细菌培养检测论文

细菌培养检测论文

微生物检验技术试验教学是重要的组成部分,该学科具有较高的实践应用性,下面我给大家分享微生物检验技术论文，大家快来跟我一起欣赏吧。

微生物检验技术在感染控制中的应用

摘要：目的：对微生物检验技术在感染控制中的应用价值进行探讨和研究。

方法：选取我院2012年1月-2013年6月收治的尿路感染患者288例，经中段尿培养临床分离的大肠埃希氏菌288株，随机分成两组，每组144株，其中进行常规治疗的同时进行微生物检验的一组设为观察组，另一组只进行常规治疗设为比对组。对微生物检验的临床感染控制中的应用价值进行研究和探讨。

结果：观察组患者的感染率、感染程度均明显低于比对组患者，P<0.05，差异具有统计学意义。

结论：微生物检验对感染的发生率有明显的降低，对临床感染的控制和治疗有明显的提高，具有较好的临床价值，值得在临床中广泛推广和应用。

关键词：微生物检验感染控制监测

【中图分类号】R9 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801(2013)09-0470-02

随着现代医学技术的不断提高，许多化学药物治疗、介入性治疗和放射性治疗等在临床中的应用也日益广泛，而这些治疗容易引发耐药菌株的出现，导致医院感染的发生率逐年增高。患者在医院治疗的过程中，发生感染，并且出现感染的临床症状，这便是医院感染，这种感染一般情况下，具有一定的潜伏期，因此，只要患者的感染症状具备医院感染的范畴，都属于医院感染。医院感染已经成为医学领域亟待解决的重要问题，我院于2012年1月-2013年6月，选取收治的尿路感染患者288例，对微生物检验技术在感染控制中的临床应用效果进行研究，效果显著，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料。选取2012年1月-2013年6月，我院收治的尿路感染患者288例，经中段尿培养临床分离288株大肠埃希氏菌，随机分成两组，每组144株。其中，男性患者156例，女性患者132例，年龄在2-58岁，平均年龄为(48.5±6.5)岁。住院时间平均(18.5±1.8)天。两组患者在年龄、性别和住院时间等临床资料都没有没有明显的差异，P>0.05，具有可比性。

1.2方法。观察组的144例患者采集的144株大肠埃希氏菌，采用微生物检验技术进行检测。具体操作如下：①采用ID32E试条，对大肠埃希氏菌标本进行纯菌种后，进行细菌鉴定;②采用ATB-5试条进行药敏实验;③检测时使用法国梅里埃半自动微生物分析仪进行;④采用K-B法进行确诊实验;⑤观察组患者根据检验结果进行药物治疗，比对组进行常规治疗。

1.3统计学处理。SPSS17.0软件;t检验;P<0.05，具有统计学意义。

2结果

观察组患者经过微生物检验结果显示，感染程度和感染率均低于比对组患者，P<0.05，具有统计学意义，详见表1和表2。

3讨论

随着各种化学药物治疗、介入性治疗以及放射性治疗、抗生素等在临床中的频繁应用，致使医院感染现象频发，发生率逐渐增高，严重影响着患者的健康，因此，对于医院感染的诊断势在必行。目前，诊断最为精确地方法是微生物检验技术，通过检验可以为医生提供更多，更准确的诊断信息，为医生制定进一步治疗的科学依据。尿路感染的诊断标准为：患者出现尿频、尿急和尿痛、以及尿不尽等现象，但是情况不严重，只是偶尔出现，尿液中细菌尿、血尿、气尿和脓尿等情况都只是微量的，患者也出现比较轻微的腰部酸痛，这种情况为轻度感染;患者出现经常性的尿频、尿急、尿痛和尿不尽，尿液中出现细菌尿、血尿、气尿和脓尿等现象比较多，患者出现腰部酸痛，但是还能够忍受，这种情况为中度感染;患者开始出现频繁的尿急、尿频、尿痛和尿不尽现象，患者甚至无法自身控制，尿液中细菌尿、血尿、气尿和脓尿等现象严重，患者腰部酸痛无法忍受，这种情况为重度感染。

