，用标准曲线法定量，按下面公式计算姜黄素的包封率：
取姜黄素-壳聚糖纳米粒溶液以14000rpm离心20min，分离沉淀，收集上清液,用紫外分光光度计于入=420nm处测定A值，用标准曲线法定量。按下式计算载药量:
包封率 = × 100%
载药量 = X 100%
Ws：包入纳米粒的药物量； Wa：初始投药量； Wb：上清液中含药量； W总：纳米总质量

2.2.6纳米粒径的测定
 平均粒径的测定纳米粒平均粒径在NlCOMPTM 380 ZLS激光散射粒度分析仪上测定。取纳米粒混悬液适量，加去离子水稀释到合适的浓度后用激光散射粒度分析仪测定平均粒径及其分布。测定壳聚糖空白纳米粒径、及各不同 条件下的姜黄素壳聚糖纳米粒径，进行比较总结。

2.2.7稳定性分析
稳定性实指某种性质(如分散相浓度、颗粒大小、体系粘度和密度等)有一定程度的不变性。对制备的姜黄素壳聚糖纳米粒放置5、15、30天，分别进行粒度分析，比较平均粒径值的变化。

3  结果与讨论
3.1 姜黄素标准曲线
以姜黄素对吸光度A进行线性回归，得线性方程为:Y=68.9X+0.0529（R2=0.9818）。表明姜黄素在浓度0.001～0.005μm/ml范围，其浓度与吸收度A之间有良好的线性关系，结果见图表3.1，3.2。实验中计算包封率、载药量值所用到的姜黄素浓度均由线性回归方程得出。
 表3.1 姜黄素吸收度测定数据
姜黄素浓度 吸收值
0.001 0.125
0.002 0.177
0.003 0.281
0.004 0.314
0.005 0.401

 
图3.2姜黄素标准曲线
3.2单因素考察结果
3.2.1壳聚糖浓度对制备载药纳米粒的影响
壳聚糖与TPP的反应主要是带正电的氨基与带负电的磷酸基的静电相互作用，因此二者的浓度不同，也即反应中两基团的不同比例会对形成的纳米粒的粒径有较大影响。同时，作为高分子溶液，壳聚糖浓度对溶液粘度和高分子链的状态有影响，也就会造成纳米粒径的不同。所以以纳米粒径大小为指标，固定姜黄素浓度，TPP浓度，搅拌速度，搅拌时间，体系pH，考察不同壳聚糖浓度对载药纳米粒径的影响。
实验中，配制0.5mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/ml，3.0mg/ml的壳聚糖醋酸溶液分别进行实验，比较实验现象。
表3.3 壳聚糖溶液浓度对纳米粒制备的影响
壳聚糖溶液浓度mg/ml      实验现象及粒径
0.5                溶液澄清透明
1.0                黄色不透明液体，纳米平均粒径200nm
2.0                黄色乳光状，纳米平均粒径220nm
3.0                溶液粘稠，微球粒径分布不均匀

由表3.3可以看出，壳聚糖是大分子聚合物，随着壳聚糖醋酸溶液浓度增加，相当于反应物增多，制备的纳米粒变大。实验证明壳聚糖浓度范围为1.0～2.0mg/ml较好。当壳聚糖浓度3mg/ml时，溶液过于粘稠，离子化很少，无实际操作意义。0.5mg/ml时结果也不理想，浓度过低，易造成壳聚糖降解，无颗粒生成。

3.2.2 TPP浓度对制备载药纳米粒的影响
壳聚糖是带有阳离子的大分子聚合物，可通过控制它与带阴离子的TPP作用形成聚电解质复合物。TPP阴离子与壳聚糖正电荷氨基基团分子内和分子间的交联是凝胶过程的关键。为此，实验固定壳聚糖醋酸溶液、姜黄素浓度、搅拌速度、搅拌时间、pH，制备0.5mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/ml，3.0mg/ml的三聚磷酸钠(TPP)水溶液，进行水平实验，考察不同TPP浓度对纳米粒径的影响，见表3.4。实验证明TPP浓度范围在1.0mg/ml适宜，可以得到稳定的纳米粒，纳米粒悬浮液呈现黄色乳光液。
表3.4 TPP水溶液浓度对纳米粒制备的影响
TPP水溶液浓度mg/ml         实验现象及粒径
0.5                 浓度太低，只有少量纳米粒生成
1.0                 黄色乳光状，纳米平均粒径200nm
2.0                 较多黄色沉淀出现
3.0                 溶液浑浊，生成大粒聚集体

