药物的晶型对制剂的稳定性、溶出度及生物利用度等有着重大的影响，是影响药品质量的重要因素之一，仅定性分析原料药或制剂中的晶型不可以满足药品的质量控制要求，为了测定原料药或制剂中有效晶型的含量（特别是容易发生转晶变化的晶型），从而更为精准的控制药品的质量，对于晶型药品质量控制应优先选择定量分析方法。 对于企业而言，药物晶型定量研究除了对药品质量控制有重大意义外，在知识产权方面，药物晶型专利也是重点关注的内容，如药物具有与原晶型生物等效甚至药效更好的新晶型，可以作为附加专利，延长药物的专利保护期，晶型定量研究也是作为支撑晶型专利保护的重要依据。 当前晶型定量应用广泛的研究方法有X射线衍射法(XRD)、拉曼光谱法(Raman)、动态水吸附法(DVS)以及差示扫描量热法(DSC)、红外光谱法(IR)等。 本文主要就这几类分析方法进行汇总介绍。 1 X-射线衍射法（X-ray diffraction） X-射线衍射是研究药物晶型的主要手段，该方法可用于区别晶态和非晶态，鉴别晶体的品种，区别混合物和化合物，测定药物晶型结构，测定晶胞参数（如原子间的距离、环平面的距离、双面夹角等），还可用于不同晶型的比较。X-射线衍射法又分为粉末衍射和单晶衍射两种，前者主要用于结晶物质的鉴别及纯度检查，后者主要用于分子量和晶体结构的测定。 ①X射线粉末衍射法 XPRD是一种发展比较早的药物晶型分析方法，已广泛应用于不同晶型混合物的定量分析和结晶度的确定。利用该方法所测得的每一种晶体的衍射线强度和分布都有着特殊的规律，以此可得出晶型变化、结晶度、晶构状态、是否有混晶等信息。在应用该方法时，应注意粉末的细度，在制备样品时需特别注意研磨过筛时是否发生转晶变化。研究方法主要有单峰法、多峰法和全谱法。 ②单晶X射线衍射法 SXRD分析对象为单晶，原理是利用X射线对晶体产生的衍射效应，其分析数据代表了某种晶型纯品的结果，SXRD法可以揭示供试品晶型成因，给出晶型物质的晶体学各种定量数据。采用SXRD分析数据，通过理论计算获得100%晶型纯品的PXRD图谱和数据，作为晶型物质标准图谱。 为了减少制剂受辅料稀释、操作或仪器的偏差及样品制备时无机物等因素的影响，制剂中晶型的定量研究通常采用与其他方法联合，最典型的是Varasteh等的研究，作者利用XPRD与傅里叶变换红外光谱及拉曼光谱法相结合，成功地定量了由ALZA公司开发的OROS片剂中REJ-333369B晶型的含量。2 拉曼光谱法(RM) 与红外光谱类似，拉曼光谱是一种振动光谱技术。所不同的是，前者与分子振动时偶极矩变化相关，而拉曼效应则是分子极化率改变的结果。 由于化合物的官能团或化学键的拉曼位移与它们在红外光谱中的吸收波数相一致，所以拉曼谱图的解析也与红外吸收光谱相似。然而，通常在拉曼光谱中出现的强谱带在红外光谱中却成为弱谱带甚至不出现，反之亦然。所以，这两种光谱技术常互为补充。 拉曼谱峰清晰尖锐，定量速度比较快，特别是对于含水性浆状物（如混悬剂等）的多晶型分析，可以直接测定药物制剂中的多晶型。 拉曼光谱的优点在于它的快速、准确，测量时通常不破坏样品，样品制备简单甚至不需样品制备。谱带信号通常处在可见或近红外光范围，可以有效地和光纤联用；这也意味着谱带信号可以从包封在任何对激光透明的介质（如玻璃、石英或塑料）中或将样品溶于水中获得。现代拉曼光谱仪使用简单，分析速度快（几秒到几分钟），性能可靠。因此，拉曼光谱与其他分析技术联用比其他光谱联用技术从某种意义上说更加简便（可以使用单变量和多变量方法以及校准）。图：L-谷氨酸水溶液、α晶型悬浊液和β晶型悬浊液的拉曼谱图 图源：墨玉欣. 拉曼光谱在L-谷氨酸多晶型定量分析中的应用研究[J]. 化学工程师, 2013(08):31-33. 3 动态水吸附(DVS) 动态水吸附（DVS）是一种比重法测试技术，它测试一种溶剂能被某种样品以多快的速度吸收多少的量，如一种干燥的粉末如何吸水。它通过改变样品周围的蒸汽浓度，然后测试因之而改变的样品质量得到实验结果。在湿度逐渐升高诱导的无定形到晶型的转变过程中，一般都会有一个质量瞬失的过程。 通过检测样品重量变化随相对湿度、时间的变化曲线，可以研究样品的水分吸附平衡、吸附解吸附、扩散系数、渗透系数等物化现场。在药物晶型研究中适用于定量少量无定形杂质，用于特殊剂型。 4 差示扫描量热法(DSC) 因为晶体在晶型转变或熔融时会产生热效应，因此利用不同晶型在不同温度区域的熔融热焓或晶型转变焓的大小，通过标准曲线法可以定量分析样品中各晶型的相对含量。差示扫描量热仪灵敏度高，定量研究方便，所以使用差示扫描量热法可以方便准确的对熔点相差较大的混合物中的不同晶型组分含量进行定量分析。 由于DSC法对样品的破坏性是无法避免，因此不适合对样品量少及贵重的样品进行分析检测，同时供试样品的颗粒大小、重量、升温速率、样品取样和混合的不均一性等都会对最终的实验结果产生影响。故在研究药物晶型制剂定量时，需考虑与其它分析技术联用。 图：A晶型不同含量的混合物DSC曲线 图源：袁钻如, 张爱明, 方江邻. 差示扫描量热法(DSC)定量测试阿德福韦酯晶型的研究[J]. 分析测试技术与仪器, 2008(02): 红外光谱(IR) 近年来，近红外光谱法的应用日益广泛，特别是在大量样品的快速鉴别和水分测定方面。近红外光谱特别适合测定羟基和氨基，例如乙醇中的水分，氨基存在时的羟基，碳氢化合物中的乙醇，以及叔胺存在时的伯胺和仲胺等。 某些化合物在固态时会表现出多晶型，多晶型会导致红外光谱的差异。通常，结构中微小的差别会使红外光谱有很明显的差别。在红外光谱中呈现大量的吸收峰，有时不需进行预先分离，也可以定量测定成分已知的混合物中的某个特定成分。 采用固体制样技术时，最常碰到的问题是多晶现象，固体样品的晶型不同，其红外光谱往往也会产生差异。待测成分的晶型有变化，辅料也存在干扰，此种情况一般不宜采用红外光谱鉴别。对于部分晶型不同而红外图谱相同或差异不大的药物，红外光谱就难以区分，如苯乙阿托品的晶型Ⅰ和晶型Ⅱ的红外光谱一致时，或样品纯度不够，都会造成红外光谱难以区分。结语 除了上述晶型研究定量方法外，晶型研究中还会用到中红外光谱法、近红外光谱法、固态核磁共振法、太赫兹光谱法等，一般对于晶型研究可联合几种方法共同定量，以弥补各自的不足。药物多晶型的定量也是药物研发的一个不可或缺的环节之一。参考文献： [1]马乐伟, 杜葳, 赵春顺. 药物晶型定量分析方法的研究进展[J]. 药学学报, 2011(08):896-903. [2]王小叶, 郑斌, 冯志海. X射线衍射全谱拟合定量分析方法研究[J]. 宇航材料工艺, 2012, 42(2):108-110 [3]《中国药典》2020版 [4]黄旭鸥, 陈名浩. X射线衍射定量相分析新方法--多峰定量法[J]. 钢铁研究学报, 1995, 007(005):61-67. [5]张新, 张启明, 李慧义,等. 