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发布时间:2023-03-07 20:13

pvy论文范文

PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文,希望你能从中得到感悟!

技术的研究进展

摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点,已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述,并对其发展做出了展望。

关键词 PCR技术;研究进展;应用

中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02

PCR(polymerase chain reaction,PCR)即聚合酶链式反应,它是一种体外酶促合成,扩增特定DNA片段的方法。1985年,美国Karray等学者首创了PCR技术,并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破,PCR技术已在多个领域得到广泛地应用,如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性,又能快速进行检测,因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展,在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术,如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。

1 PCR技术原理

PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物,在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成,一个循环包括连续的3个步骤:第1步是高温条件下的DNA模板变性,即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火,即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸,即在4种dNTP底物同时存在的情况下,借助TaqDNA聚合酶的作用,引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后,合成了新链,可将其作为DNA模板继续反应,由此循环进行。循环进程中,扩增产物的量以指数级方式增加,一般单一拷贝的基因循环25~30次,DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单,但是具体的操作是复杂的,如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此,不同的反应体系应该确定适当的反应条件,以避免假阴性或假阳性等情况的产生。

2 PCR技术的分类

在传统PCR技术的基础上,根据人们的需要以及各个领域的应用要求,又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进,为进一步的研究提供了基础。

2.1 实时荧光定量PCR技术

1996年,学者经过研究,在传统PCR技术的基础上,首创了实时荧光定量PCR技术,新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势,还具有实时性、准确性、无污染,实现了自动化操作和多重反应,是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。

荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中,借助于荧光信号,累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的,因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行,无法对起始模板进行准确的定量,而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后,定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号,荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况,这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段,PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系,然后进行定量分析[13]。

2.2 多重PCR技术

多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种,为同一管中加入多对特异性引物,与PCR管内的多个模板反应,在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段,也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。

在同一反应体系中,多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时,引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面,如果能选择适宜的反应体系和反应条件,可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面,DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率,如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。

2.3 单分子PCR技术(SM-PCR)

单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的,基本循环过程相同,但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。

单分子PCR技术反应中,DNA 模板浓度极低,这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时,应该严格控制GC的含量和Tm值,同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下,若引物之间存在少量配对序列,扩增时极易形成二聚体,使反应无法进行,得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高,因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格,需要有较好的热稳定性,以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。

3 PCR技术的应用

3.1 PCR技术在水产上的应用

基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化,或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21],研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响,表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大,可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常,并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达,这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料,采用实时荧光定量PCR技术,检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量,表明在各组织中均有2种基因的表达,但表达量显著不同,呈现组织特异性。

3.2 PCR技术在微生物检测上的应用

1990年,Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌,其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物,表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势,较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价,结果显示,样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。

4 展望

传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来,已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善,荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面,其次是整合应用多重PCR与其他技术,必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。

