ros检测论文

ros检测论文

活性氧（reactive oxygen species，ROS）指来源于氧的自由基和非自由基，包含了超氧阴离子（O2•-）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（•OH）、臭氧（O3）和单线态氧（1O2）等，由于它们含有不成对的电子，因而具有很高的化学反应活性。

ROS在细胞生命，应激和死亡中具介导作用，并且不同浓度的ROS在其中起着截然不同的作用，从而导致细胞命运的不同。因此，非常有必要对ROS的浓度或相对水平进行可靠的测量。

1、电子顺磁共振技术(EPR)

2、荧光染色法

3、化学发光法

4、色谱方法

5、分光光度法

6、电化学生物传感器

7、基于荧光蛋白的方法

1、电子顺磁共振技术 ( electron paramagnetic resonance , EPR )

EPR是一种检测自由基的波谱学方法,是明确评估生物系统中以氧气为中心的自由基生成的“金标准”。由于O2•-,•OH反应活性高、寿命短EPR信号不易直接检出, EPR与自旋捕获技术( spin tranps )相结合可弥补这一缺陷。首先自旋电子捕获剂与自由基发生反应生成EPR易检的相对稳定的自由基附加生成物,然后用EPR技术进行测定。它是一种功能强大且可靠的技术，可以明确地测量生物样品中的O2•-，•OH和NO。

2、荧光染色法

荧光探针通常对氧化剂敏感，并且在被氧气氧化之前是非荧光性的。使用最广泛的成员是二氢乙啶（DHE），二氯二氢荧光素（DCFH-DA）和Amplex Red（尽管细胞不可渗透）。细胞可渗透的物质有助于反映细胞区室的氧化状态，提供有关刺激下自由基产生的信息。这些探针大多数通过单电子自由基机理被氧化，产生探针自由基中间体并产生荧光产物。DHE能够进入细胞并被细胞内O2•-氧化形成特定的红色荧光2-羟基乙啶（2-OH-E+），或可以被其他氧化剂（•OH, H2O2, or OONO-）氧化生成非特定的红色荧光乙锭（E+），2-OH-E+和E+均可通过基于荧光的技术任意捕获。DCFH-DA通常用于直接测量细胞内的氧化还原状态。它能够进入细胞并被酯酶水解成不可渗透膜的DCFH，它可以在内部扩散并被非特定的氧自由基氧化，从而通过非荧光的中间自由基DCFH生成荧光的DCF。Amplex Red用于检测过氧化氢。

3、化学发光法

化学发光分析通常用于超氧化物的检测。与荧光分析类似，化学发光探针对自由基敏感，易于操作。探针可以与O2•-形成光子，并由光度计吸收计数器捕获，而无需使用激发光光源。反应涉及多个步骤，并且探针自由基中间体在该机制中也起着关键作用，因此发光探针的局限性也与荧光探针类似。常用的化学发光试剂有鲁米诺( luminol )、光泽精( lucigenin )、甲壳动物荧光素(如海萤荧光素)等。

4、色谱方法

色谱法用于羟基自由基及其反应产物的分离和鉴定。•OH与特定的试剂反应，生成可通过色谱分析检测到的稳定化合物，其中通常使用液相色谱及其与质谱的组合。通常用于稳定自由基的试剂是苯甲酸，水杨酸和DMSO。水杨酸与羟基自由基反应生成的2,3-二羟基苯甲酸（2,3-DHBA）和2,5-二羟基苯甲酸（2,5-DHBA）通过HPLC并使用电化学检测器进行定量，证明此方法可用于体内测量羟基自由基。基于HPLC的方法已应用于许多反应系统和组织中的羟基自由基或抗氧化剂活性的检测

5、分光光度法

分光光度法是检测ROS的悠久方法。它们基于自由基和氧化还原物质之间的反应而起作用，并且底物和产物之间在不同波长下的吸光度差异使自由基的半定量化成为可能。最常用的方法有细胞色素C ( cytochrome C )的O2•-还原法和氮篮四唑( nitro blue tetrazolium , NBT )还原法。

