分子检测论文

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一种全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技术
DNA甲基化是一种表观遗传修饰,它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase,Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应,在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基.CG二核苷酸是最主要的甲基化位点,它在基因组中呈不均匀分布,存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域,在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％.一般说来,DNA的甲基化会抑制基因的表达.DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的作用.
CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一,而在基因组的某些区段,CpG保持或高于正常概率,这些区段被称作CpG岛.CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域,约有60％以上基因的启动子含有CpG岛.CpG甲基化的研究在肿瘤的研究中有着非常主要的地位.通过基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达,从而引起相应基因沉默,去甲基化又可恢复其表达.DNA甲基化在生理情况下就参与了控制基因的时空表达,在肿瘤发生时,肿瘤细胞全基因组低甲基化是一个重要特征.肿瘤细胞基因组甲基化的程度与正常细胞相比仅为20-60% ,同时伴有局部区域基因的高甲基化,包括肿瘤抑制基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因、细胞周期调节基因、DNA修复基因、血管形成抑制基因等.但是目前研究手段的局限,限制了DNA甲基化的广泛研究.
近年来,研究者不断探索定性及定量检测单个或多个甲基化位点的方法,但由于甲基化多态性区域存在的密度很高,所以对于延伸反应其引物的位置很难设计.Pyrosequencing技术作为一种新的序列分析技术,能够快速地检测甲基化的频率,对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测,为甲基化研究提供了新的途径.
从原理上来看,Pyrosequencing是一种通过合成方法进行序列分析的方法,它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应,促使荧光素发光并进行检测.这项技术曾经被用作单核苷酸多态性（SNP）的基因型和单倍型的检测,以及细菌和病毒的鉴定和分型研究.这项技术的一个主要特点是在Pyrogarm™软件上显示的峰值高度来自于序列分析的原始数据,通过峰值的高度可以精确的检测混合DNA模板中等位基因的频率.
目前甲基化研究方面,很多甲基化定量分析的报道采用亚硫酸氢盐处理甲基化样本,并用混合的PCR产物
作为校正.其主要原理是：亚硫酸氢盐可以将没有甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,而在适当的实验条件下甲基化的胞嘧啶保持不变.因而,用它处理样本后,再进行PCR扩增,甲基化的位点可以被当作一个C/T的SNP来处理,它的基因频率为0－100％.在此,我们给大家介绍一个研究人员使用Pyrosequencing技术分析并精确定量DNA甲基化水平的例子.
研究者在一个Pyrosequencing反应中同时检测了6个甲基化位点.这种方法同样可以用于石蜡包埋的组织,并且具有较高的重复性和精确性.实验选择谷胱甘肽-S-转移酶π（GSTP1）转录启动位点的CpG岛进行检测.这些位点在正常前列腺组织中是非甲基化的,而在肿瘤样本中高甲基化.通过PCR扩增一个包含17个甲基化多态位点140bp的片段,并用4个测序引物研究其中15个位点（Table 1）.使用在线的SNP测序引物设计软件（Pyrosequencing AB）设计测序引物,其中一些甲基化多态性位点用最可能的碱基所代替,以减少计算的数量.再通过人工检测测序引物可能存在的错配.此外,同时在PSQ 96MA DNA分析仪上运行空白对照,扣除由测序引物、生物素标记的引物或是模板引起的背景.
PCR引物设计完全与模板相匹配,不覆盖任何甲基化多态性区域.使用10ng亚硫酸氢盐转化的DNA样本或是10 fmol纯化的PCR产物,10 pmol 正向（5’-GTGATTTAGTATTGG-3’）和反向（5’-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3’）引物扩增GSTP1转录启动位点的基因片段,扩增片段长度为144bp.反应体系为60 mM Tris-SO4,pH 8.9,18 mM (NH4)2SO4,1 mM MgSO4,200 μM dNTPs,以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶,终体积为50μ循环设置：首先在95℃下变性4分钟,然后在95℃ 30S,50℃ 45S以及72℃ 20S条件下重复50个循环,最后一步延伸步骤在72℃下4分钟,中止反应.PCR反应在Eppendorf的Mastercycler 96
哺乳动物基因组中,DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原

求一篇分子生物学的论文

分子生物学技术在国内防制虫媒传染病领域的应用

【摘要】　本文综述了国内近年来,分子生物学技术在虫媒病中蚊媒传染病防制的应用情况,以期为蚊媒传
染病的防制、应对突发公共卫生事件中蚊媒传染病的发生提供参考。
【关键词】　分子生物学技术;虫媒;传染病

