电滑板车毕业论文

电滑板车毕业论文

前 言
机床是人类进行生产劳动的重要工具，也是社会生产力发展水平的重要标志。
普通机床经经历了近两百年的历史。随着电子技术、计算机技术及自动化，精密机械与测量等技术的发展与综合应用，生产了机电一体化的新型机床一一数控机床。数控机床一经使用就显示出了它独特的优越性和强大生命力，使原来不能解决的许多问题，找到了科学解决的途径。
数控车床是数字程序控制车床的简称，它集通用性好的万能型车床、加工精度高的精密型车床和加工效率高的专用型车床的特点于一身，是国内使用量最大，覆盖面最广的一种数控机床，也是是一种通过数字信息，控制机床按给定的运动轨迹，进行自动加工的机电一体化的加工装备，经过半个世纪的发展，数控机床已是现代制造业的重要标志之一，在我国制造业中，数控机床的应用也越来越广泛，是一个企业综合实力的体现。
实 习 报 告 正 文
自从走进了大学，就业问题就似乎总是围绕在我们的身边，成了说不完的话题。在现今社会，招聘会上的大字报都总写着“有经验者优先”，可还在校园里面的我们这班学子社会经验又会拥有多少呢？为了拓展自身的知识面，扩大与社会的接触面，增加个人在社会竞争中的经验，锻炼和提高自己的能力，以便在以后毕业后能真正真正走入社会，能够适应国内外的经济形势的变化，并且能够在生活和工作中很好地处理各方面的问题，在这个假期里我开始了自己的校外实习。.
，把所学的理论知识，运用到客观实际中去，使自己所学的理论知识有用武之地。只学不实践，所学的就等于零,理论应该与实践相结合.另一方面，实践可为以后找工作打基础.通过这段时间的实习，学到一些在学校里学不到的东西。因为环境的不同，接触的人与事不同，从中所学的东西自然就不一样了。要学会从实践中学习，从学习中实践.而且在中国的经济飞速发展，又加入了世贸，国内外经济日趋变化，每天都不断有新的东西涌现，在拥有了越来越多的机会的同时，也有了更多的挑战，中国的经济越和外面接轨，对于人才的要求就会越来越高，我们不只要学好学校里所学到的知识，还要不断从生活中，实践中学其他知识，不断地从各方面武装自已，才能在竞争中突出自已，表现自已。
1. F功能
F功能指令用于控制切削进给量。在程序中，有两种使用方法。
(1)每转进给量
编程格式 G95 F~
F后面的数字表示的是主轴每转进给量，单位为mm/r。
如：G95 F0.2 表示进给量为0.2 mm/r。
(2)每分钟进给量
编程格式G94 F~
F后面的数字表示的是每分钟进给量，单位为 mm/min。
如：G94 F100 表示进给量为100mm/min。
2. S功能
S功能指令用于控制主轴转速。
编程格式 S~
S后面的数字表示主轴转速，单位为r/min。在具有恒线速功能的机床上，S功能指令还有如下作用。
(1)最高转速限制
设定加工坐标系
编程格式 G50 S～
S后面的数字表示的是最高转速：r/min。
如：G50 S3000 表示最高转速限制为3000r/min。
(2)恒线速控制
编程格式 G96 S～
S后面的数字表示的是恒定的线速度：m/min。
如：G96 S150 表示切削点线速度控制在150 m/min。
(3)恒线速取消
编程格式 G97 S～
S后面的数字表示恒线速度控制取消后的主轴转速，如S未指定，将保留G96的最终值。
如：G97 S3000 表示恒线速控制取消后主轴转速3000 r/min。
3. T功能
T功能指令用于选择加工所用刀具。
编程格式 T～
T后面通常有两位数表示所选择的刀具号码。但也有T后面用四位数字，前两位是刀具号，后两位是刀具长度补偿号，又是刀尖圆弧半径补偿号。
例：T0303 表示选用3号刀及3号刀具长度补偿值和刀尖圆弧半径补偿值。
T0300 表示取消刀具补偿。
4. M功能