微生物检验已经成为当前医学领域研究的重要方向，成为最重要的生命科学之一。通过微生物检验可以对临床感染进行有效的监测，指导进一步的临床感染的诊治，以及抗生素的合理使用。控制医院感染的重要途径，要从传染源、传播途径和易感人群三个方面进行，才能有效的控制感染的发生率。在医院里，不管是患者，还是医生、护士，甚至是医院的环境都可能是感染源，因此，医院要做好每天的消毒工作，不可忽视。医护人员也要注意个人卫生，经常洗手消毒，医疗器械等用品也要进行灭菌消毒，减少感染媒介。医院里聚集了多种病原体，病原体适合存活于潮湿的环境下，因此，要对医院的环境进行控制，保持空气畅通，降低医院感染发生率。另外，医院里的患者，身体都比较弱，容易感染，多为易感人群，因此，一定要在进行病房环境保持的同时，加强患者的病原菌的耐药性监测，以及环境细菌的监测。

本研究中，观察组采用微生物检测结果显示，不管是患者感染程度还是感染率都低于比对组，两组比较，P<0.05，具有统计学意义。可见，微生物检测在医院感染控制方面有明显的效果，能够对病原菌和易感人群进行有效的监测，同时，对传播途径也起到很好的预测作用。通过本研究，充分显示了微生物检验技术在感染控制中的应用作用，有着不可代替的位置，是进一步治疗的理论依据，有效降低了医院感染的发生率，具有显著的临床价值，值得在临床中广泛应用和推广。

参考文献

[1]武华，陈静，杨秀莲.微生物检验在医院感染控制中的价值分析[J].中国保健营养，2012，22(14)：626-627

[2]王娟，曾芹，林锋，等.2009-2011年医院感染现患率调查与分析[J].中华医院感染学杂志，2012，22(12)：2560-2562

[3]姜波，包志平.临床微生物检验与监测在医院感染中的意义[J].中华医院感染学杂志，2009，19(15)：2047

[4]阔肖冬.加强临床微生物检验有效控制医院感染IJ].中国医药指南，2012，10(12)：911-912

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关于细菌的论文

大家对我们可能都不陌生了吧，我们叫硝化细菌，可不是帮助你们消化大鱼大肉的那个消化哦。我们兄弟二人（等等，怎么是两个？），别急，一会你们就明白了。哥哥叫硝酸菌，弟弟叫亚硝酸菌，因为我们哥儿俩老是形影不离，长得又酷似双胞胎，人们就把我们统称为硝化细菌了，其实我们兄弟两个差别还不小呢，硝酸菌虽然是哥哥，但干起活来打头阵的还是靠弟弟。

说了半天，大家怎么也不和我们打个招呼呀，伤自尊了，也难怪，我们太小了，大家如果不用显微镜是根本看不见我们的，哎，真是“菌微言轻”啊，好吧，既然看不到我们，那我们兄弟就自我描述一番吧：我们身材都很苗条，人称我们“杆菌”（像电线杆）。在革兰氏染液（一种专门染细菌的染液）里洗过澡后，我们都是红色的。我们大部分的同胞都长着长长的鞭毛，我们可以借助它们像船桨一样在水中自由地游泳。

我们的重要性大家了解吗？不是吹牛，如果没有我们兄弟两个，大家在水族箱里养鱼种草几乎是一件不可能的事，关叔也要失业了哦，真的，不信给大家显摆显摆。

在大家的草缸中，氮元素是普遍存在的，水草、鱼、饲料、藻类甚至鱼类粪便中都有它的踪影，它是构成蛋白质的必要元素。那么，烂掉的水草叶子、死去的鱼儿、没吃完的饲料、凋亡的藻类和鱼儿的粪便中的氮后来去哪里了呢？有人可能说，我从来没有注意过它们，可最后都不见了啊，其实它们是被一些称为腐生细菌的家伙分解了，有机的氮变成了无机的氨，就像一条刚死的鱼是没有味的，腐败时就会产生刺鼻的臭味，这里边就有氨的味道。

氨对于鱼类是剧毒的，它能使鱼类血液中的蛋白质变性而失去生理功能，导致鱼类的死亡。当水体中氨浓度超过0.2ppm时就会造成鱼类急性死亡。

氨有如此剧毒，那为何大家的鱼都还好好的呢？哈哈，就是因为有我们硝化细菌呀。弟弟亚硝酸菌负责把氨氧化成亚硝酸盐，再由哥哥把亚硝酸盐氧化成硝酸盐。亚硝酸盐也是有毒的，但比起氨来说是小得多了，而硝酸盐是无毒的，它是水草等水生植物很好的氮肥。大家种水草时并不添加氮肥，液肥、基肥、根肥的说明书讲得明明白白：不含氮、磷，那为什么大家的水草还养得那么好啊？还不是有我们兄弟呗。