虫媒病是由节肢动物携带病原体传播的一组疾病。
1992年在国际虫媒病毒中心登记的已达535种,其中128
种对人有致病性[1]。我国法定报告的传染病中,虫媒病占
13种,蚊虫作为媒介,除了传播病毒性疾病外,还可传播
寄生虫病。这类疾病大都属于自然疫源性疾病,有一定的
地域性和时间性,发病率低、死亡率高,主要通过媒介的
控制进行防制[2]。近年来,随着分子生物学技术的研究和
发展,在医学领域的应用日趋广泛,并取得了重大进展,
作者就近年来分子生物学技术在蚊媒传染病的诊断和防制
等方面的应用综述如下。
1　常用的分子生物学技术[3]
1·1　核酸分子杂交技术
核酸的分子杂交(molecular hybridization)它是利用核
酸分子的碱基互补原则,在特定的条件下,双链解开成两
条单链,与异源的DNA或RNA (单链)复性,若异源
DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列,则在复
性时可形成杂交的核酸分子。杂交的双方是待测核酸序列
及探针。核酸探针可用放射性核素、生物素或其它活性物
质标记。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探
针、寡核苷酸探针、RNA探针等。
分类:根据被测定的对象,分为Southern杂交和
Northern杂交;根据所用的方法,分为斑点(dot)杂交、
狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交;根据环境条件:分为液
相杂交和固相杂交。
1·2　聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)
是以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板互
补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照
半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合
成。通过不断重复这一过程,可以使目的DNA片段得到扩
增,同时新合成的DNA片段也可以作为模板,使DNA的
合成量呈指数型增长。
PCR各种应用模式:兼并引物( degenerate primer)
pcr、套式引物(nested primer) pcr、复合pcr (multiplex
pcr)、反向pcr ( inverse pcr或reverse pcr)、不对称pcr
(asymmetric pcr)、标记pcr ( lp-pcr)和彩色pcr、加端
pcr、锚定pcr或固定pcr、玻片pcr、反转录pcr方法检测
rna、定量pcr。
1·3　DNA芯片
基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列
(DNA microarray)。是采用光导原位合成或显微印刷等方
法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相
应处理的载体上,然后加入标记的待测样品,进行多元杂
交,通过杂交信号的强弱及分布,来分析目的分子的有无、
数量及序列,从而获得受检样品的遗传信。特点:具有通
量大,并行性、微量化与自动化等优点,但在实践中其研
究成本较高;方法标准化不足;配套软件不够完善。
2　分子生物学技术在虫媒病诊断的应用
2·1　疟疾
黄炳成等[4]用pBF2 DNA片断,经标记后作探针,从
多种疟原虫DNA样本中检出恶性疟原虫。基因芯片在疟原
虫的研究内容还有疟原虫新基因发现[5]、转录因子调控网
络[6]、疟原虫适应人体宿主机制[7]、疟原虫比较基因组杂
交分析[8]、恶性疟原虫抗原变异分子机制[9]以及疟原虫攻
击红细胞机制[10]等。
2·2　丝虫病
黄志彪等[11]运用PCR技术检测血液中的班氏丝虫微
丝蚴,可检出lOOul阳性血样中的l条班氏丝虫微丝蚴;用
于检测班氏丝虫监测点540份血液样本结果均为阴性,镜
检血片结果亦为阴性。常规丝虫检测是在夜间采血,有资
料显示[12], SsP/PCR扩增系统可用于检测班氏丝虫病患
者血样中的循环DNA,能用于周期性或夜间周期性丝虫病
的日间血检工作,从根本上改变了丝虫病的诊断、监测和
工作方式。
2·3　登革热病
郑夔等[13]应用多重PCR技术快速鉴定4种血清型登
革病毒,并在同一反应管中进行多重PCR对登革病毒进行
分型鉴定,证实了2004年在广东发生的登革热疫情为I型
登革病毒;也有报道应用寡核苷酸芯片技术能同时确认流
感和登革热病毒[14]。长期受这种疾病困扰的地区将有望通
过这种技术的完善,获得有效的治疗和保护。

求一篇应用生物技术毕业论文，写分子结构分析的要用很多实验吗？

应用生物技术很多题目的，之前也没空写，还是同事介绍的莫’文网，相当快速的说，才几天功夫

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