动态水分吸附分析法及其在药物研究中的应用[J]. 药物分析杂志, 2008(10):197-200. [6]袁钻如, 张爱明, 方江邻. 差示扫描量热法(DSC)定量测试阿德福韦酯晶型的研究[J]. 分析测试技术与仪器, 2008(02):105-108. [7]张晓楠, 郭士岭, 陈宜俍,等. 差示扫描量热法在药物多晶型定量分析中的应用[J]. 中国医药指南, 2012, 000(032):435-436. [8]郭永辉, 吕扬, 北京协和医学院，中国医学科学院，药物研究所，北京，. 差示扫描量热法在晶型药物研究中的应用[J]. 第二届中国晶型药物研发技术研讨会, 2012. END 深圳市新阳唯康科技有限公司是一家专注于晶型筛选、剂型创新，以及一致性评价中“原研药无损性逆向分析”的新型企业。新阳唯康创立于中国制药业高速改革发展的 2015 年，拥有 1,100 平米的标准化实验室，作为一家中欧联合公司，我们竭力为制药公司提供量身定制的技术服务。我们的愿景是为中国市场带来高端、优质的药品，同时为全球的制药行业提供高品质的固态技术服务。
随着中国医改的不断深入，中国医药领域正在迅速与国际接轨，中国医药企业的转型升级是大势所趋，创新药和优质的仿制药是未来医药企业的不二选择。当前， 如何研发出高质量的仿制药已成为业界关注的热点 ，药品生产企业须以参比制剂为对照，全面深入地开展比对研究。包括处方、晶型、原辅料粒径和工艺等主要指标的对比研究，以及固体制剂溶出曲线的比较研究，本期文章我们来聊聊其中的 药物晶型研究 。 80年代起，国内出现了大量的仿制药，在化学结构和纯度、制剂形式等方面达到了与原研药一致的情况，但疗效仍有差异。（如格列奈临床使用的晶型为H晶型，阿折地平α晶型的生物利用度高于β晶型，供临床使用的为α晶型）。 药物晶型研究的国内外相关规定： · 1985版药典开始涉及晶型研究的问题。 · 2005版药典，仍然只有2种药物需要进行晶型检查：甲苯咪唑和棕榈氯霉素。 · 2007年7月FDA发布《仿制药晶型研究的技术指导原则》。 · 2015版药典中新增《药品晶型研究及晶型质量控制指导原则》。 固体化学药物的物质状态，通常可由一组参数来表达：晶胞参数，分子对称性，分子排列规律，分子作用力，分子构象、结晶水和结晶溶剂等。其中一种或多种参数发生变化而使其存在两种或者两种以上不同的固体物质状态时即为多晶型现象。 当固体药品存在多晶型现象，且不同晶型状态对药品的有效性、安全性或者质量产生影响时，则需对制剂中的药用晶型物质进行定性或定量控制。 药品的药用晶型应为优势晶型：优势晶型可以是一种或者多种 ，故可选择一种晶型作为药用晶型物质，亦可选择一定比例将多种晶型物质的混合状态作为药物晶型。 药物晶型的定性当前已有多种方法，其中较为成熟的方法主要有XRD、DSC、TGA等，今天我们主要讨论的是XRPD测试(X射线粉末衍射仪)。 原理： XRD谱图中衍射峰的强度与样品中相应组分晶型含量具有数学关系。 建立了特征峰强度与被测药物中各晶型组分的对应关系。同一药物混晶分析的情况下，特定衍射峰的强度与某一晶型的浓度成正比，衍射强度对浓度回归可以得到线性回归曲线。 该方法需要提供不同浓度比例的不同晶型药物的标样。 是最常用的晶型定量方法。 建立全谱峰强度与被测药物中各晶型组分的对应关系。 以化学计量学为基础，通过分析布拉格衍射和弥漫散射来定量样品晶型。其信噪比、灵敏度和专属性均比单峰法有明显提高。 该方法不需要提供不同晶型药物的标样，但对样品信息的要求较高，且要求特定相的峰形和峰位置恒定。 测定准确但方法也相对复杂。 该案例运用特定的分析软件，通过拟合可以判断出来晶型一和晶型二的含量。 微谱医药新进的布鲁克X射线衍射仪---D8 ADVANCE型就搭载了晶型定量分析的软件TOPAS（Total Pattern Solution），可对晶型进行定量分析。同时其拥有透射样品台和毛细管样品台，适宜对粉末样品、块体样品进行定性定量分析。可进行反射和透射两种模式的测定，并能达到很高的测试灵敏度和分辨率。 还配备了自动进样系统，可排样测试9~90个样品，进行自动化测试。 API晶型研究是参比制剂研究中不可或缺的一环，微谱医药凭借多年的逆向分析以及制剂研究经验，加上不断扩充的仪器设备资源，可帮助客户缩短研究周期，提升研究质量，完善申报资料。 生命健康是人类永恒的关注点，微谱医药愿与广大医药工作者一起，运用智慧与科技，为人类生命健康保驾护航。
物质在结晶时由于受各种因素影响，使分子内或分子间键合方式发生改变，致使分子或原子在晶格空间排列不同，形成不同的晶体结构。同一物质具有两种或两种以上的空间排列和晶胞参数，形成多种晶型的现象称为多晶现象(polymorphism)。虽然在一定的温度和压力下，只有一种晶型在热力学上是稳定的，但由于从亚稳态转变为稳态的过程通常非常缓慢，因此许多结晶药物都存在多晶现象。固体多晶型包括构象型多晶型、构型型多晶型、色多晶型和假多晶型。同一药物的不同晶型在外观、溶解度、熔点、溶出度、生物有效性等方面可能会有显著不同，从而影响了药物的稳定性、生物利用度及疗效,该种现象在口服固体制剂方面表现得尤为明显。药物多晶型现象是影响药品质量与临床疗效的重要因素之一，因此对存在多晶型的药物 进行研发以及审评时，应对其晶型分析予以特别的关注。目前鉴别晶型主要是针对不同的晶型具有不同的理化特性及光谱学特征来进行的，现将几种常用且特征性强、区分度高的方法介绍如下，以供参考。
方法名称：氟康唑测定—电位滴定法应用范围：该方法采用滴定法测定氟康唑的含量。该方法适用于氟康唑。方法原理：供试品置锥形瓶中，加冰醋酸溶解后，照电位滴定法，用高氯酸滴定液（）滴定。读出高氯酸滴定液使用量，计算氟康唑的含量。试剂：1. 水（新沸放置至室温）2.高氯酸滴定液（）3. 结晶紫指示液4. 无水冰醋酸5. 基准邻苯二甲酸氢钾仪器设备：试样制备：1.高氯酸滴定液（）配制：取无水冰醋酸（按含水量计算，每1g水加醋酐)750mL，加入高氯酸（70%-72%），摇匀，在室温下缓缓滴加醋酐23mL，边加边摇，加完后再振摇均匀，放冷，加无水冰醋酸适量使成1000mL，摇匀，放置24小时。若所测供试品易乙酰化，则须用水份测定法测定本页的含水量，再用水和醋酐调节至本液的含水量为。标定：取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约，精密称定，加无水冰醋酸20mL使溶解，加结晶紫指示液1滴，用本液缓缓滴定至蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液（）相当于的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度，即可。贮藏：置棕色玻璃瓶中，密闭保存。2. 结晶紫指示液取结晶紫，加冰醋酸100mL使溶解，即得。操作步骤：精密称取供试品约，置锥形瓶中，加冰醋酸50mL溶解后，照电位滴定法，用高氯酸滴定液（）滴定，并将滴定结果用空白试验校正。记录消耗高氯酸滴定液的体积数（mL），每1mL高氯酸滴定液（）相当于的C13H12F2N6O。注：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一，“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。参考文献：中华人民共和国药典，国家药典委员会编，化学工业出版社，2005年版，二部，。