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求一篇关于 基因工程利于弊的论文 3000-3500字

20世纪后期,生物工程迅速发展,给人类生活
带来了巨大的变化。有人说,生物工程给人类带来
了更大的希望,也有人说,它也会相应给人类带来灾
难。学者们众说纷纭,褒贬不一。其中,植物转基因
工程更是如此。
植物转基因工程就是指通过基因枪等基因工程
手段,将一种或几种外源基因转移到原本不具有这
些基因的植物体内,并使之有效表达,产生相应性
状,这种具有相应性状的植物称之为转基因植物。
1983年,第一例转基因植物———转基因烟草问
世。从此,转基因植物的研究就以惊人的速度发展,
人类看到了更大的希望。1986年,抗虫和抗除草剂
的转基因棉花首次进入田间实验,此后转基因植物
在全球范围内飞速发展,种植面积不断扩大,给人类
带来了非常明显的经济效益。在这同时,人类也注
意到了它可能潜在着的一系列危害,即可能对环境
产生不利影响,影响到生物多样性的保护和持续利
用,并且对人类健康也可能有潜在的危害。
1 转基因植物的利用
植物转基因工程的目的旨在通过导入有用的外
源基因,获得转基因植物,用于植物的改良和有效成
分的生产。目前在抗除草剂、抗虫、抗病、控制果实
成熟以及植物生物反应器等方面已获得了一系列令
人鼓舞的成果。
1.1 抗除草剂的转基因植物
化学除草剂在现代农业中起着十分重要的作
用,理想的除草剂必须具有高效、广谱的杀草能力,
而对作物及人畜无害。但这样的除草剂成本越来越
高,通过转基因技术,在作物中导入抗除草剂基因,
获得抗除草剂作物,就能有效地解决这些问题,提高
经济效益,使除草剂的应用更加方便。据报道,现已
成功地获得了转aro A基因的番茄、油菜、大豆、杨
树等,在田间试验中表现出对除草剂的良好抗性。
1.2 抗虫的转基因植物
虫害对农业生产的危害非常严重,如能在植物
体内转入抗虫基因,使植物获得抗虫性,增加对虫害
的抵抗力,将对农业生产具有重要意义。基于这个
目的,人们现已成功地将苏云金芽孢杆菌(Bacillus
thurigiensis)的B.t毒蛋白基因转入了烟草、番茄、马
铃薯、甘蓝、棉花、杨树等植物,使这些植物获得了抗
虫性。
1.3 抗病的转基因植物
据报道,将烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒
(CMV)、马铃薯X和Y病毒(PVX和PVY)、大豆花
叶病毒(SMV)、苜蓿花叶病毒(AIMV)等病毒的外壳
蛋白基因导入不同的植物体后,这些植物均获得了
对相应病毒的抗性,这有望应用于农业生产。
1.4 抗逆的转基因植物
68
小分子化合物(如脯氨酸、甜菜碱、葡萄糖等)与
植物忍受环境渗透胁迫的能力有关,人们若能将与
脯氨酸或甜菜碱等合成有关的酶的基因克隆后转入
植物,有望提高植物对干旱和盐碱等逆境的抗性。
有报道说,人们现已成功地将相关基因转入了烟草、
苜蓿、马铃薯等植物,使它们获得了对不同逆境的抗
性。
1.5 植物生物反应器生产药物蛋白
生物反应器(bioreactor)是指利用生物系统大规
模生产有重要商业价值的外源蛋白质,用于医疗保
健和科学研究。将不同的基因转入植物,可使转基
因植物产生植物抗体、口服疫苗、植物药物和人类蛋
白质等。据报道,到目前为止,人们已成功地获得了
4种具有潜在医疗价值的植物抗体。
2 转基因植物存在的潜在风险
2.1 转基因作物对生态环境的潜在风险
在耕地上栽种那些实验室里培育出来的转基因
植物可能会对生态环境造成许多负面影响,转基因
植物对非目标生物可能造成危害,转基因植物通过
基因漂变对其它物种也可能产生有害影响。
2.2 对人类健康的潜在危害
转基因食品里的新基因可能对消费者造成健康
威胁,因为转基因植物是在传统植物接受了动物、植
物、微生物的基因的基础上形成的,所以很可能对人
类健康产生影响。人们正在关注这样一些问题:毒
性问题、过敏反应问题、对抗生素的抵抗作用问题、
营养问题等。
3 展望
20世纪末生物技术取得了突飞猛进的发展,其
涉及面之广、进展之快乃前所未有。从1986年美国
批准第一个转基因作物进行大田试验,至1999年4
月,已有4987个转基因作物被批准进行大田试验。
自1994年至1999年五年间转基因农作物的种植面
积增加了23倍多。美国的转基因抗虫棉花的种植
面积已占其棉花总种植面积的13%。
从发展趋势看,转基因植物将向多元化发展,例
如品质改良、高产、抗逆(抗旱、抗寒、抗低光照、耐盐
碱、耐瘠薄等)的基因工程发展。
随着转基因技术的深入发展,人们也将把转基
因植物应用到医药化工领域,建立基因工厂,从而利
用转基因植物生产各种化工原料和药品,摆脱传统
化工厂对日益短缺的化工原料的依赖和生产过程中
对环境的严重污染。
在21世纪,科学技术更加透明,更加公平,人们
需要更多、更大的知情权,所以,国际社会对这个问
题给予了极大关注,各国政府也高度重视。争论本
身就是推动社会前进的动力。通过争论,弄清是非,
避免破坏性后果的发生,这将推动科学技术沿着健
康的道路发展前进。
任何科学技术都不应该滥用,但也不能扼杀能
给人类和社会创造巨大财富的技术成果。在应用植
物转基因工程技术中,人类应该像对待其它科学技
术一样,扬长避短,全面、理性地看问题,把握尺度,
使植物转基因工程更加健康地发展,造福全人类。

温孚江的发表论文

在国内外学术刊物上发表研究论文300余篇。⒈ Bhattacharyya-Pakrasi,M.,Peng,J.,Elmer,J.S.,Laco,G.,Shen,P.,Kaniewska,M.B.,Kononowicz,H.,Wen,F., Hodges,T. K.,and Beachy,R. N. 1993. Specificity of a promoter from the rice tungro bacilliform virus for expression in phloem tissues. The Plant Journal 4: 71-79.⒉ Boogaart Tom van de,Wen F J,Davies J W,Lomonossoff G P. Replicase-derived resistance against pea early browning virus in Nicotiana benthamiana is an unstable resistance based upon posttranscriptional gene silencing. MPMI.2001,14⑵:196-203⒊ Chang-xiang Zhu,Yun-zhi Song,Guo-hua Yin,and Fu-jiang Wen. Induction of RNA-Mediated Multiple Virus Resistance to Potato Y,Tomato mosaic and Cucumber mosaic viruses. Journal of Phytopathology,2009,157,101–107。⒋ Guohua Yin & Zhaonan Sun & Nan Liu & Lin Zhang & Yunzhi Song & Changxiang Zhu & Fujiang Wen. Production of double-stranded RNA for interference with TMV infection utilizing a bacterial prokaryotic expression system. Appl Microbiol Biotechnol,2009,84:323–333⒌ H. M. 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