有人认为鱼的排泄物可以当作水草氮肥，可水草根本无法直接利用鱼类排泄物。这些排泄物必须在那些腐生细菌的“帮助”下（可不是我们兄弟哦，这种事可不能争功）变成一些小分子无机物如氨、硫化氢等（净是剧毒物，这帮小子）。我们得给它们收拾残局，把氨转化成水草可以直接利用的硝酸盐，这才把大家的草养得肥肥壮壮的，鱼儿也避免了氨毒之苦。

下面着重介绍下我们的生活特点：

1、我们属于自给自足性的自食其力的细菌，科学家叫我们自营性细菌，我们用最简单的无机物如二氧化碳为碳源来构成我们的身体，而建造我们自己的能量源泉就是我们氧化氨和亚硝酸盐过程中所释放出来的能量。可见我们的工作也不光为了大家，更重要的是为我们自己，那句话怎么说来着“菌不为己，天------”不说了，有点太不厚道了。我们这种生存方式，大家看是不是和水草很相似啊，只不过水草是利用光能来养活自己，我们是利用化学能而已，而另一些家伙比我们聪明得多，它们被称为异营性细菌（就是那些专门制造毒物的家伙），它们用有机物做碳源来构建它们的身体。

2、我们除了像水草一样进行糖类合成反应外（把二氧化碳和水在化学能的作用下合成葡萄糖），也需要其他的营养元素，如铁、锰、磷、钾等，用以代谢合成我们生长所需的一些蛋白质和脂肪等物质，所以大家给水草施的肥料和二氧化碳，我们也笑纳了些，抱歉没打招呼哦。

3、要说我们最不喜欢呆的地方，那就是一个充满了有机废物（如鱼便便）的环境，因为过多的有机物让我们无法忍受，我们又不能把它们当作食物，过多的有机物将会抑制我们的生长和繁殖，但是哥哥硝酸菌对有机物并不那么敏感，有时甚至还能“吃”些水溶性有机物（啊，变节啊），但大多时候我们配合还是非常默契的，兄弟就是兄弟嘛。因为我们有这一特性，所以大家就别指望我们在有一大堆鱼便便的肮脏的过滤棉上安家了，最适宜我们居住的地方是比如生化球、生化环、生化棉这样的，当然在水流流过我们家之前最好把水里的鱼便便、烂叶子提前过滤掉，不然的话，这些东东堵在我们家里，我们可就惨啦，拜托了啊。

4、前边说过了，我们很多兄弟都是游泳健将，我们可以在水中做主动的迁移，虽然这很耗费体能，但如果我们居住的家园受到外来干扰、没有食物吃、有外族入侵、生活环境突然变化时，我们还是会做主动的战略转移的，在转移的途中，我们可是不会吃任何东西的，所以一旦我们背井离乡，请赶快给我们找一个家吧，让我们固定下来好为大家更好地服务。不用担心我们无法在固体表面固定的问题，我们兄弟可是这方面的高手，我们在水中到处游荡时，如果发现有什么固体物质，就会立即分泌一种粘性物质，牢牢地把自己粘到那上边，这样一层层地粘上去，直到形成一个膜，大家都管我们形成的这个膜叫“生物膜”，水质的净化就要靠它了。

5、再透漏些比较隐私的问题，就是我们的繁殖了。我们的繁殖速度说起来真有些不好意思，我们是微生物世界的“大象”，繁殖周期非常长，和那些异营性的腐生菌比较一下大家就明白了。在20个小时内，1个异营性细菌可以分裂成1000000000个，但我们还停留在1个的状态，这也没有什么奇怪的，我们维持生命和繁殖的物质都是靠自己制造的，要耗费大量能量和时间，而那些异营性细菌则可以利用很多现成的东西。讲到这里就不能不说一种发生在开缸后不久容易发生的问题，我们暂且叫它开缸综合征。有些人在开缸后的一个月内鱼儿会不明不白的死去，这主要是因为鱼类的排泄物被那些异营性细菌分解为氨等有毒物质，它们繁殖得实在太快了，相信大家都了解夏天饭菜变质的速度，越来越多的氨在产生，直到超出了鱼、虾能够忍受的极限，它们就……，好痛心啊，那大家问，你们干什么去了？真白养活你们了！各位老大先别急，这事不怪我们，在刚开缸的一个月内，因为我们生得实在太慢了，根本没办法处理那么多的氨，寡不敌众啊。所以提醒各位在开缸后的一个月内勤换换水、少喂喂鱼、用点细菌制剂吧。