口服吸收良好，且不受食物、抗酸药、H2受体阻滞药的影响。空腹口服该品约可吸收给药量的90%。单次口服该品100mg，平均血药峰浓度（Cmax）为～8mg/L。表观分布容积（Vd）接近于体内水分总量。该品血浆蛋白结合率低（11%～12%），在体内广泛分布于皮肤、水疱液、腹腔液、痰液等组织体液中，尿液及皮肤中药物浓度约为血药浓度的10倍；水疱皮肤中约为2倍；唾液、痰、水疱液、指甲中与血药浓度接近；脑膜炎症时，脑脊液中该品的浓度可达血药浓度的54%～85%。该品少量在肝脏代谢。主要自肾排泄，以原形自尿中排出给药量的80%以上。血消除半衰期（t1/2?）为27～37小时，肾功能减退时明显延长。血液透析或腹膜透析可部分清除该品。
药物分析论文属于综述类型的论文。据调查相关公开信息显示，所有分析类论文都属于综述类型的论文。论文常用来指进行各个学术领域的研究和描述学术研究成果的文章，简称之为论文。
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药物色谱分析课程的教学探索论文
药物色谱分析是药学类专业本科生及研究生学习阶段的专业基础课。本课程主要讲述色谱法的基本理论、气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和色谱联用技术，以及这些色谱分析法在化学药物、中药、生化药物及体内药物分析中的应用。药物色谱分析以介绍《中国药典》中被广泛采用的气相色谱法和高效液相色谱法为主，主要教学目的是使学生掌握各种色谱分析技术的基本原理与基本方法，在化学药物、生化药物、中药及体内药物分析中应用这些技术，并进行定性或定量分析，帮助学生依据不同的药物类型，建立最佳的色谱分析思路。这些色谱知识的学习与色谱方法的掌握有利于学生建立正确的体内外药物色谱分析方法。色谱分析法是非常重要的分离技术，具有分析效率高、样品用量少、分析速度快、灵敏度高等优点。在药品研发、生产、流通及临床应用各个环节中都已广泛应用，是药品质量控制必备的方法。目前，大多数学生并未认识到本课程的重要性，在学习过程中缺乏足够的兴趣，很多学生都是为了应付考试而学习，考试结束后，基本忘光了所学知识，因此，教学效果亟须提高，教学方法也要改进，让学生带着兴趣、带着问题进行学习，从而在以后的学习工作中，遇到有关色谱分析的问题能够游刃有余。
1.色谱分析在药物分析中占据重要地位
药物色谱分析课本的第一章是绪论，主要介绍色谱法的一些基本情况。如果教师照本宣科，按课本顺序依次介绍色谱法的定义、特点、分类和发展历史等，很难让学生觉察到这门课程有什么重要性，也很难使其对这门课程有足够的兴趣。学生已学习了药物分析，对色谱分析有所了解，所以本课程应该首先强调色谱分析技术在药物分析中的地位，让学生对课程内容充分重视。可以从以下3个方面介绍：
（1)用流程图的方式讲解从药品研发、生产到临床应用各个环节中色谱分析的用途；
（2)介绍色谱分析在不同药物种类中质量控制的应用，包括化学药物、中药、中成药及生物药物等；
(3)对比各国药典，介绍药典中应用色谱法的品种数，突出色谱法在药物分析中具有不可或缺的地位及其在药物定量分析、体内分析方面的地位尤其重要。
通过这些介绍，学生基本明白色谱分析的重要性，然后再介绍色谱法的定义、特点、分类、发展等。另外，不同色谱分析方法的重要性也不同，柱色谱、纸色谱及薄层色谱的内容可以一带而过。键合型色谱是重点，尤其是反相色谱是重点中的重点。在讲解中要讲清楚每种色谱分析方法在药物分析中是如何使用的，主要可以分析哪些药物，使学生有一个清晰的认识，有利于认识这门课的重要性。
2.多媒体辅助教学
为提高学生的学习兴趣，可较多地采用多媒体计算机辅助教学。相比于传统教学，多媒体辅助教学的优势在于克服传统教学的单一性，将学习内容进行多元整合。运用多媒体技术，将学习内容有关的文本、声音、图形、动画、视频等进行有机的融合，学生学习起来不会感觉枯燥乏味，这种多感官的剌激也可以提高学习效果。例如，在介绍有关色谱仪操作时，先用文字的形式讲述一遍，然后再播放仪器使用的小视频，这样学生对学习内容能更好地理解与掌握。另外，将各种多媒体技术合理安排，充分应用，能让学生愉快地学习，达到寓教于乐的目的。最后，很多多媒体技术对学生而言是新鲜的，如用Flash动画、3D图片去表现学习内容，往往能有效地吸引学生的注意力，从而提高他们的学习兴趣。
目前，互联网上有很多优秀的教学资源，可以通过建立群组与论坛的形式与学生进行问题的讨论。采用这种方法的好处有以下3个方面：
(1)通过对课本知识的讨论，有利于学生进一步理解书本上的重点与难点，增加学生的学习兴趣；
(2)网络上可以査找一些本学科的前沿知识（一般课本较少提到前沿知识），扩大学生的视野，使学生了解本学科的'动态；
(3)在网络上与学生互动可增加学生对教师的亲切感，使学生喜欢上这门课；
(4)这种课后的互动，让学生感觉到学习不仅仅是课堂听讲，课后的讨论也能受益匪浅。这种网络上的学习，需要教师投入较多的时间与精力，对教师是一个考验，要经常在群组中发布大家感兴趣的问题，触发学生互动的兴趣。
3.启发引导式教学
传统的教学方式以教师和教材为中心，向学生灌输知识，学生依靠死记硬背的方式，能够应付考试，拿到学分，但是不利于学生思维能力的提高，在以后的学习和工作中，遇到有关专业问题，仍然束手无策。启发引导式教学方式已在药物分析教学上取得较好效果，因此，可以将这种教学方式引入药物色谱分析的教学中，通过巧设问题，让学生边想边学，集中注意力，同时用适当的提问鼓励学生进行思考，真正地让学生主动学习、主动思考，使教与学紧密结合。例如，在讲解高效液相色谱时，要问学生在前面的章节，讲气相色谱时，为什么不说高效气相色谱？高效液相色谱的分离效果有多高？有没有分离效果更好的色谱？通过这些问题的思考，使学生基本掌握各种色谱方法分离效果的不同。
4.案例教学