M00： 程序暂停，可用NC启动命令（CYCLE START）使程序继续运行；
M01：计划暂停，与M00作用相似，但M01可以用机床“任选停止按钮”选择是否有效；
M03：主轴顺时针旋转；
M04：主轴逆时针旋转；
M05：主轴旋转停止；
M08：冷却液开；
M09：冷却液关；
M30：程序停止，程序复位到起始位置。
5. 加工坐标系设置G50
编程格式 G50 X～ Z～
式中X、Z的值是起刀点相对于加工原点的位置。G50使用方法与G92类似。
在数控车床编程时，所有X坐标值均使用直径值，如图所示。
如：按图设置加工坐标的程序段如下：
G50 X128.7 Z375.1
6. 快速定位指令G00
G00指令命令机床以最快速度运动到下一个目标位置，运动过程中有加速和减速，该指令对运动轨迹没有要求。其指令格式：
G00 X(U)____ Z(W)____；
当用绝对值编程时，X、Z后面的数值是目标位置在工件坐标系的坐标。当用相对值编程时，U、W后面的数值则是现在点与目标点之间的距离与方向。如图所示的定位指令如下：
G50 X200.0 Z263.0; 设定工件坐标系
G00 X40.0 Z212.0； 绝对值指令编程A→C
或G00 U-160.0 W-51.0； 相对值指令编程A→C
因为X轴和Z轴的进给速率不同，因此机床执行快速运动指令时两轴的合成运动轨迹不一定是直线，因此在使用G00指令时，一定要注意避免刀具和工件及夹具发生碰撞。如果忽略这一点，就容易发生碰撞，而快速运动状态下的碰撞就更加危险
7. 直线插补指令G01
G01指令命令机床刀具以一定的进给速度从当前所在位置沿直线移动到指令给出的目标位置。
指令格式：G01 X(U)____Z(W)____F ；
其中F是切削进给率或进给速度，单位为mm/r或mm/min，取决于该指令前面程序段的设置。使用G01指令时可以采用绝对坐标编程，也可采用相对坐标编程。当采用绝对坐编程时，数控系统在接受G01指令后，刀具将移至坐标值为X、Z的点上；当采用相对坐编程时，刀具移至距当前点的距离为U、W值的点上。如图所示的直线运动指令如下：
G01 X40.0 Z20. F0.2; 绝对值指令编程
G01 U20.0 W-25.9 F0.2; 相对值指令编程
8. 圆弧插补指令G02、G03
圆弧插补指令命令刀具在指定平面内按给定的F进给速度作圆弧插补运动，用于加工圆弧轮廓。圆弧插补命令分为顺时针圆弧插补指令G02和逆时针圆弧插补指令G03两种。其指令格式如下：
顺时针圆弧插补的指令格式：G02 X(U)____Z(W)____I____K____F____；
G02 X(U)____Z(W)___R___ F____；
逆时针圆弧插补的指令格式：G03 X(U)____Z(W)____ I____K____F____；；
G03 X(U)____Z(W)___R___ F____；
使用圆弧插补指令，可以用绝对坐标编程，也可以用相对坐标编程。绝对坐标编程时，X、Z是圆弧终点坐标值；增量编程时，U、W是终点相对始点的距离。圆心位置的指定可以用R，也可以用I、K，R为圆弧半径值；I、K为圆心在X轴和Z轴上相对于圆弧起点的坐标增量; F为沿圆弧切线方向的进给率或进给速度。
当用半径R来指定圆心位置时，由于在同一半径R的情况下，从圆弧的起点到终点有两种圆弧的可能性，大于180°和小于180°两个圆弧。为区分起见，特规定圆心角α≤180°时，用“+R”表示；α>180°时，用“-R”。注意：R编程只适于非整圆的圆弧插补的情况，不适于整圆加工。例如，图3-13中所示的圆弧从起点到终点为顺时针方向，其走刀指令可编写如下：
G02 X50.0 Z30.0 I25.0 F0.3； 绝对坐标，直径编程，切削进给率0.3mm/r