6、大家可能认为我们兄弟也太逊了，生得又慢、长得又慢，怎么还没有被淘汰掉呢？达尔文的理论看来问题是不小啊。先等等，我们兄弟虽然有弱点，但也有其他细菌不具备的优势呢！最主要一点就是我们在食物短缺等恶劣环境下可以像冬天的狗熊一样“休眠”，避免了像其他细菌一样被饿死的命运，我们的休眠期最长可以达到2年之久。利用这个原理，有人把我们制成了菌液出售，可以长期保存，其实那里边就是“休眠”的我们。

7、我们还对氧有一种由衷的偏爱，在缺乏氧气的环境里我们根本就无法高效率地处理氨和亚硝酸盐，以至造成我们的生存危机。所以大家如果想让草缸的水质真正良好的话，就让水草制造更多的氧气给我们吧，大家会得到回报的。

8、可能还有人不知道，我们对光线有多么厌恶。弟弟亚硝酸菌对近紫外线的可见光非常敏感，所以不要把飞利普865照到我们身上哦，紫外线对我们的杀伤力更是巨大的。所以让我们在黑暗中工作吧，我们会感谢大家的。

9、在酸碱度方面我们也提点小小要求：我们在弱碱性的环境里生活得更舒服些，如果是草缸，最好也别把PH值调整到6以下，对我们的健康很不利的呀。另外，最适合我们的温度是25度哦。

10、有些毒物也对我们的健康不利，如一些治疗鱼病的鱼药、硫酸铜或螯合铜等，所以在治疗鱼病的时候一定要注意，如果我们都死光光了，你的缸即使不是新开的，也有可能发生开缸综合征的。

最后澄清一个问题，那就是在水族箱中即使添加我们也无助于改善水的浑浊问题，因为我们是被大家用来对付氨和亚硝酸盐而不是水中悬浮的细小颗粒、细菌乃至藻类的。但有一点可以肯定，那就是我们会使你的水族箱中的水变得更优质、更适合生物之生长。

食品快速检测技术论文

食品快速检验检测技术以其简捷性和便携性两大优势得到了快速发展。 下面是我为大家整理的食品快速检测技术论文，希望你们喜欢。

食品的快速检验检测技术

摘要：食品安全已成为社会关注的焦点问题。文章介绍了目前常用的食品安全快检技术，并展望了其发展方向。

关键词：食品安全 快检 技术综述

引言

食品安全(food safety)是指食品无毒、无害，符合应当有的营养要求，对人体健康不造成任何急性、亚急性或者慢性危害。俗话说“民以食为天”，食品安全关系到人民群众的身体健康和生命安全，关系到社会和谐稳定，而近年来食品安全问题层出不穷，加了吊白块的面粉，有毒的大米，注了水的鸡肉，掺了石蜡的火锅底料，硫酸泡过的荔枝，以及假酒假烟假蜂蜜劣质奶粉充斥着市场，真让老百姓担心起这片“天”。因此，对食品的生产、加工和销售环节实施监测监控势在必行，食品安全分析检测技术应运而生。

传统的食品安全分析检测技术主要是指化学分析法和大型仪器检测法，相对成熟。但它们的操作只能局限于实验室，操作复杂，耗时长，不能满足对食品质量安全实时监督掌控的需求，尤其在突发事件时，快速检验检测技术以其简捷性和便携性两大优势得到了快速发展。

1、食品快速检验检测技术的研究现状

1.1 化学速测技术

化学速测技术主要是根据待测成分的某些化学性质，将样品与特定试剂发生水解、氧化、磺酸化或络合等化学反应，通过与标准品的颜色比较或特定波长下的吸光度比较，以获得检测结果，通常也成为化学比色分析法。