教师通过对典型案例的分析，组织学生有针对性地进行讨论，引导学生从个别到一般，从具体到抽象，通过实际案例进一步理解和掌握课程的基本理论与方法，这种教学方法称为案例分析。这种教学法能体现学生的主体性，有很强的针对性。在药物色谱分析中应用案例教学法，能激发学生的学习兴趣，帮助学生提高对实际问题的分析和解决能力。例如，讲解气相色谱相关基本理论知识后，给学生展示一个用气相色谱法测定复方丁香吸入剂中有效成分含量的实例，可以帮助学生理解如何选择固定相成分，如何进行程序升温，加入内标有什么作用等内容。案例教学法也可以帮助学生理解一些难点。例如，讲解如何判定一种药物是否能用气相色谱法分析时，学生往往难以做出判断。课堂上通过对能用气相法分析的药物进行结构分析，并给出代表性药物，学生就容易理解这些内容。学生往往对具体实例有较深刻的印象，以后碰到类似问题能很快回忆起所学知识，因此，案例教学法较好地解决了理论与实践相结合的问题。
5.实践教学
药物色谱分析是一门技术性很强的学科，实验教学是药物色谱分析课程必不可少的环节。通常要开设填充柱气相色谱实验、毛细管柱气相色谱实验、反相高效液相色谱实验及薄层色谱实验。在有条件的情况下，可以开设毛细管柱气相色谱-质谱联用实验、高效液相色谱-质谱联用实验及毛细管电泳实验。这些实验大多都要用到大型精密仪器，所以要严格要求学生实验课前书写预习报告，实验课上认真听从教师讲解仪器操作规范及注意事项，规范操作仪器，认真做好实验记录和结果分析，以写出完整的实验报告。
在理论课上已经讲解了仪器的构成，但学生没有直接印象，可以利用实验课程，通过拆解仪器的方式，让学生进一步直观感受仪器的内部结构，并对每一个部件的详细结构，如何保养及使用注意事项进行讲述。实验课中所用仪器一般都有对应的软件程序，这个内容在理论课上是没有的，所以，应对每一种仪器对应的软件程序内容作详细介绍，让学生熟练应用这些软件。
通过一些实验操作，也可以让学生加深对一些知识点的理解。例如，通过改变流动相的组分、比例、流速、柱温等方式来改善色谱的分离能力。在实验课上就可以演示，如通过改变这些参数，让2个原本未分离的组分达到完全分离。待学生熟悉基本操作后，可以通过设计性实验，提高学生的创新能力?。如果有学生对色谱分析特别感兴趣，可以让他们组成一个兴趣小组，在教师的指导下完成一些科研课题，训练他们的科研能力。
综合运用上述5种教学策略后，课堂上更多的学生认真听讲，积极参与课堂讨论，课后有更多学生问一些色谱相关问题，这些都说明学生的学习兴趣明显增加，学习主动性得到提高，由死记硬背、应付考试的学习方式转变成主动接受知识，能够应用学到的知识解决一些实际问题。
N-脱脘基化反应氧化脱胺反应N-氧化反应
药物进入体内会在一系列酶的作用下被催化为极性分子，发挥药效或者被正常代谢体系排除天外的过程就是药物代谢，这是机体的一种自我保护方式。药物代谢已经成为药理研究的重要部分。研究药物在体内的代谢过程及其化学变化，对于阐述药理作用、毒性研究、结构修饰等都具有重要意义，而药物代谢的过程最重要的角色便是参与其中的各种酶，包括细胞色素酶P450、还原酶、过氧化物酶、单加氧酶和水解酶。细胞色素 CYP450抑制分析是药物发现过程的重要组成部分，因为药物之间的不利相互作用将导致药物开发计划终止、药物撤市或限制治疗用途。由于需要在药物发现过程的早期淘汰表现不佳的候选药物，使得体外 ADME 分析也需尽早开展。今天我们来讨论下细胞色素酶P450的各个亚型，以及计算机方法在预测药物上的运用。 细胞色素酶P450 细胞色素酶P450（cytochrome P450 enzyme system, CYP450）主要存在于肝脏和其他组织的内质网中，是一类血红蛋白偶联单加氧酶，其发挥作用需要辅酶NADPH和分子氧的共同参与，主要参与药物的生物转化中氧化反应，包括失去电子、脱氢反应和氧化反应，CYP450是主要的药物代谢酶系。CPY450通过活化分子氧，使得其中一个氧与有机分子结合，同时将另一个氧原子还原为水，通过这种方式在药物分子中引入氧。CYP450催化的反应类型有烷烃和芳香化合物的氧化反应；烯烃、多核芳烃以及卤代笨的环氧化反应；仲胺、叔胺及醚的脱烷基反应；胺类的脱氨反应；将胺转化为N-氧化物、羟胺及亚硝基化合物以及卤代烃的脱卤反应等。具体参与代谢类型如下： CYP450是一组酶的总称，有许多同工酶和亚型组成，命名时用CPY代表CYP450,其后加阿拉伯数字表示CPY450的家族成员，例如CYP1、CPY2、CPY3等，在数字后加字母，则代表亚家族，如CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E等。CPY450最早发现与20世纪60年代，目前已经报道的CPY基因至少有57个，被分为18个家族和43个亚家族。虽然肝微粒体中有多个CPY450亚型，但参与药物代谢的酶只有少数几个，其中参与度最高的是CPY3A4。下图为CYP3A4与血红素和酮康唑结合结构图：下表展示了人不同亚型的CYP在药物代谢中的作用 其中，CYP3A4含量在肠道中占CPY总量的70%，在肝脏中占总量CYP的30%，抑制CPY3A4会导致药物在血液浓度的增加可能引起毒副作用，激活CPY3A4则会增强其对药物的代谢，有可能降低药效。有研究表明一些药物是CPY3A4底物的同时，也是P-糖蛋白（P-gp）的底物，一些药物通过被动转运进入肠道上皮细胞，会被CYP3A4代谢，同时又被P-gp外排至肠腔，是的药物在肠道细胞核肠腔之间形成一个连续的反复循环，导致药物减少吸收，限制了药物进入循环系统的量。许多阿片类镇痛药都被 CYP3A4 代谢, 同时又是 P-gp 的底物、抑制剂或诱导剂。在与抗逆转录病毒药物合用时通常会发生由 P-gp 和 CYP3A4 介导的 DDI。美沙酮的血药浓度会受利托那韦影响而明显减少, 因为利托那韦诱导 CYP3A4 使美沙酮的代谢增加, 同时抑制了 P-gp 对它的外排。 计算机预测方法药物代谢 在药物发现早期利用计算机模型预测药物可能参与的代谢，将极大节省药物研发的成本和提高药物发现的成功率。包括预测CPY450底物、抑制剂、代谢位点和代谢产物的预测，下面介绍几种CPY450药物代谢预测的计算机工具： 总结 由于该主题对药物发现的重要性，预计代谢预测软件的势头将在可预见的将来保持下去，但缺乏高质量的数据将不可避免地阻碍其进展，同时算法的精度也有进一步提升的空间。当前，由于CYP代谢与I期药物代谢密切有关，因此重点一直放在CYP代谢上，但其他清除途径有关的酶同样需要倾注更多的注意力，例如谷胱甘肽转移酶和磺基转移酶等。 参考文献 Tyzack J D, Kirchmair J. Computational methods and tools to predict cytochrome P450 metabolism for drug discovery[J]. Chemical biology & drug design, 2019, 93(4): 377-386.
