艾滋病分子生物学论文

艾滋病分子生物学论文

【综述】
几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用
翁康生
病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极
大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的
病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,
鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条
件之一。因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于
发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。
近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分
子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。通
过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血
清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建
立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物
学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确
定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。
对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学
与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因
的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分
子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,
进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养
分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决
定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。
从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分
离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸
片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生
物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是
最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈
步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术
方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供
参考。
1 代表性差异分析法
代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基
因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并
不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感
染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存
在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、
比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未
知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应
的代表性差异分析法, 见表1 。
111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation difference
analysis , DNA RDA)
此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法
和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕
作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336
表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用
病毒核
酸类型
DNA RDA c DNA RDA
非rRNA 序列
6 核苷酸引导
c DNA RDA
ds DNA 线状√
ds DNA 环状√
ss RNA polyA( + ) √
ss RNA polyA( - ) 3 √
ds RNA polyA( - ) √
3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。
而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和
对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制
性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接
头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物
上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性
后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交,消减去T- DNA 中
与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序
列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工
接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA
呈指数扩增,因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回
后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的
差异部分作分离,克隆,序列分析。
Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,
在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA
作T- DNA。以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成
功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,
Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现
一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒
HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热
病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。
112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation difference
analysis , cDNA RDA)
Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出
了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同,
主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的
识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均
酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,
至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。
cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起
始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可
类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA
技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕RNA 病毒。
113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA
中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·317 ·
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polyA( - ) - RNA 病毒,其核酸物质不似于mRNA ,需和宿
主细胞总RNA 同时分离,并用随机引物作反转录。因为宿主细
胞总RNA 中rRNA 约占80 % ,由于竞争反应、靶序列信号被湮
灭等原因,从这样的总RNA 抽提物中,用随机6 聚核苷酸引物
引导反转录的cDNA RDA 技术,发现鉴别polyA( - ) - RNA 病
毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可
能的排列组合,共计4 096 个序列模式,以大鼠18S、518S、28S 等
rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据
为模型,筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚
核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后,称
之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序
列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列
中出现的频率,数据表明,非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝
大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引
物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验,
结果表明,二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中
出现的频率相似) 反转录效率几乎相等,而前者对细胞总RNA
反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ,检测
人工合成的RNA ,前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟
实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录,串联cDNA
RDA 技术,检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序
列片段。
此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ,其检
测灵敏度不及普通的PCR 检测方法,但对于检测鉴别在宿主细
胞中复制,但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言,也
是一个可选择的方法。
114 抑制消减杂交
cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术
原理,Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppression
subtractive hybridization ,SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于,
SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份,分别接上
不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ,分别于过量的D - cDNA
作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋
同,T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列
形成杂交双链而被消减, T - cDNA 中差异表达的单链cDNA
被显著富集。合并一轮杂交物,加入过量变性D - cDNA ,作第
二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减
杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交, 可以形成: 原组内
T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂
交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2
NA 末端,用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷
酸为引物,作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物,
因两端分别具有接头1 和2 ,可被指数扩增;T - cDNA 与D -
cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ,因一端具接头序列,被线性
扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列,因抑
制性PCR 效应,在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅
柄结构”〔19〕而不被扩增。因此,SSH 技术通过二轮消减杂交和
抑制性PCR 特异扩增,使假阳性大大降低,提高了检出低丰度
靶mRNA 的灵敏度。
Hu 等〔21〕应用SSH 技术,结合反转录酶的模板切换(tem2
plate - switching) 功能, 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人
MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型,通过反转录
合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相
斑点杂交筛选,在被筛的96 个克隆里,T- cDNA 探针杂交呈特
异阳性的16 克隆中,序列分析后得到4 个插入HCV 序列的
克隆。
2 非特异多重引导滚环式扩增法
乳头瘤病毒、痘病毒等,其基因物质为环状DNA 分子。在
事前未知基因序列的情况下,发现和鉴别这类病毒核酸序列还
可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -
circle amplification ,RCA) ,扩增、分离、获取其基因片段供进一步
分析。
自然状况下,环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean
等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物,加入φ29 DNA 聚合酶,以质
粒DNA 和噬菌体DNA 为模型,建立了多重引物引导的滚环式
扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA
模板,进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位
点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下,
以随机引物引导,合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到
与模板结合的随机引物5′端时,在φ29 DNA 聚合酶的链置换活
性作用下,下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的
延伸链继续在环状模板上复制合成。同时,被从单链环状模板
上“甩”出的互补链,又成为新的模板,随机引物与之结合,在
φ29 DNA 聚合酶作用下,继续以枝杈的形式进行链延伸和链置
换,最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯
pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。
Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列
(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组
方法,并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实
样的试验样品中,由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因,
将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。
3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增
病毒核酸可包裹于病毒外壳内,病毒的蛋白外壳或脂膜对
病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他
真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang
等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增
方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在
于,依据病毒颗粒小、具一定密度,用0122μm 滤器过滤、或再串
上超速密度梯度离心,从样品中分离出病毒颗粒,DNA 酶酶解
游离的DNA ,裂解病毒颗粒,抽提获取较纯的病毒颗粒相关
核酸。
Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理,对病毒颗粒相关核酸用限制
性内切酶酶切后,作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -
independent single primer amplification ,SISPA) :将抽提获取的DNA
或RNA 分别补齐,合成第二链DNA ,或反转录,合成双链cDNA。
限制性内切酶酶切后,酶切片段两端连接一种接头,并以与接
头同序列的单一寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。扩增产物进一
步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳
性血清样品,结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl
样品中,可重复试验检出相应的病毒基因片段。
Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随
机引物,此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸,3′端则有
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MNNMNM6 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时,6 核苷
酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火,在T4 DNA
聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物
中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物,进行PCR 扩增。扩增
产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量,
包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数
为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中,
9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而
6 个MAV - 1 中分离的克隆内,5 个含有99 % 同源MAV - 1 基
因片段。
基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的
非序列依赖性PCR 扩增,获取、鉴定未知病毒的基因片段,尽管
灵敏度不够高,但其实验时间较短,步骤相对简单,对于病毒拷
贝数高,时间紧急的样品鉴别,是较适宜的一套方法。
病毒的种类、结构、特性多种多样,感染病毒后需要检验的
样品又各不相同,因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技
术,也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺
点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断,这
一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈,必然还
会有新的改进、创新技术出现,将会更快、更灵敏、更简便、更准
确的发现鉴别未知病毒。
参 考 文 献
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阿兹夫定谁最先发明

阿兹夫定由郑州大学的常俊标教授率领团队研制成功的。

阿兹夫定由河南真实生物科技有限公司、郑州大学、河南师范大学、河南省科学院高新技术研究中心共同研发，获得国家重大新药创制科技重大专项立项支持。

阿兹夫定获得了国家863项目和河南省重大科技攻关项目资助。

常俊标，发明人常俊标，原河南师范大学校长，现郑州大学副书记、副校长，河南滑县人，二级教授，博士生导师。曾获国家中青年有突出贡献专家、国务院政府特殊津贴专家、国家万人计划领军人才、河南省中原学者等称号。

常俊标教授的科研项目和著作：

1、科研项目

常俊标主持863项目、国家杰出青年科学基金项目、国家自然科学基金重点项目、973项目课题、国家自然科学基金面上项目等17项。

2、著作

据2023年1月河南师范大学化学化工学院官网显示，常俊标出版《艾滋病的分子生物学及治疗》等学术著作9部。在《自然》《科学》《化学评论》等sci期刊发表论文300余篇，被引6000余次。

以上内容参考百度百科－阿兹夫定