利用普通化学原理的速测法主要包括检测试剂和试纸，随着检测仪器的不断发展，国内外均已有与测试剂相配套的微型光电比色计。针对试纸检测的仪器也有报道，如硝酸盐试纸条[1]，主要是将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在弱酸性条件下与对氨基苯磺酸重氮化后，和N-1-盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，试纸变色，插入检测仪读数即可。德国默克公司生产的与试纸联用的光反射仪技术相对成熟，国内尚无商品化仪器问世。

利用生物化学原理的速测法主要应用于微生物的检测，商品化成品以美国3M公司的PerrifilmTM Plate系列微生物测试片为代表，在检测金黄色葡萄球菌时，只需要测试片与确认片配套使用即可。测试片有上下两层薄膜组成，下层的聚乙烯薄膜上印有网格，便于计数，同时覆盖着含有特异性显色物质和抗生素的培养基，若样品中含有金黄色葡萄球菌，无须增菌，直接接种纸片培养24h后便可观察到显示出特殊颜色的菌落;确认片与测试片相似，只是含有不同的特异性显色物质，将有疑似菌落的测试片影印到确认片后，培养1-3h即可观察，不需进行繁琐的生理生化鉴定。而常规的Baird-Parker平板计数法耗时长达78h。

1.2 酶抑制速测技术

酶抑制速测技术主要用于食品中农药残留和重金属的快速检测。这些物质可通过键合作用造成酶的化学性质和结构的改变，产生的酶-底物结合体会发生颜色、吸光度或者pH值的变化，通过测定这些变化以达到定性或定量检测的目的。根据检测方式的不同，可分为试纸法、pH计法和光度法。相比而言，试纸法成本低、操作简单，更易于推广。它主要是将酶和底物分别固定在两张试纸片上，当样品中有待测组分时，会对酶产生抑制作用，两张试纸片接触后，酶和底物结合便会发生显著地颜色变化，比较适合农贸市场和超市等一些食品集散地的实时安全监管。由于该方法的检出限和保存性等方面的局限，只适用于初筛检测[2]。

1.3 生物传感器速测技术

生物传感器技术是利用生物感应元件的专一性，按照一定的规律将被测量转换成可用信号，使这种信号强度与待测物浓度形成一定的比例关系，具有快速、灵敏、高效的特点，是目前食品安全检测技术的研究热点，广泛应用于食品中农药残留、兽药残留等方面的检测，与传统的离线分析技术相比，它更适应于在复杂的体系内进行快速在线连续监测，在现场快速检测领域有着不可逾越的优势，按照传感器类型又可分为免疫传感器、酶传感器、细胞传感器、组织传感器、微生物传感器等等。

免疫传感器是在抗原抗体结合免疫反应的基础上发展起来的生物传感器。利用压电免疫传感器检测食品中常见肠道细菌时，通过葡萄球菌蛋白A将肠道菌共同抗原的单克隆抗体宝贝在10MHz的石英晶体表面，以大肠菌群为例，响应值可达10-6-10-9。

1.4 免疫速测技术

免疫速测是利用抗原抗体的专一、特异性反应建立起来的方法，根据选用的标记物可分为放射免疫检测、酶免疫检测、荧光免疫检测、发光免疫检测、胶体金免疫检测等。酶联免疫吸附检测法是应用较为广泛的一种免疫速测技术。它将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/抗原即酶结合物，抗原抗体反应信号放大后，作用于能呈现出颜色的底物上，可通过仪器或肉眼进行辨别。目前，黄曲霉毒素酶联免疫试剂盒已广泛应用于食品检测中。

1.5 分子生物学速测技术

聚合酶链式反应(PCR)是近年来分子生物学领域中迅速发展并运用的一种技术，在食品检测中主要用于微生物的检测。它利用是否能从待测样品所提取的DNA序列中扩增出与目标菌种同源性的核酸序列来判定是否为阳性，该方法从富集菌体、提取遗传物质、PCR扩增到电泳、测序鉴定，可控制在24h，而致病菌的传统培养检测至少需要4-5天。