药物从体内消除(elimination)主要有两种方式，即代谢(metabolism)和排泄(excretion)。代谢是大部分药物从体内消除的主要方式。药物的代谢反应大致可以分为氧化(oxidation)、还原(reduction)、水解(hydrolysis)和结合(conjugation)四种类型，氧化、还原和水解为Ⅰ相代谢，结合反应为Ⅱ相代谢。有些药物可以同时通过几种反应类型进行代谢。 (Intestinal Metabolism, Gut Metabolism)近年来研究发现许多药物在小肠吸收后通过肠壁时被代谢，从而导致药物的生物利用度降低，这种肠道的首过效应已引起相当重视。肠道内壁的上皮细胞从绒毛(villi)的低端移动到顶端后脱落，这个过程中上皮细胞逐渐成熟，整个过程大约需要两三天时间（图3）。肠壁中药物代谢酶主要分布于成熟的上皮细胞内，其中绒毛尖端活性最强。目前已经在肠壁中发现许多种类的代谢酶，如CYP26、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP3A5等, 其中以CYP3A4的含量最高(ref1)。许多临床常用的药物为CYP3A的底物，可以在肠壁内代谢。肠壁代谢是造成许多药物口服生物利用度偏低的重要原因之一。
海洋生物来源药物先导化合物的研究进展【摘要】 海洋生物中活性物质丰富，本篇文章对国内外近3年来从海洋生物中分离提取到的萜类化合物以及糖苷类化合物进行了归纳，并对其研究趋势进行了展望。这些新发现的萜类化合物广泛分布于海藻、珊瑚、海绵以及一些海洋真菌等海洋生物中，主要以单萜、倍半萜、二萜、三萜结构型式存在；而糖苷类化合物在海藻、海绵、海参、海星等海洋生物中发现大部分以糖苷脂、甾体糖苷、萜类糖苷型式存在。 【关键词】 海洋生物 萜类化合物 糖苷类 生物活性 【Abstract】 Marine organism show some important biological activities. This paper reviews terpenoids and glycosides from marine organism at home and abroad since 2005, and provides scientific evidence for reasonable exploitation and application. Terpenoids are mainly occurred on marine algae, coral, sponge and some fungi by monoterpene, sesquiterpene, diterpene and triterpene. And glycosides with structures of lipid, steroid and terpenoid are distributed to marine algae, sponge, sea cucumber and starfish. 【Key words】 Marine organism; terpenoid; glycoside; bioactivity 海洋是生命之源，由于海洋环境的特殊性，具有高压、低营养、低温（特别是深海）、无光照以及局部高温、高盐等生命极限环境，海洋生物适应了海洋独特的生活环境，必然造就了海洋生物具有独特的代谢途径和遗传背景，必定也会有新的、在许多陆地生物中未曾发现过的新结构类型和特殊生物活性的化合物。 萜类物质是一类天然的烃类物质，其分子中具有异戊二烯(C5H8)的基本单位。故凡由异戊二烯衍生的化合物，其分子式符合(C5H8)n通式的均称萜类化合物(terpenoids)或异戊二烯类化合物（isopenoids）。但有些情况下，在分子合成过程中由于正碳离子引起的甲基迁移或碳架重排以及烷基化、降解等原因，分子的某一片断会不完全遵照异戊二烯规律产生出一些变形碳架，它们仍属于萜类化合物。海洋生物中萜类化合物主要以单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜为主，三萜和四萜种类和数量都较少，且大部分以糖苷形式存在。萜类化合物是海洋生物活性物质的重要组成部分，广泛分布于海藻、珊瑚、海绵、软体动物等海洋生物中，具有细胞毒性、抗肿瘤活性、杀菌止痛等活性作用。 糖苷的分类有多种方法，按照在生物体内是原生的还是次生的可将其分为原生糖苷和次生糖苷（从原生糖苷中脱掉一个以上的苷称为次生苷或次级苷）；按照糖苷中含有的单糖基的个数可将糖苷分为单糖苷、双糖苷、三糖苷等；按照糖苷的某些特殊化学性质或生理活性可将糖苷分为皂苷、强心苷等；按照苷元化学结构类型可分为黄酮糖苷、蒽醌糖苷、生物碱糖苷、三萜糖苷等，海洋类的糖苷大部分是按照此特点分类的，主要包括鞘脂类糖苷、甾体糖苷、萜类糖苷和大环内酯糖苷等，在很多海洋生物如海藻、珊瑚、海参、海绵等中均发现有糖苷类化合物存在。已有的研究表明海洋糖苷类成分大都具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、增强免疫力等生物活性。抗白血病和艾氏癌药物阿糖胞苷Ara-C(D-arabinosyl cytosine) 1、抗病毒药物的Ara - A 2以及Ara-C的N4-C16-19饱和脂肪酰基化衍生物3是海洋糖苷类药物成功开发的典范〔1〕。 本篇文章对国内外自2005年来从海洋生物中分离提取到的萜类化合物以及糖苷类化合物进行了总结。 1 萜类化合物 单萜 2005年M. G. Knott等人〔2〕对从红藻Plocamium corallorhiza中分离得到的三种多卤代单萜化合物plocoralides A-C（1～3）〔3，4〕进行了活性研究，发现化合物Plocaralides B（2）， C（3）对食管癌细胞WHCOI具有中等强度的细胞毒作用，这些化合物具有卤素取代基。 倍半萜 从海泥来源的真菌Emericella variecolor GF10的发酵液中分离得到两个新型的倍半萜化合物6-epi-ophiobolin G（4）和6-epi-ophiobolin N（5），化合物在1～3μM浓度时能使神经癌细胞Neuro 2A凋亡，同时伴随细胞萎缩和染色体聚集〔5〕。这一类ophiobolins是天然的三环或四环的倍半萜化合物，对线虫、真菌、细菌以及肿瘤细胞有着普遍的抑制活性。 Willam Fenical等人从海洋沉积物分离得到一株放线菌CNH-099，在该菌的代谢产物中分离到具有细胞毒作用的新颖的 marinonc 衍生物 neomarinone（6）、isomarinone（7）、hydroxydebromomarinone（8）和methoxydeuromomarinonc（9），它们均是倍半萜萘醌类抗生素。Neomarinone（6）和marinones（7～9）对HCrll6结肠癌细胞显示中等程度的体外细胞毒作用(IC50=8μg/ml)，而且，neomarinone(6)对NCI-s60癌细胞也具有中等程度细胞毒作用（IC50=10μg/ml）〔6〕。 化合物花侧柏烯倍半萜（10～12）从希腊北爱情海希俄斯岛采集的红藻 L. microcladia中分离得到〔7〕。红藻 L. microcladia 经有机溶剂CH2Cl2/MeOH (3:1)提取，以Cyclohexane/EtOAc（9:1）为洗脱液进行硅胶柱层析，最后经HPLC纯化得到化合物（10-12）。该试验并对化合物活性进行了研究，发现三种化合物均对肺癌细胞NSCLC-N6 和 A-549有抑制作用，化合物（10）：IC50= μM (NSCLC-N6)和 μM (A-549)，化合物（11）：IC50 = μM (NSCLC-N6) 和 μM (A-549) ，化合物（12）：IC50= μM (NSCLC-N6)和 μM (A-549)。后两个化合物对肺癌细胞毒活性作用明显高于第一个化合物，推测可能由于后两个化合物结构中酚羟基以及五环内双键的存在提高了化合物活性，而化合物中溴原子的存在并没有对其活性构成影响。从中国南京采集的红藻L. okamurai也分离出四种衍生的花侧柏烯倍半萜化合物，分别是Laureperoxide （13）, 10-bromoisoaplysin （14）, isodebromolaurinterol （15）和10-hydroxyisolaurene （16）〔8〕。5种snyderane倍半萜（17～21）化合物从红藻L. luzonensis中分离得到〔9〕。 从一个软海绵种属Halichondria sp中分离得到四种具有抗微生物活性的含氮桉烷倍半萜化合物halichonadins A-D（22～25）〔10〕。