3.2.3 溶液pH值对制备载药纳米粒的影响
 在壳聚糖纳米粒制备过程中，主要是壳聚糖分子中的带正电氨基与TPP分子中带负电磷酸基的静电相互作用，作为高分子电解质，溶液pH值对壳聚糖分子的带正电性质势必存在影响。文献报道，壳聚糖的pKa值为6.3[22]，欲使其带正电，溶液的pH值必须小于6.3。随着pH值降低，溶液酸度增加，壳聚糖以正电性的存在机会增加，同时溶液粘度减少，使形成的纳米粒的粒径减小。
所以实验固定壳聚糖溶液浓度、TPP水溶液浓度、药物浓度、搅拌时间、速度，分别在反应前调节壳聚糖醋酸溶液的pH值，在pH为3，4，5，6时进行实验，考察pH值对纳米粒径的影响。
pH值        壳聚糖电离情况及纳米粒径
3         电离基本被压制，溶液澄清
4         有半透明微粒生成，但生成量少纳米粒径200nm
5         黄色乳光溶液，纳米粒径210nm
6         pH接近壳聚糖pKa，氨基离子化程度很低，溶液絮状
表3.5 pH值对纳米粒制备的影响

结果见表3.5，pH值范围为4.0～5.0较好，可以得到稳定的纳米粒。对于壳聚糖，pH值大于6.0，氨基的离子化程度急剧下降，在低pH值，壳聚糖的电离基本上被压制，也就是平均每个壳聚糖氨基所带的电荷数目小于1。

3.2.4 姜黄素浓度对制备载药纳米粒的影响
   实验中固定壳聚糖浓度、TPP水溶液浓度、pH值、搅拌时间、搅拌速度，配制0.5mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/ml浓度的姜黄素乙醇溶液，考察不同浓度的药物对纳米粒制备及药物包封率的影响。
表3.6 姜黄素浓度对纳米粒制备的影响
姜黄素溶液浓度mg/ml       纳米粒径及包封率
0.5               溶液澄清，纳米粒径200nm，包封率8%，载药量25%
1.0               黄色乳光溶液，纳米粒径210nm，包封率10%，载药量30%
2.0               溶液有颗粒状沉淀

实验结果见表3.6，姜黄素浓度范围为0.5～1.0较为理想。随着姜黄素浓度的增加，载药纳米粒的包封率有所增加，在一定程度上可通过投药量在提高包封率，但这种方法是有限的，因为包封率或载药量也是由药物本性确定，也受壳聚糖、TPP浓度及整个体系相互作用的影响。姜黄素本身很不稳定，放置时间长，即会析出颗粒沉淀。姜黄素浓度高了，有沉淀出现，说明姜黄素与壳聚糖、TPP的结合具有饱和性。

3.2.5 TPP滴加速度对制备载药纳米粒的影响
壳聚糖与TPP的离子交联反应虽是一个比较快速的过程，但TPP滴加速度太快对纳米粒粒径必有影响。由图3.7可见，滴加速度越快，壳聚糖纳米粒粒径越大。当滴加速度小于1滴/秒时，滴加入壳聚糖溶液中的TPP溶液在搅拌下能快速分散开，因此可生成粒径小的纳米粒。随TPP滴加速度的增大，滴加入壳聚糖溶液中的TPP溶液不能及时分散开，局部TPP浓度大而与壳聚糖形成大粒径的纳米粒。当TPP滴加速度大于5滴/秒时，溶液中甚至可观察到大粒径的颗粒物。
 
图3.7 TPP滴加速度对纳米粒径的影响

3.2.6 搅拌速度、时间对制备载药纳米粒的影响
壳聚糖纳米粒制备是一个离子交联凝聚过程，因此搅拌速度对形成的纳米粒的平均粒径及其粒径分布存在影响。低速下粒子聚集严重，增大搅拌速度，有利于纳米粒的均匀分散，防止纳米粒的聚集。另外，壳聚糖高分子溶液的粘度较大，增大搅拌速度也有利于纳米粒的形成。
随着TPP加入壳聚糖溶液中，两三分钟即可见到乳光产生，说明反应能够较快地进行，随搅拌时间的延长，纳米粒径基本不变，为使反应较为充分，将反应时间定为10min，同时乳光的产生也能大致说明产物的粒径处于纳米级。
 