随着研究的逐深入，由PCR技术派生出的实时荧光PCR法、DNA指纹图谱法、免疫捕获PCR法、基因芯片法等也逐步得到了应用。基因芯片技术可以在很小的面积内预置千万个核酸分子的微阵列，利用细菌的共有基因作为靶基因，选用通用引物进行扩增，利用特异性探针检测这些共有基因的独特性碱基，从而区分出不同的细菌微生物。该法特异性强、敏感性高，可实现微生物检测的高通量和并行性检测。

2、食品快速检验检测技术的发展方向

食品安全快检法以其简捷性和便携性两大优势得到了快速发展，但缺点也显而易见，需要完善的地方依然很多：

2.1 简单 速检验检测技术往往是由一些非专业技术人员使用，因此，检测方法采样、处理、检测、分析等各个环节简单、易行是该方法的一大发展趋势。

2.2 准确 检法前处理简单，势必导致待测样品纯度不高，基体干扰大。因此，在今后方法的研究中，应更多关注与如何避免假阳性结果，尤其是在分子生物学速测法中，增强靶基因的特异性、引物的特异性、排除死菌体造成的假阳性应得到进一步探索。

2.3 便携 着微电子技术、智能制造技术、芯片技术的发展，检测仪器应向微型化、集约化、便携化方向发展，以满足更多的现场、实时、动态的检测要求。

2.4 经济 测成本的高低直接决定着检测技术能否得到广泛的推广和应用，如何在确保又好又快的检测基础上，尽最大可能的降低成本也是今后的研究方向。

2.5 标准化前，我国尚未制定出与食品安全快速检测技术相关的标准和规范，这也阻碍了快检法的推广和应用。随着技术的提高和检测中对快检法的需要，应及时制定出相关标准规范以增强快检结果的认可性和权威性。

参考文献

[1]房彦军，周焕英，杨伟群。试纸-光电检测仪快速测定食品中亚硝酸盐的研究【J】解放军预防医学杂志，2004，22(17)：18-21

[2]易良键。食品安全快速检测方法的应用和研究【J】中国信息科技，2012，3：46

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求一篇实验论文

你的思路不是很明确了？还要怎么样？

我想写一篇关于大肠杆菌的论文，字数1500左右，应该从那些方面入手去写

　　0引言

　　脆性X综合征（fragile X syndrome, FXS）是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的FXS是由脆性X智障基因1（fragile X mental retardation, FMR1）中5′端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及其CpG岛异常甲基化导致. FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏导致FXS的发生［1-2］. 本实验对编码基因存在于3号染色体［3］，能与FMR1 基因5′ d (CGG)n3′重复序列特异性结合的蛋白CGGBP1进行原核表达，并对其DNA结合活性进行研究.

　　1材料和方法
　　1.1材料

　　大肠杆菌DH5α, BL21（ DE3）和表达载体pRSET A均为本实验室保存. 质粒提取试剂盒购自Sigma公司； 限制性内切酶BamH I和KpnI购自宝生物工程公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司； Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自Dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司.

　　1.2方法

　　1.2.1表达载体的构建

　　根据CGGBP1基因起始密码子和终止子邻近序列设计PCR引物：CGGBP1F CGC GGA TCC GAG CGA TTG TAG TAA CAG CA，CGGBP1R GGG GTA CCT CAA CAA TCT TGT GAG TTG AG. 其上游及下游引物分别加入BamHI和KpnI酶切识别位点序列(引物序列下划线部分). PCR反应以人淋巴细胞cDNA文库为模板，扩增编码CGGBP1的基因序列. 设计PCR扩增体系25 μL，灭菌去离子水10 μL，10×反应缓冲液2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，DMSO 2.5 μL，4× dNTP混合物（每种2.5 mmol/L）2 μL，CGGBP1F和CGGBP1R各10 pmol，模板3.5 μL（50 ng/μL）， Taq DNA（5 μ/μL）聚合酶0.5 μL. 扩增条件：95℃预变性5 min，再94℃ 30 s， 53℃ 1 min，72℃ 1 min循环40次，最后72℃终末延伸产物10 min. PCR产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因. 用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSET A，酶切产物电泳后回收，在T4连接酶作用下，目的片段定向克隆至pRSET A的BamHI和KpnI克隆位点. 将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，接种到含氨苄青霉素的LB培养基平板并挑取单菌落.

　　1.2.2融合蛋白的诱导表达

　　将测序正确的重组质粒转入BL21（ DE3）. 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中， 37℃振荡培养12 h， 按10 mL/L比例转接于新鲜培养基，37℃振荡培养至对数生长期时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，32℃诱导振荡培养4 h，离心收集菌体，SDSPAGE分析重组蛋白的表达.