G02 U20.0 W-20.0 I25.0 F0.3； 相对坐标，直径编程，切削进给率0.3mm/r
G02 X 50. 0 Z30.0 R25.0 F0.3； 绝对坐标，直径编程，切削进给率0.3mm/r
G02 U20.0 W-20.0 R25.0 F0.3； 相对坐标，直径编程，切削进给率0.3mm/r
9. 暂停指令G04
G04指令用于暂停进给，其指令格式是：
G04 P____或G04 X(U)____
暂停时间的长短可以通过地址X(U)或P来指定。其中P后面的数字为整数，单位是ms；X(U)后面的数字为带小数点的数，单位为s。有些机床，X(U)后面的数字表示刀具或工件空转的圈数。
该指令可以使刀具作短时间的无进给光整加工，在车槽、钻镗孔时使用，也可用于拐角轨迹控制。例如，在车削环槽时，若进给结束立即退刀，其环槽外形为螺旋面，用暂停指令G04可以使工件空转几秒钟，即能将环形槽外形光整圆，例如欲空转2.5s时其程序段为： G04 X2.5或G04 U2.5或G04 P2500；
G04为非模态指令，只在本程序段中才有效。
10. 英制和米制输入指令G20、G21
G20表示英制输入，G21表示米制输入。G20和G21是两个可以互相取代的代码。机床出厂前一般设定为G21状态，机床的各项参数均以米制单位设定，所以数控车床一般适用于米制尺寸工件加工，如果一个程序开始用G20指令，则表示程序中相关的一些数据均为英制(单位为英寸)；如果程序用G21指令，则表示程序中相关的一些数据均为米制(单位为mm)。在一个程序内，不能同时使用G20或G21指令，且必须在坐标系确定前指定。G20或G21指令断电前后一致，即停电前使用G20或G21指令，在下次后仍有效，除非重新设定。
11. 进给速度量纲控制指令G98、G99
在数控车削中有两种切削进给模式设置方法，即进给率(每转进给模式)和进给速度(每分钟进给模式)。
（1）进给率，单位为mm/r，其指令为：
G99； 进给率转换指令
G01X____Z____F____； F的单位为mm/r
(2)进给速度，单位为mm/min，其指令为： ．
G98； 进给速度转换指令
G01X____Z____F____； F的单位为mm/min
G98和G99都是模态指令，一旦指定就一直有效，直到指定另一方式为止。车削CNC系统缺省的进给模式是进给率，即每转进给模式，只有在用动力刀具铣削时才采用每分钟进给模式。
12. 参考点返回指令G27、G28、G30
参考点是CNC机床上的固定点，可以利用参考点返回指令将刀架移动到该点。可以设置最多四个参考点，各参考点的位置利用参数事先设置。接通电源后必须先进行第一参考点返回，否则不能进行其它操作。参考点返回有两种方法：
(1)手动参考点返回。
(2)自动参考点返回。该功能是用于接通电源已进行手动参考点返回后，在程序中需要返回参考点进行换刀时使用的自动参考点返回功能。
自动参考点返回时需要用到如下指令：
（1）返回参考点检查G27
G27用于检验X轴与Z轴是否正确返回参考点。指令格式为：
G27 X(U)____ Z(W)____
X(U)、Z(W)为参考点的坐标。执行G27指令的前提是机床通电后必须手动返回一次参考点。
执行该指令时，各轴按指令中给定的坐标值快速定位，且系统内部检查检验参考点的行程开关信号。如果定位结束后检测到开关信号发令正确，则参考点的指示灯亮，说明滑板正确回到了参考点位置；如果检测到的信号不正确，系统报警，说明程序中指令的参考点坐标值不对或机床定位误差过大。
（2）参考点返回指令G28、G30
G28 X(U) ____ Z(W) ____； 第一参考点返回，其中X(U)、Z(W)为参考点返回时的中间点，X、Z为绝对坐标，U、W为相对坐标。参考点返回过程如图3-14所示。