该海绵采集于日本冲绳运天港， kg样品溶于4L MeOH，所得的115g MeOH提取物分别用1200ml EtOAc和400MlH2O萃取， EtOAc萃取物经硅胶柱层析后，洗脱液为MeOH/CHCl3（95:5）和石油醚/乙醚（9:1），得到化合物halichonadins A-D（22～25）和已知化合物acanthenes B、C。活性检测实验显示：化合物halichonadins A-D均具有抗细菌活性，同时halichonadins B和C也具有抗真菌活性，化合物halichonadins C对新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）的半致死浓度（IC50）达到μg/ml。三个部分环化的倍半萜（26～28）化合物具有抑制磷酸酶Cdc25B活性，从海绵Thorectandra sp.中分离得到〔11〕。冷冻的海绵样品经4℃去离子水浸泡冷冻干燥后得到的干涸物， 随后用MeOH/CH2Cl2（1:1）和MeOH/H2O（9:1）的有机溶剂提取获得粗提物。采用活性追踪的方式，对粗提物（IC50=8μg/ml）进一步分离，将其溶于100mlMeOH/H2O（9:1）有机溶剂中，得到的粗提物加入300ml正己烷，获得水相部分溶于MeOH/H2O（7:3）的溶剂中，再用300ml CH2Cl2提取得到的部分经活性测定显示对磷酸酯酶抑制活性最强（IC50=6μg/ml），之后采用反相C-18柱HPLC分离，得到部分环化的倍半萜化合物（26）16-oxo-luffariellolide（12mg, tR=18min），化合物（27） 16-hydroxy-luffariellolide ( mg, tR=19min)以及化合物（28） luffariellolide (, tR=38min)。五种属于倍半萜类的化合物hyrtiosins A-E （29～33），从中国海南两个不同地方的海绵Hyrtios erecta种属中分离得到〔12〕。 氧化的倍半萜化合物gibberodione（34）, peroxygibberol（35） 和 sinugibberodiol（36）从台湾软珊瑚Sinularia gibberosa分离得到〔13〕，化合物（35）具有较温和的细胞毒性〔14〕。从珊瑚Eunicea sp.中提取的七种倍半萜代谢产物（37～43）〔15〕，含有榄烷，桉烷和吉玛烷骨架结构，研究显示对Eunicea 种属的疟原虫具有轻度的抑制作用。 二萜 以前很少有从绿藻中分离得到萜类化合物的报道，但是与2004年相比，提取的代谢产物数量有所增加〔16〕。从澳大利亚塔斯马尼亚采集的绿藻Caulerpa brownii中分离出许多新型二萜类化合物，其中化合物（44～48）在没有分支的绿藻中提取得到〔17〕，而类酯萜化合物（49）是从分支的绿藻中获得，该研究同时显示提取的类酯萜化合物对细胞、鱼类、微生物均有不同程度的毒性作用〔18〕。 日本Koyama K等人从褐藻Ishige okamurae来源的未知海洋真菌(MPUC 046)中分离到一种新型的二萜类化合物phomactin H（50）〔19〕。真菌(MPUC 046)经含150g小麦的400ml海水25℃发酵培养31天后，采用CHCl3溶剂提取、硅胶层析及HPLC纯化得到phomactin H。该化合物同已发现的phomactin A-G化合物一样，均属于血小板活化因子（PAF）拮抗剂，能抑制PAF诱导的血小板凝聚，同时推测此活性与化合物的某个特定骨架结构有关。 从法国南部大西洋海滨采集的褐藻Bifurcaria bifurcata中分离得到（51～55）五种新型的极性非环状二萜类化合物〔20〕。该褐藻经CHCl3/MeOH（1:1）提取，硅胶层析（洗脱液为不同比例的Hexane，EtOAc，MeOH），经反相C-18柱HPLC纯化获得十二种化合物，其中五种为新型二萜类化合物。化合物（51～53）在Hexane: EtOAc（2:3）洗脱液中发现，而化合物（54）和（55）则从Hexane: EtOAc（1:4）洗脱液中获得。 6种新型的Dactylomelane二萜类化合物 (56～61)从西班牙特纳里夫南部家那利群岛采集的红藻Laurencia中分离得到〔21〕，其结构具有C-6到C-11环化的单环碳新型结构。采集的红藻经CH2Cl2/MeOH(1:1)有机溶剂提取后，用洗脱液Hexane/CHCl3/MeOH(2:1:1)进行Sephadex LH-20反相色谱分离，结合TLC点样筛选的部分用洗脱液EtOAc/hexane（1:4）进行硅胶柱层析，最后采用硅胶柱进行HPLC纯化得到六种新型的单环碳二萜类化合物Dactylomelans。从红藻L. luzonensis中也分离得到二萜类化合物luzodiol (62)〔9〕。一个溴代二萜类化合物 (63)从日本其他红藻Laurencia物种中分离得到 〔22〕。 Xenicane二萜类化合物(64～71)从台湾珊瑚Xenia blumi分离出来，而化合物xeniolactones A-C (72～74)则是从台湾Xenia florida中分离出来的〔23〕。化合物 (64～67), (69), (70) 和 (72)具有轻微的细胞毒性作用。非Xenicane代谢产物xenibellal (75)对Xenia umbellata也具有轻微的细胞毒性作用〔24〕。化合物Confertdiate (76)是一个四环的二萜类物质，从中国珊瑚Sinularia conferta中分离得到〔25〕。 从史密森尼博物院癌症研究所收集的海葵中分离得到的二萜类化合物actiniarins A-C (77～79)能适度抑制人cdc25B磷酸酶重组〔26〕。 Periconicins A,B (80～81)〔27〕是从内生红树林真菌Periconia sp.分离得到的二萜类的新化合物，能抑制不同微生物的生长活性，诸如bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6358p, Staphylococcus epidermis ATCC 12228等等。 南海真菌2492#是从采自香港红树林植物Phiagmites austrah样品中分离得到的，从2492#菌株的发酵液中分离得到的两种二萜类化合物 (82～83)有很好的生理活性〔28〕，如抗肿瘤、降压、调整心率失常，同时降压调整心率失常的作用在相同的条件下优于临床现用的阳性对照物。 从中国红树林植物Bruguiera gymnorrhiza分离出二萜类化合物 (84～86)，化合物(86)对小鼠成纤维细胞具有适当的细胞毒活性〔29〕。也从中国红树林另一物种Bruguiera sexangula var. rhynchopetala分离出三种二萜类化合物 (87～89) 〔30〕。与之结构相似的二萜类化合物 (90～93)从中国Bruguiera gymnorrhiza中分离得到，其中化合物 (92)和 (93)有轻微的细胞毒活性〔31〕。 二倍半萜 Willam Fenical研究小组从曲霉属Aspergillus海洋真菌（菌株编号CNM-713）分离到一个新的二倍半萜化合物aspergilloxide (94)，该化合物为含有25个碳原子的新骨架，对人的结肠癌细胞HCT-116有微弱的细胞毒活性〔32〕。在此之前，Willam Fenical等人从巴哈马的红树林中的漂浮木中也分离到一株真菌Fusarium heterosporum CNC-477， 并从中分离得到一系列多羟基二倍半萜类化合物neomangicols A-C（95～97）〔33〕和mangicols A-G (98～104)〔6〕，它们的结构如下图所示。Neomangicols的骨架为25个碳的二倍半萜，是首次从天然物中分离得到。药理实验显示化合物 (96)具有和庆大霉素大致相当的对革兰阳性细菌的抑制能力，化合物 (98)和 (99)对MPA(phorbol myristate acetate)诱导的鼠类耳朵水肿有抗炎症活性。 三萜 从海洋生物中提取得到的三萜类化合物主要以三萜皂苷、三萜烯类、三萜糖苷等形式存在。四环三萜皂苷类化合物nobilisidenol (105) 和 (106)是从中国黑乳海参Holothuria nobilis分离得到的〔34〕。采集于福建东山的黑乳海参洗净切碎后用85%的EtOH冷浸提取，得到的流浸膏均匀分散于水中，依次用石油醚、二氯甲烷、n-BuOH萃取，研究发现n-BuOH提取物经大孔吸附树脂、正相硅胶层析、反相C-18硅胶柱层析以及反相C-18 柱HPLC分离得到三萜皂苷类化合物nobilisidenol (105)和(106)。