6、电化学生物传感器

由金丝电极上的细胞色素c和聚苯胺（磺酸）的交替层形成的电化学生物传感器（如下图）用于超氧化物的定量。

7、基于荧光蛋白的方法

基于荧光蛋白的氧化还原探针是通过荧光蛋白（FPs）和原核氧化还原敏感蛋白的组合而设计的。重组蛋白通过质粒或腺病毒被引入细胞，并靶向亚细胞器，从而报告某些区域的氧化还原状态。重组蛋白的氧化还原依赖性荧光光谱变化是通过在氧化条件下二硫键和部分主链的结构变化实现的。

文献阅读-FERONIA受体激酶通过调控ROS来调控自交不亲和

大家好，本次阅读的文献是近期发表在《current biology》上的《FERONIA receptor kinase-regulated reactive oxygen species mediate self-incompatibility in Brassica rapa》的一文，通讯作者是山东农业大学园艺学院的段巧红教授，近期来该课题组在FER受体激酶在生殖过程中的功能研究取得的一系列卓有成效的结果。

大多数芸苔科植物演化出自交不亲和(self-incompatibility, SI)的机制，以避免近交来产生杂交优势，例如我们熟知的 小肽SP11-受体SRK信号通路来调控自交不亲和，但是柱头是如何拒绝自身的花粉目前还未知。本文以大白菜为模型探究了柱头中的ROS对于SI的影响。

为了确定ROS是否参与大白菜的SI，在SI和CP（相容性花粉）授粉后不同时间点对大白菜柱头进行,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA)染色，可以发现SI时，柱头的ROS会上升，但是CP时，柱头会明显下降。通过与细胞壁的marker PI染色，发现在ROS主要定位在贴近质膜的胞质中。此外，利用其他两种ROS的探针：hydroxyphenyl fluorescein 和 dihydroethidium 也得到了类似的结果。

为了探讨自花授粉后柱头ROS增加的分子机制，他们抑制了SRK的表达来降低SP11-SRK信号通路来检测ROS，由于大白菜遗传转化非常困难，于是他们利用 antisense oligodeoxyribonucleotide(AS-ODN)技术来进行敲低，AS-BrSRK46(V)的施加成功降低SI反应。有趣的是SRK的敲低不仅降低了未授粉的柱头的ROS，而且抑制了自交时ROS的增加。

那么高水平的ROS是否是拒绝自身花粉的原因呢？这里作者采用了ROS 各种ROS的清除剂CuCl2, Tiron, KI, or sodium benzoate, 这些抑制剂均有效的抑制了柱头的ROS,并且以剂量依赖性的方式增加花粉管的穿出。（ 重点：活性氧清除剂在指定浓度下并没有抑制亲和花粉的生长，表明柱头和花粉活力没有受到影响 ）。因此这些结果明确地表明，柱头ROS的增加是排斥自身花粉的必要因素。为了进一步证实该观点，作者进行一个‘‘stigma transfer experiment’’实验，在施加自身花粉0-60min的柱头转入ROS的抑制剂中。花粉管的萌发数随着转移的时间而减少。有趣的是，他们还利用了黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶(X/XO)或是FeSO4 (Fe2+介导的Fenton反应)来在柱头产生ROS，对于相容性花粉也不能正常萌发。因此，ROS的增加对花粉具有非选择性的抑制作用。但是如果采用正常情况下混有两种不同类型的花粉分别授粉柱头一半时，发现相容性花粉仍能萌发，但是自交的不能萌发。因此推测当柱头遇到自交花粉粒和亲和花粉粒的混合时，诱导的ROS增加或减少会使附近的亲和花粉萌发，而自交花粉粒不萌发(如果能完全混合，其中一方有marker标记结果应该会非常有意思)。