G30 P2 X(U)____ Z(W)____； 第二参考点返回，P2可省略
G30 P3 X(U)____ Z (W)____； 第三参考点返回
G30 P4 X(U)____ Z(W)____； 第四参考点返回
第二、第三和第四参考点返回中的X(U)、Z (W)的含义与G28中的相同。
刀具返回参考点的过程，刀具从当前位置经过中间点(190，50)返回参考点，其指令为：G30 X190 Z50；G30 U100 W30。
数控机床一般由输入装置、数控系统、伺服系统、测量环节和机床本体(组成机床本体的各机械部件)组成。如数控机床组成示意图所示。
数控机床组成示意图
1) 输入输出装置
操作面板
它是操作人员与数控装置进行信息交流的工具组成：按钮站/状态灯/按键阵列/显示器。下图为西门子的一款数控系统的操作面板，
控制介质
人与数控机床之间建立某种联系的中间媒介物就是控制介质，又称为信息载体。常用的控制价质有穿孔带、穿孔卡、磁盘和磁带。
人机交互设备
数控机床在加工运行时，通常都需要操作人员对数控系统进行状态干预，对输入的加工程序进行编辑、修改和调试，对数控机床运行状态进行显示等，也就是数控机床要具有人机联系的功能。具有人机联系功能的设备统称人机交互设备。常用的人机交互设备有键盘、显示器、光电阅读机等。
通讯 现代的数控系统除采用输入输出设备进行信息交换外，一般都具有用通讯方式进行信息交换的能力。它们是实现CAD/CAM的集成、FMS和CIMS的基本技术。采用的方式有：
串行通讯（RS-232等串口）
自动控制专用接口和规范（DNC方式，MAP协议等）
网络技术（internet，LAN等）。
DNC是Direct Numerical Control或Distributed Numerical Control英文一
词的缩写，意为直接数字控制或分布数字控制。
2) 计算机数控（CNC）装置
数控装置是数控机床的中枢。CNC装置(CNC单元)
组成：计算机系统、位置控制板、PLC接口板，通讯接口板、特殊功能模块以及相应的控制软件。
作用：根据输入的零件加工程序进行相应的处理（如运动轨迹处理、机床输入输出处理等），然后输出控制命令到相应的执行部件(伺服单元、驱动装置和PLC等)，所有这些工作是由CNC装置内硬件和软件协调配合，合理组织，使整个系统有条不紊地进行工作的。CNC装置是CNC系统的核心
3) 进给伺服驱动系统
进给伺服驱动系统由伺服控制电路、功率放大电路和伺服电动机组成。伺服驱动的作用，是把来自数控装置的位置控制移动指令转变成机床工作部件的运动，使工作台按规定轨迹移动或精确定位，加工出符合图样要求的工件，即把数控装置送来的微弱指令信号，放大成能驱动伺动电动机的大功率信号。
常用的伺服电动机有步进电动机、直流伺服电动机和交流伺服电动机。根据接收指令的不同，伺服驱动有脉冲式和模拟式，而模拟式伺服驱动方式按驱动电动机的电源种类，可分为直流伺服驱动和交流伺服驱动。步进电动机采用脉冲驱动方式，交、直流伺服电动机采用模拟式驱动方式。
4) 机床电气控制
机床电气控制包括两个方面，可如图所示箭头所指的内容。PLC（可编程的逻辑控制器）用于完成与逻辑运算有关顺序动作的I/O控制，而机床I/O电路和装置则是用来 实现I/O控制的执行部件，由继电器、电磁阀、行程开关、接触器等组成的逻辑电路；
5) 测量装置
数控机床中的测量装置
数控机床中的反馈系统的工作，反馈系统的作用是通过测量装置将机床移动的实际位置、速度参数检测出来，转换成电信号，并反馈到CNC装置中，使CNC能随时判断机床的实际位置、速度是否与指令一致，并发出相应指令，纠正所产生的误差。在其它的控制领域，测量装置也有其应用
机械手中的控制电机与测量装置