易杨华等同时从海参中提取到了其它的三萜糖苷类化合物以及三萜皂苷脱硫衍生物〔35，36〕。三萜烯类化合物intercedensides D-I（107-112）从中国海参Mensamaria intercedens中分离得到，具有细胞毒功能〔37〕。新西兰海参Australostichopus mollis是单硫酸酯三萜糖甙化合物mollisosides A（113）, B1（114） 和 B2（115）的来源〔38〕。 具有细胞溶解作用的三萜类化合物sodwanone S (116)是从印度洋多毛岛采集的海绵Axinella weltneri中分离得到的〔39〕。三萜苷类化合物sarasinosides J-M (117-120)分离自印尼苏拉威西岛采集的海绵Melophlus sarassinorum，对B. subtilis和S. cerevisae的细菌具有抗微生物活性作用〔40〕。 2 糖苷类化合物 从中国海南采集的甲藻A. carterae中分离得到一种不饱和的糖基甘油酯化合物（121）〔41〕。甲藻采集于中国海南三亚，经分离筛选得到的A. carterae大规模培养后用甲苯/MeOH（1:3）的有机溶剂提取，所得干涸物分别用甲苯、1N NaCl 水溶液提取。研究发现有机相提取物经硅胶柱（洗脱液为不同比例的MeOH/CHCl3）、反相C-18硅胶柱层析（洗脱液为MeOH/H2O=9:1），最后经反相C-18柱制备型HPLC（流动相为MeOH/H2O =95:5）分离纯化得到25mg不饱和的糖基甘油酯化合物（121）。从多米尼克普次矛斯采集的绿藻Avrainvillea nigricans中可以分离出一个甘油酯avrainvilloside（122），该化合物含有6-脱氧-6-氨基糖苷部分〔42〕。 两个甘油一酯化合物homaxinolin（123）和（124），磷脂酰胆碱homaxinolin（125）以及能抑制细胞生长的脂肪酸（126）是从韩国海绵Homaxinella sp.中分离得到的〔43〕。从红海采集的海绵Erylus lendenfeldi分离得到的两个甾体糖苷类化合物erylosides K（127）和L（128）能选择性的抑制酵母菌株的rad50芽体，rad50能修复协调受损的双链DNA〔44〕。 海参Stichopus japonicus是五种糖苷化合物SJC-1（129），SJC-2（130）, SJC-3（131）, SJC-4（132） 和 SJC-5（133）的主要来源〔45〕。五种化合物均从弱极性CHCl3/MeOH部分分离出来，其中SJC-1（129）, SJC-2（130）, SJC-3（131）是典型的鞘甘醇或植物型鞘甘醇葡萄糖脑苷脂类化合物，含有羟基化或非羟基化的脂肪酰基结构。SJC-4（132） 和 SJC-5（133）也含有羟基化的脂肪酰基结构，但是含有独特的鞘甘醇基团，是两种新型的葡萄糖脑苷脂类化合物。Linckiacerebroside A（134）是从日本海星Linckia laevigata分离出的一种新型糖苷脂化合物〔46〕。 甾体糖苷孕甾-5, 20-二烯-3β-醇-3-O-α-L-吡喃岩藻糖苷（135） 和 孕甾-5, 20-二烯-3β-醇-3-O-β-D-吡喃木糖苷（136）从中国短足软珊瑚Cladiella sp.中分离得到〔47〕。将新鲜的软珊瑚干质量 kg用乙醇在室温下浸泡 3 次, 合并提取液, 减压浓缩后得到深褐色浸膏 用30%的甲醇溶解后, 依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取, 石油醚提取液经减压浓缩后得棕黑色胶状物 ，将此提取物硅胶柱减压层析, 用石油醚乙酸乙酯溶剂体系梯度洗脱, 从石油醚/乙酸乙酯（20:80）洗脱液中所得的洗脱部分在反相C-18柱上进行HPLC分离, 用MeOH洗脱得到化合物60mg（135）和3mg（136），该类化合物具有抗早孕和抑制肿瘤细胞生长活性。 四种甾体糖苷化合物（137-140）是从中国珊瑚Junceella juncea EtOH/CH2Cl2提取液中分离得到〔48〕。 3 结语 目前，从海洋生物中发现的萜类和糖苷类天然化合物的数量近几年呈现逐渐增加的趋势，有些化合物的活性确切而且活性作用强烈是很有希望的一些药物先导化合物，但是用于临床研究的化合物还相对较少，因此开发更多新的天然化合物是有必要的。其次，从海洋生物中发现的活性化合物也存在着活性较低或毒性较大等问题,可以通过对其结构进行修饰，使其活性达到最佳效果。此外，从海洋生物中提取的活性化合物含量通常较低，而且化合物在提取过程中受到提取试剂、方法等外界因素的影响，所以采用化学合成的方法进行化合物的半合成或者全合成解决化合物在提取过程中结构易变、试剂耗量大等缺点。例如从海洋真菌中发现的结构新颖，有抗菌、抗癌和神经心血管活性的物质头孢菌素C，就是从海洋真菌中分离得到的，这是一大类半合成的广为人知的抗生素，它已广泛用于临床〔49〕。所以采用合成或半合成的方法解决活性化合物作为药源的大量生产方式是通行的。我们期待着这些药物先导化合物在药物开发方面发挥重要作用。
药品生物测定的发展趋势〔摘要〕 生物测定是经典的药品检测专业之一，现代仪器分析的广泛应用，给其带来了极大的挑战和机遇，面对目前的基本状况，阐明了生物测定专业在中药开发、新药研制、药物安全性评价及微生物限度检查方面的应用和发展趋势。 〔关键词〕 生物测定；药理；药品 药品是特殊商品，药品质量直接关系到用药者的安全和疗效。药品检测方法和检测水平随着制药工业的发展不断改进提高。由于现代科学技术的发展，相邻学科之间的相互渗透，分析化学的发展经历了三次巨大的变革，使分析化学发展成为以仪器分析为主的现代分析化学。面对生命科学中复杂的分离分析任务，发展了色谱分析方法。结构分析、价态分析、晶体分析等方面的研究又促进了光谱分析的发展。以计算机应用为主要标志的信息时代的来临，仪器分析迅速发展，为药物检测提供各种非常灵敏、准确而快速的分析方法〔1〕。生物测定受到了极大的挑战，其发展前景令我们从事药品生物测定工作者所关注。 1 药品生物的特点与业务范围 药品生物测定的定义与特点 药品生物测定（简称生测）是利用药品（或药品中的有害杂质）对生物（或离体器官及组织）所引起的反应来测定药品的含量或安全性的一种方法。 生测法的优点是测定的结果与医疗要求基本一致，能直接反映药品的效果或毒副作用，这是其他物理学方法或化学方法所不能达到的。因此，目前各国药典仍大都采用这一方法。 生测法的缺点是检验周期长，微生物有生长繁殖过程，动物有生理代谢过程，观察分析时间一般在2~7天，有些试验会更长。影响因素多，有生物差异性，也有系统操作误差和环境条件等造成的影响。用品用具、动物质量、仪器设备都会对结果产生影响〔2〕。所以，以生测主检的品种在中国药典中逐版减少。 药品生物测定的业务范围 中国药典是法定的药品标准，它将药品质量控制项目归为四类：性状、鉴别、检查和含量。生测的业务主要涉及到中西药品的检查类和含量类。 其中作为药品安全性检查项目最多，包括：无菌、热原、细菌内毒素、异常毒性、安全试验、急性全身毒性、过敏物质、刺激性、溶血、降压物质、微生物限度等。含量（或效价）测定包括：抗生素微生物检定法，胰岛素、硫酸鱼精蛋白、缩宫素、卵泡刺激素、黄体生成素、升压素等生物检定法。 2 药品生物测定的现状 由于现代化检测仪器的广泛应用，药品生物测定的品种和范围，方法和要求，也发生了很大变化。 品种和范围的变化 抗生素的含量测定，最初大部分抗生素用微生物法测定含量。随着制药工业发展，提纯方法不断改进，有效组分更加明确，许多品种检测方法不断改为仪器测定和化学测定。例如：2000年版中国药典收载约219个抗生素品种，其中有15个原料药及其制剂从1995年版的化学法和微生物法改为高效液相色谱法（简称HPLC），使该法达到97种，微生物法仅有24个，其中9个品种是新增加的。有人预计本世纪初，HPLC法会发展成为中国药典使用频率最高的一种仪器分析法〔3〕。规定取消抗生素过期检验，抗生素微生物效价测定的业务工作量更是明显减少。 药品注射剂的热源检查。1942年美国首先将家兔法收入药典，相继世界各国药典均规定用该法。中国药典从1953年开始收载。自1973年以来，鲎试剂被证明是一种检测细菌内毒素（热原）存在的灵敏试剂。用鲎试剂要比家兔试验迅速、经济，所需样品量少，操作过程工作量小，每天可进行许多样品检测。1980年美国药典20版首载“细菌内毒素检查法”，1985年USP21版收载5种注射用水及40种放射性药品。