植物中ROS主要由NADPH产生，那么这个过程是否有NADPH调控呢？通过施加NADPH的抑制剂diphenyleneiodonium chloride (DPI)，发现合适的浓度可以使得自交花粉管生长，因此ROS的产生应该主要是由NADPH所调控的。大白菜中一共有13个NADPH编码基因，其中BrRbohD1, BrRbohD2, BrRbohF, 和 BrRbohI主要在柱头表达。BrRbohF的敲低能够降低SI，此外BrRbohD1, BrRbohD2, 和 BrRbohl敲低也能降低柱头ROS的表达并且略降低SI，暗示着这些Rboh可能发挥着冗余地功能。为了进一步证明ROS调控SI在十字花科植物的保守性，他们还在萝卜和甘蓝的柱头上进行NADPH抑制剂的处理，发现也能降低ROS。

此外在用ROS降低的材料中，发现花粉管的生长长度明显增加，暗示着ROS的降低可能对于相容性花粉的萌发具有促进作用。在自交相容性的拟南芥的 rbohd 中，在授粉前后柱头均具有更低的ROS累积水平且花粉管萌发加快。因此RBOH酶作为关键酶，在CP时促进花粉萌发，但是SI时抑制。

那么什么调控了RBOH的酶活呢？在先前的研究中发现RBOH受到ROP的激活，通过抑制剂和敲低证明了ROP2调控并且通过互作验证了ROP8与RBOHF存在直接互作。

由于FER在柱头上也有表达，FER是否也参与这个过程呢？在拟南芥中，突变体柱头ROS下降且短时间内花粉生长速度加快（李超 science表型），在大白菜中，敲低FER显著降低NADPH的表达以及ROS在柱头的累积，同样降低了ROS并降低了SI。因此，FER-Rac/Rop GTPase-Rboh信号通路对于SI以及维持未授粉柱头ROS的基本水平是必要的。

一个问题：SI和CP中FER是如何识别的，单独信号还是受到SP11-SRK的调控？

如何检测细胞内的ROS

活性氧检测试剂盒是利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。活性氧检测试剂盒。

荧光法检测线粒体产生和释放的反应性氧化物（ROS）[10]。羟基自由基的检测（二羟苄胺DHBAs和水杨酸盐Salicylate）[11] ROS was evaluated by the staining of 2’，7’- dichlorofluorescein diacetate（二氯荧光乙酰乙酸盐）.ROS production was detected by nitroblue tetrazolium （NBT，硝基四氮唑蓝）assay。

目前，对于细胞线粒体产生的ROS 测定，所发展的方法有（荧光标记后）激光扫描共聚焦显微术（Takahashi et al.，2002）和荧光探剂DCFDA标记后的荧光分光光度法（Esposti ，2002）等，本实验以lucigenin 或luminol 为探剂，用化学发光技术，对从正常大鼠肝细胞及心肌细胞分离的线粒体的METC 电子漏进行了测定

ROS 期刊质量怎么样

从目前机器人应用的角度来说，很多学术界的理论已经远远超出目前应用技术的范畴，通俗的说也就是不实用。如果你要留在高校进行机器人的研究，那么ros作为工具可以帮助你做实验，学会基本的会用就行了；然而如果你想去产业界，那么恐怕更重要的是技术水平，通俗的说也就是写代码的能力，ros会是一个非常好的学习对象

多少搞科研的能发论文却写不出高质量的代码？多少酷炫的demo只是停留在 demo 上却几乎不可能转化成产品？国内情况尤甚，搞个大新闻，报个ZF的科研奖励，然后……就没有然后了

所以在国内，更建议对机器人感兴趣的同学扎实自己的基础理论以后，好好磨练自己的技术水平，写的一手好代码以后才能，实业兴国！为什么高校平均工资低？因为从整个群体来说，攻城狮才是对社会更有贡献的人。