测量装置安装在数控机床的工作台或丝杠上，按有无检测装置，CNC系统可分为开环和闭环系统，而按测量装置安装的位置不同可分为闭环与半闭环数控系统。开环控系统无测量装置，其控制精度取决于步进电机和丝杠的精度，闭环数控系统的精度取决于测量装置的精度。因此，检测装置是高性能数控机床的重要组成部分。
6) 机床本体
数控机床的机械部件包括：主运动部件，进给运动执行部件，如工作台、拖板及其传动部件，床身、立柱等支承部件；此外，还有冷却、润滑、转位和夹紧等辅助装置。对于加工中心类的数控机床，还有存放刀具的刀库，交换刀具的机械手等部件。数控机床是高精度和高生产率的自动化加工机床，与普通机床相比，应具有更好的抗振性和刚度，要求相对运动面的摩擦因数要小，进给传动部分之间的间隙要小。所以其设计要求比通用机床更严格，加工制造要求精密，并采用加强刚性、减小热变形、提高精度的设计措施。辅助控制装置包括刀库的转位换刀
以上是一般数控车床的组成结构，在实习的过程中，我了解了一下公司生产的CJK0620型的数控机床，它由以下单元组成：变频器（型号lnovance），两个全数字交流伺服单元（型号 SD20B），控制变压器（型号BK1500，容量1.5KV/A,频率50-60HZ，机级电压380V，次级电压220V），控制变压器（型号BK150，容量150V/A，频率50-60HZ，绝缘等级B，机级电压380V，次级电压11-12：36V；11-13：220V），风扇一个，丝杆两个，工作台，两个交流伺服电机，刀架，润滑装置，拖板等等
尾 声
时光如流水，两周的时间转眼即逝，这次实习给我的体会是：
① 通过这次实习我们了解了现代数控机床的生产方式和工艺过程。熟悉了一些材料的成形方法和主要机械加工方法及其所用主要设备的工作原理和典型结构、工夹量具的使用以及安全操作技术。了解了数控机床方面的知识和新工艺、新技术、新设备在机床生产上的应用。
② 在数控机床的生产装配以及调试上，具有初步的独立操作技能。
③ 在了解、熟悉和掌握一定的数控机床的基础知识和操作技能过程中，培养、提高和加强了我的动手能力、创新意识和创新能力。
④ 这次实习，让我们明白做事要认真小心细致，不得有半点马虎。同时也培养了我们坚强不屈的本质，不到最后一秒决不放弃的毅力！
⑤培养和锻炼了劳动观点、质量和经济观念，强化遵守劳动纪律、遵守安全技术规则和爱护国家财产的自觉性，提高了我们的整体综合素质。
是的，课本上学的知识都是最基本的知识，不管现实情况怎样变化，抓住了最基本的就可以以不变应万变。如今有不少学生实习时都觉得课堂上学的知识用不上，出现挫折感，可我觉得，要是没有书本知识作铺垫，又哪应付瞬息万变的社会呢？经过这次实习，虽然时间很短，可我学到的却是我一个学期在学校难以了解的。就比如何与同事们相处，相信人际关系是现今不少大学生刚踏出社会遇到的一大难题，于是在实习时我便有意观察前辈们是如何和同事以及上级相处的，而自己也尽量虚心求教。要搞好人际关系并不仅仅限于本部门，还要跟别的部门例如市场部的同事相处好，那工作起来的效率才高，人们所说的“和气生财”在我们的日常工作中也是不无道理的。而且在工作中常与前辈们聊聊天不仅可以放松一下神经，而且可以学到不少工作以外的事情，尽管许多情况我们不一定遇到，可有所了解做到心中有底，也算是此次实习的其中一个目的了。
很快我们就要步入社会，面临就业了，就业单位不会像老师那样点点滴滴细致入微地把要做的工作告诉我们，更多的是需要我们自己去观察、学习。不具备这项能力就难以胜任未来的挑战。随着科学的迅猛发展，新技术的广泛应用，会有很多领域是我们未曾接触过的，只有敢于去尝试才能有所突破，有所创新。就像我在实习中接触到的零件的加工，虽然它的危险性很大，但是要亲自去操作而且要作出成品，这样就锻炼了我敢于尝试的勇气。