图3.8 搅拌 时间对纳米粒径的影响

3.2.7 冻干保护剂对制备载药纳米粒的影响
实验中为制得干燥纳米粒，进行抽真空冷冻干燥，在未加入冻干保护直接冷冻时，结果纳米粒径发生很大变化，加适量水复溶就出现颗粒沉淀，而不是乳光溶液，说明纳米粒已受破坏。所以考虑冷冻前尝试加入葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、蔗糖、聚乙二醇、明胶等冻干保护剂，结果发现糖类冻干保护剂是起到了一定的效果，但是纳米粒径还是有小幅度的增大，平均增加50nm，但还发现单一处方存在着产品外观不合格问题，如葡萄糖极易回潮；甘露醇稳定性差，复溶放置一段时间就出现颗粒沉降；聚乙二醇复溶性差，加水即出现大颗粒；麦芽糖、蔗糖，纳米粒制品萎缩、孔隙不致密、不饱满等现象。
所以实验又设计复合处方，按不同比例配制复合保护剂，加入到纳米粒溶液中，再进行冷冻干燥，最后考察纳米粒制品外观及冷冻干燥对纳米粒径的影响。结果仍不理想，9个处方制得的纳米粒干燥粉末外观均没达到要求，均出现不同程度的塌陷、萎缩、颜色不均的现象，且极易回潮，稳定性不好，有待继续考察。

3.3姜黄素-壳聚糖纳米粒径大小分布
3.3.1壳聚糖空白纳米粒径大小分布
配方1：2mg/ml壳聚糖醋酸溶液10ml，调至pH4～5，在磁力搅拌下，加入1mg/mlTPP溶液4ml，反应10分钟，超声5分钟，即得乳白色纳米溶液。取2ml纳米粒溶液，加水2ml稀释，用激光散射粒度分析仪进行测定。结果如图3.9，平均纳米粒径为164nm。粒径较小，较集中，此配方是可以的。
 
图3.9壳聚糖纳米粒径大小分布

3.3.2载药壳聚糖纳米溶液粒径大小分布
配方2：2mg/ml壳聚糖醋酸溶液10ml，调至pH4～5，在磁力搅拌下，缓慢加入1mg/ml姜黄素乙醇溶液10ml，再滴加入1mg/mlTPP溶液4ml，反应10分钟，超声5分钟，即得黄色乳光状纳米溶液。取2ml纳米粒，加水2ml稀释，用激光散射粒度分析仪进行测定。结果见图3.10，纳米平均粒径为201nm，载药纳米粒径比空白纳米粒径有所增大。
将此配方的纳米粒溶液装入透析带，进行24小时透析，除去游离的姜黄素药物，然后再测定透析后的纳米粒径，进行比较分析。结果见图3.11粒径为211nm，说明透析后纳米粒径有所增大，透析是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。
 
图3.10姜黄素壳聚糖纳米粒径大小分布201nm

 
图3.11透析后载药壳聚糖纳米粒径大小分布211nm

3.3.3载药壳聚糖纳米冻干粉末粒径大小分布
配方3：2mg/ml壳聚糖醋酸溶液10ml，调至pH4～5，在磁力搅拌下，缓慢加入1mg/ml姜黄素乙醇溶液10ml，再滴加入1mg/mlTPP溶液4ml，反应10分钟，超声5分钟，透析24小时后，量取4份1.5ml纳米粒溶液于4个西林瓶里，再分别加入0.5ml浓度均为12%的葡萄糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖四种冻干保护剂，混匀后均为含3%保护剂的纳米溶液，于真空冷冻干燥机冻干28小时，得到纳米冻干粉末，再加适量水复溶，测定粒径。结果见图3.12至图3.17，冻干操作使纳米粒径都有所增大。

表3.12冻干实验数据
不同保护剂冻干燥       纳米粒径
冻干保护前            206nm
麦芽糖                213nm
蔗糖                  226nm
葡萄糖                237nm
甘露醇                241nm

 
图3.13冻干前纳米溶液粒径206nm

 
图3.14麦芽糖保护剂冻干粒径213nm

 
图3.15蔗糖保护剂冻干粒径226nm

图3.16葡萄糖保护剂纳米粒径237nm

图3.17甘露醇保护剂纳米粒径241nm
配方4：2mg/ml壳聚糖醋酸溶液15ml，调至pH4～5，在磁力搅拌下，缓慢加入1mg/ml姜黄素乙醇溶液15ml，再滴加入1mg/mlTPP溶液6ml，反应10分钟，超声5分钟，量取9份1ml纳米粒溶液于9个西林瓶里，配制6%的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖三种冻干保护剂，按表2.2进行正交实验，量取不同的量加入到纳米粒溶液中，摇匀，于真空冷冻干燥机冻干25小时，得到纳米冻干粉末，再加适量水复溶，测定粒径见表3.18。
结果表明复合配方仍存在问题，外观均不符合要求，仅3号，即10%葡萄糖、60%蔗糖、60%麦芽糖稍微较好，但放置一会也就回潮现象出现。其余均马上出现不同程度的萎缩、塌陷、颜色不均现象，极易回潮，可能还是葡萄糖存在的原因，各制品的粒径均有增大趋势，1号和7号配方粒径变化很大。从单因素和复合处方5号含60%麦芽糖的平均粒径结果综合考察，麦芽糖冻干保护剂对纳米冻干粉末的粒径改变影响最小。