　　1.2.3蛋白表达形式的分析

　　取5 mL菌液离心，用500 μL的裂解液（10 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠 pH 8.0）重悬，加溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，冰浴30 min，超声波裂菌，离心后分别将上清和沉淀进行SDSPAGE分析.

　　1.2.4融合蛋白的纯化

　　将1 mL 500 mL/L Ni2+NTA悬液和4 mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min，直接过柱. 过柱结束后，用4 mL漂洗液（20 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 8.0），洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白. 经过2次漂洗后再用0.5 mL洗脱液(250 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 8.0) 3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集. 取收集液，进行SDSPAGE分析.

　　1.2.5CGGBP1与（CGG）29重复序列双链DNA结合

　　实验取10 μL磁珠用1 mL的无RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂. 1×生物素亲和素结合缓冲液（10 mmol/L TrisHCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 g/L Tween 20）15 μL重悬磁珠，各5 μL分3组实验. 其中一组加入25 μL（100 ng/μL）生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA，另外两组分别加入25 μL（100 ng/μL）非生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA和25 μL三蒸水做对照；三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μL，25℃轻摇1 h. 经磁力吸附后，弃上清. 重复上述步骤3次；加入纯化后CGGBP1（500 μg/mL）15 μL 和2×核酸蛋白结合缓冲液（20 mmol/L HEPES，100 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L DTT，100 g/L甘油）20 μL，室温下静置30 min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10 μL，沸水煮10 min，进行SDSPAGE分析.

　　2结果

　　2.1原核表达载体的构建及鉴定

　　扩增产物在15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条约504 bp的条带（图1）； 重组质粒pRSET A/CGGBP1及质粒pRSET A分别用BamHI和KpnI酶切，pRSET A/CGGBP1分为两个片段，分别为2.9 ku和504 bp（图2），均与预计结果相同.

　　2.2CGGBP1的表达

　　用BamHI和KpnI双酶切pRSET A/CGGBP1表达质粒，筛选阳性重组质粒. 携带有pRSET A/CGGBP1质粒的 BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导后，在Mr 约25 000处出现1条表达条带；而未经IPTG诱导的菌体则无此条带. 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解，离心后分为上清和沉淀两部分. 经SDSPAGE分析表明，CGGBP1部分存在于细菌裂解液的上清中，为可溶性蛋白，上清液中的目标蛋白相对较少（图3）.

　　2.3CGGBP1蛋白纯化

　　在表达质粒pRSET A多克隆酶切位点的上游， 插入有连续6个组氨酸的序列 —(His )6 tag. 重组质粒经诱导表达后，(His )6 tag可以和外源插入片段共同表达. 利用(His )6 tag 和金属Ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方法，是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方法. SDSPAGE显示，CGGBP1得到较高程度的纯化（图4）.

　　2.4CGGBP1与5′d（CGG）293′重复序列

　　双链DNA结合实验生物素化的5′d（CGG）29 3′重复序列双链DNA被固定到链酶亲和素磁珠上，非生物素化的5′d（CGG）293′重复序列双链DNA因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉. 同理，加入CGGBP1后，未和5′d (CGG）293′重复序列双链DNA结合的蛋白也被洗脱（图5）.

　　3讨论

　　关于微卫星的产生机制，普遍认为是DNA复制过程中DNA聚合酶的滑动［4］，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失. 已发现微卫星可能是一种非常活跃的碱基序列，通常各种简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域，这个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强. 这些区域在核糖体RNA基因中非常复杂，同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合，成为“染色质折叠密码”［5-6］，参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程. 脆性X综合征是Igarashi等［7］研究报道的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种. 该蛋白只和（CGG）n重复序列发生特异性结合，而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合［8］. 因此，对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义.
　　
　　本实验成功地构建了含CGGBP1的重组质粒，以可溶性蛋白形式获得较高表达. 通过Ni2+NTA柱纯化，获得纯化的目标融合蛋白质，同时证明了该蛋白能和人FMR1基因5′d (CGG)293′重复序列双链DNA特异性结合. 这将为进一步开展真核生物蛋白CGGBP1功能的研究和阐释CGG三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础.