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软件设计毕业设计论文题目如何拟定，大家有参考的范文吗?以下是我为大家整理的关于软件设计毕业设计论文题目，希望大家喜欢!

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2) 导波结构健康监测系统软件数据管理模块设计

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5) 基于蚁群算法的自动化立体车库监控软件的优化设计

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7) 不同种植设计软件对种植体位置偏差的影响

8) 玉米自动考种流水线控制系统设计--基于MCGS嵌入式组态软件

9) 嵌入式实时软件在计算机软件设计中的运用研究

10) 嵌入式实时软件在计算机软件设计中的运用

11) 测控数据实时监测软件设计方法研究

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14) 无人机地面在线检测软件的设计

15) 配网数字化规划设计档案一体化软件设计研究

16) 嵌入式系统设计实验的Qt MIPS仿真软件开发

17) Solidworks参数化设计软件在我国家具研发中的应用

18) 会议电视系统平板会控软件设计与实现

19) 锅炉设计中引入三维设计软件的思考

20) 平面设计软件与DICOM图像数据处理技术

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22) 无人机飞控计算机自动测试软件设计与开发

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24) 面向掩星观测的软件接收机设计

25) 基于软件通信体系结构的波形FPGA软件设计方法

26) 基于MATLAB的`同步发电机原动机及其调速系统参数辨识与校核可视化软件设计

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28) 面向大数据处理的内容服务器软件设计与实现

29) 基于Android终端的企业即时通信软件的设计与实现

30) 临时限速服务器软件设计优化研究

31) 锥形束CT与simplant软件辅助设计模拟种植下颌牙列缺损的临床研究

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33) 电网规划数据处理辅助软件的流程设计

34) GPS农田平地机土方量及设计高程计算软件开发

35) 基于STC89C52的智能台灯软件设计

36) 浅析计算机平面设计中设计软件的相互结合与应用

37) 商业固体激光器设计软件应用研究

38) 体育运动会比赛软件系统的设计与研究

39) 综合化航空电子系统网络传输延迟测试软件设计

40) 基于XML的监控软件快速设计技术

41) 基于三维动画软件的服装设计分析与研究

42) 基于Matlab的水与蒸汽热力学性质查询软件设计

43) 机顶盒软件模块设计及实现

44) 剪纸拼接与PS软件设计截骨矫正强直性脊柱炎后凸畸形的对比

45) 基于联合辅助设计软件的试验仪控数字化平台开发

46) ZBrush数字雕刻软件在电脑首饰设计中的应用

47) 对以用户体验为导向的智能手机应用软件界面设计的几点探讨

48) 点云数据生成软件的设计及其在月饼模具逆向设计与制造中的应用

49) 一种新型的有源交错并联Boost软件开关电路设计

50) 基于第一创造法的可拓创新软件设计

51) 基于DCS的工程项目设计软件介绍

52) 一种复杂模式网传数据软件模拟器的设计

53) VB环境下交互式GMT地学绘图软件的设计及实现

54) 基于等效的单体包装机软件模块化设计研究

55) 基于Visual Basic的工程数量计算软件设计与开发

56) 基于数据库的油气管道线路施工图设计软件二次开发

57) 基于EDA软件的滤波器设计

58) 基于Android的可配置工业远程监控软件设计与实现

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61) 老年人的握力测量软件沉浸式界面设计

62) 基于XMPP协议的Android即时通信软件的设计与实现

63) CFD软件自动化验证确认云平台设计与实现

64) 基于模糊聚类的色选机上位软件系统研究与设计

65) 双排桩支护结构理正软件设计计算与有限元(MIDAS/GTS)模拟分析

66) 移动端智能手机软件产品的UI设计研究

67) 基于ZYNQ的软件无线电平台设计与实现

68) 基于面向对象的纸机传动系统软件设计的研究

69) 软件企业设计人员胜任力模型研究

70) 算法可视化软件设计中关键问题的研究

71) 基于参与式设计方法的移动端烹饪软件界面设计研究

72) 支持语音识别功能的Andriod记事本软件设计与实现

73) 中小企业财务软件设计与应用

74) 基于Android的便携式心电监护系统软件的设计

75) 通用测试系统软件架构及关键技术的设计与实现

76) 基于双DSP的制导飞行器控制系统的软件设计

77) 达芬奇技术下的视频处理及传输系统的软件设计与实现

78) 基于SolidWorks的管壳式换热器辅助设计软件研究

79) 医学影像处理与分析软件平台设计与实现

80) 软件园研发建筑空间形态设计研究

81) 基于数据库的滑动轴承设计计算软件开发

82) 基于AutoCAD的滴灌工程设计软件研究与实现

83) 基于Gaudi的CSR外靶实验数据处理软件框架设计

84) 轮式起重机回转系统设计计算软件开发

85) 轮式起重机转向系统设计计算软件开发

86) CS公司软件开发人员薪酬体系优化设计研究

87) 基于可拓创新方法的产品创新软件设计与实现

88) 数字示波器自动校准软件设计

89) 基于Linux的多功能监护仪软件设计

90) CFETR设计软件集成平台研发

产品设计毕业论文题目怎么写啊？我们是小组，方案是儿童滑板车设计，

在题目中也许已经限定了写什么人，
什么时间、什么地点的人。如《我的辅导员
》就限定了必须使用第一人称；有的在材料中要求写你
身边的人；有的材料要求写在学校和在家里，一个人的不同表现；有的题目是《爸爸变了》就要求你写以前和现在爸爸的不同样貌

求毕业论文超光学分辨率的NSOM(近场扫描光学显微镜)探讨，的文献综述

　　高分辨率光学显微术在生命科学中的应用

　　【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。

　　【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平

　　在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。

　　1 传统光学显微镜的分辨率

　　光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。

　　根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：

　　横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■

　　轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■

　　可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径N.A等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。

　　Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。

　　2 高分辨率三维显微术

　　在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。

　　2.1 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。

　　共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。

　　3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。

　　2.2 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。

　　2.3 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达0.01nm，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上Kir2.1离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。

　　2.4 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。

　　3 表面高分辨率显微术

　　表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。

　　3.1 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。

　　3.2 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。

　　3.3 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。

　　1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。

　　【参考文献】
　　[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.

　　[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et ational adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.

　　[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.

　　[4] Goldman RD,Spector cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.

　　[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et -adaptive deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.

　　[6] 李栋栋,郭学彬,瞿安连.以三维荧光反卷

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