表3.18  复合处方纳米粒径的考察结果
不同配方保护剂              平均纳米粒径
冻干前纳米粒溶液               280nm
1号，10%葡+10%蔗+10%麦           404nm
2号，10%葡+30%蔗+30%麦           293nm
3号，10%葡+60%蔗+60%麦           289nm
4号，30%葡+10%蔗+30%麦           295nm
5号，30%葡+30%蔗+60%麦           275nm
6号，30%葡+60%蔗+10%麦           317nm
7号，60%葡+10%蔗+60%麦           389nm
8号，60%葡+30%蔗+10%麦           294nm
9号，60%葡+60%蔗+30%麦           312nm

3.3.4载药壳聚糖纳米粒径稳定性分析
体系中含一定数目的细小微粒，由于某种原因，团聚在一起形成一个大粒子并不再被拆散开，这时体系的分散度降低，这称为体系的聚集稳定性变差，反之，若体系中的细小粒子长时间不团聚，则体系的聚集稳定性好。
配方5：2mg/ml壳聚糖醋酸溶液10ml，调至pH4～5，在磁力搅拌下，缓慢加入1mg/ml姜黄素乙醇溶液，再滴加入1mg/mlTPP溶液4ml，反应10分钟，超声5分钟，取出适量制得的纳米粒溶液存放于西林瓶。进行粒度稳定性分析，考虑其平均粒径随放置时间的变化，结果见表3.19可见，随放置时间的延长，纳米粒的平均粒径没有太大变化，说明粒度稳定性较好。

表3.19 纳米粒溶液粒径稳定性测定数据
时间（天）     平均纳米粒径
0             206nm
5             203nm
10             211nm
15             220nm

4  总结与展望
4.1 总结
（1）、以壳聚糖为载体，TPP为交联剂，通过离子交联法制备纳米粒，实验简单温和，不需使用有机溶剂，成功制备平均粒径200nm的载药纳米粒溶液。
（2）、通过对一系列影响壳聚糖纳米粒粒径因素的研究，表明了壳聚糖和TPP的浓度及姜黄素浓度、体系pH值、滴加TPP溶液速度、搅拌速度、搅拌时间等因素对载药壳聚糖纳米粒径影响较大。
（3）、实验确定了制备姜黄素-壳聚糖纳米粒的最佳实验操作条件:配制壳聚糖醋酸浓度为2mg/ml，调节pH为4～5，快速磁力搅拌下，用注射器缓慢滴加入1mg/ml的姜黄素乙醇溶液，继续搅拌下，再滴加入浓度为lmg/mlTPP，滴速为1秒/1滴，反应10分钟，再超声5分钟，即得到泛黄色乳光的纳米溶 液，进行透析操作，载药量30%，包封率为10%左右。
（4）、冻干保护剂对于制备干燥纳米粒粉末影响较大，蔗糖、麦芽糖比较好，但仍存在外观不合格现象，还有稳定性差，易回潮，冻干纳米粒粉末制备的操作条件有待研究。
（5）、姜黄素纳米粒溶液稳定性好，长时间放置粒径无太大变化。

4.2 展望
由于时间关系，对一些因素的考察还不够全面，今后在以下几方面还需要进行改进：
1.干燥纳米粒粉末外观不合格，制备有待进一步的研究，保护剂的筛选和添加对纳米粒影响较大。
2.缺少对真空冷冻干燥系统的研究，其操作条件，温度时间的设置对纳米粒制备的影响。

致  谢

在浙江科技学院两年的专升本学习生活即将结束，毕业设计给我的大学生活划上了完美的句号，将此文献给帮助过我的老师、同学、朋友们。
首先要感谢我的指导老师黄娟老师，黄老师在我的毕业论文课题上，包括选题、课题的展开，以及论文的写作过程中都花了大量的心血。
感谢杭州合众医药科技有限公司提供激光散射粒度分析仪，感谢在实验研究过程为我做了大量检测工作的张毅工程师，我的毕业设计才能顺利完成。
感谢食品专业陈伯恩同学为我做了多次真空冷冻干燥操作。
还有感谢林武霖、徐兴志等同学对我的帮助。
三个多月的实验生活即将结束，我也即将走上工作岗位，难以忘记在科院的点点滴滴。毕业实验设计中有痛苦也有欢乐，我相信它将为我的人生划上极为浓烈的一笔，永久的珍藏在我记忆的扉页中。

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