1991年11月执行的USP22版第五增补版公布了185种药品删除家兔法，用细菌内毒素检查法代替。1995年USP23版注射剂的热源项几乎都被细菌内毒素检查法代替〔4〕。 我国从20世纪70年代开始研究制备鲎试剂，1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法，1993年中国药典第二增补本收载该法，但未涉及任何品种，1995年中国药典二部正式收载，并规定了注射用水、氯化钠注射液和二十多种放射性药品并删除热源检查，以内毒素代替。2000年版中国药典进一步扩大到68种。预计2005年版中国药典还要继续增加品种，热源项都将被内毒素代替。动物试验改为生化试验。 实验动物 生测离不开实验动物，在实验中，为了减少生物差异，提高动物反应敏感性，以最少的动物达到最满意的结果。国家非常重视实验动物，1988年国务院颁布了《实验动物管理条件》，对实验动物的饲管、管理、使用等做出了明确规定，实行达标认证制度，严格管理。按微生物控制程度把实验动物分为四级：普通动物、清洁动物、无特殊病原体动物和无菌动物〔5〕。一般动物实验必须达到清洁动物标准，种系清楚，不杂乱，无规定指出的疾病。动物级别越高，饲养管理条件越严，设施投资越大。实验动物是实验研究的活试剂，既要有纯度，也要有数量，背景明确，来源清楚，符合要求才能使用。（随着药品纯度的提高，凡是有准确的化学和物理方法或细胞学方法能取代动物实验，进行药品和生物制品质量检测，应尽量采用，以减少动物的使用。） 药品生物测定在方法上的改进与变化 为了缩短操作时间，减少实验误差，近年来生测方面也研制并投入使用了部分仪器设备，如：抗生素抑菌圈测定仪、微机热原测温仪、集菌仪、细菌数测定仪等，减轻了工作强度，提高了工作效率，检测结果更加准确可靠。 3 药品生物测定的发展趋势 生测作为经典方法沿用至今，表明它有其他方法不能替代的特点，在药品检验中发挥了重要作用。不少老产品改为其他方法控制质量，也会不断有新产品离不开生测法，我们应当充分发挥它的优点，尽量克服它的不足，开拓新的业务范围。 微生物限度检查工作量大 为了控制药品染菌限度，1975年美国药典19版首载微生物限度检查，1980年英国药典收载，我国在1990年由卫生部颁布了药品卫生标准及检验方法，1995年版中国药典正式收载〔6〕。2000年版中国药典按剂型规定了微生物限度标准，执行范围除注射剂和中药饮片外几乎包括中西药的所有制剂和原料。该项检查成为药典品种适用最多的检查项目，占当前地市级药品检验所生测室业务工作量的80%以上。在这项检查中，有大量的业务技术需要我们进一步研究，改进试验条件，使数据准确，探讨快速检测的新方法。药包材的检查，国家药监局已经发布试行标准，业务范围将更加扩大，这是我们进一步做好工作，努力探讨研究的新领域。 药品生物测定在中药开发中的作用 我国是中药王国，2000年版中国药典一部共收载920种，其中中成药398种。有含量测定的157种，仅占总数的17%，中药成分多，杂质和干扰物质很多。复方制剂，尤其大复方制剂专属性的检出处方中所含药材很困难，有大量的研究工作需要做。中成药中的杂质如重金属、残留农药等达到一定水平会产生毒副作用，影响药物安全性〔7〕。要让中药制剂打进国际市场，我们在检查类的控制项目和含量类的方法探讨方面有大量工作要做，生物测定可以在毒理、药理方面进行研究、探讨，逐步完善质量控制标准，提高制剂质量发挥更大的作用。 新药研制开发与安全性评价 新药研制开发是多学科合作的系统工程。在获得一个具有生物活性的化合物后，研究开发组织者要在生物医学领域进行药物评价研究，首先必须组织药理学、毒理学、病理学、兽医学、遗传学、生物化学、药代动力学方面的专家进行合作研究，按药物非临床研究管理规范GLP进行管理。组织药理、毒理（包括一般毒理和特殊毒理）、病理、药代动力学和毒代动力学、药物分析、临床化学、实验动物、生物统计、质量保证等部门有关人员进行讨论，分阶段做出评价〔8〕。生测在这方面可以参加开发研究或进行技术指导。 药物动力学研究，通常需要从动物体液或组织器官匀浆中分离、鉴定和检测代谢后的原粉及其他代谢产物。但是，将服药动物按指定时间间隔处死，测定随时间变化的血药浓度，不仅动物用量大，而且常因动物个体差异无法得到可靠结果，也无法在同一动物重复实验确证。处死动物的代谢产物也只能反映被处死时的结果，无法了解药物代谢的全过程。有学者报道，采用微透析取样技术，可在活的动物不同部位重复取样，用微柱液相色谱〔9〕或毛细管电泳〔10〕进行分析，测定药物的吸收、分布、代谢和排泄情况〔11〕。 自动进取样装置和计算机工作站应用于药理实验的探讨，使药品生物测定趋向微量、灵敏、专属、简便、快速和自动化的方向发展。 综上所述，药品生物测定是药物分析的重要组成部分，是不可缺的检测专业，现代仪器的大量使用，不仅不会影响其发展，而是如虎添翼，让药品生物测定展示出新的前景。 〔参考文献〕 1 倪坤义，田颂九，丁丽霞.21世纪药物分析学的发展趋势.中国药学杂志，2000，35（12）：798. 2 张治锬.抗生素药品检验.北京：人民卫生出版社，1991，12-20. 3 田颂九，丁丽霞，田洁.国内外药典中质量标准的发展趋势简述.中国药学杂志，1999，34（11）：781. 4 吴伟洪.鲎与鲎试验法论文汇编（三）.厦门鲎试剂厂，1996，18. 5 施新猷.医学实验动物学.西安：陕西科学技术出版社，1989，32. 6 马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册.北京：科学出版社，2000，59. 7 李真，龚培力，曾繁典.药物杂质及其对安全性的影响.中国临床药学杂志，2001，17（6）：452. 8 刘昌孝.美国新药研究开展与药物安全性评价研究概况.中国药学杂志，1999，34（11）：785. 9 Chen AQ,Lunte sampling coupled on-line to fast microbore liquid Chromatogr,1995,691（1-2）:29. 10 Qanson electrophoresis and microdialysis:current technology and Chromatogr B,1997,697：89. 11 Yang H,Wang Q,Elmquist WF,et desin and validation of a novel intravenous microdialysis probe:application to fluconazole pharmacokinetics in the freelymoving rat Res,1997,14
摘要：现代生物技术制药工业始于1971年，现已创造出35个重要治疗药物，全球大约有2500多家公司，主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代开始进行现代生物技术药品的研究和开发，到1998年7月底，我国已有近200多个现代生物技术制药企业，已有14种现代生物技术药品和疫苗投产，已经批准进入临床的有近10种药，正在进行临床前研究的有10多种。在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。其中不重视中试放大过程是影响我国生物技术产业化发展的一个很重要的原因。 关键词：生物技术制药 生物技术的应用 生物技术发展 生物药物研究进展 生物技术药物(biotech drugs)或称生物药物(biopharmaceutics)是集生物学、医学、药学的先进技术为一体，以组合化学、药学基因（功能抗原学、生物信息学等高技术为依托，以分子遗传学、分子生物、生物物理等基础学科的突破为后盾形成的产业。现在，世界生物制药技术的产业化已进入投资收获期，生物技术药品已应用和渗透到医药、保健食品和日化产品等各个领域，尤其在新药研究、开发、生产和改造传统制药工业中得到日益广泛的应用，生物制药产业已成为最活跃、进展最快的产业之一。有些学者认为，20世纪的科学技术是以物理学和化学的成就占主导地位，而21世纪的科学技术是以生物学的成就占主导地位。无论这种说法是否得到普遍的认同，生物技术是当今高技术中发展最快的领域似乎是不争的事实。 科学家预测，生命科学到2015年会取得革命性进展。这些进展可以帮助人类解决很多目前无法医治的疾病的治疗问题，彻底消除营养不良，改善食品的生产方式，消除各种污染，延长人类寿命，提高生命质量，为社会安全和刑侦提供新的手段。有些成果还可以帮助人类加速植物和动物的人工进化以及改善生态环境对人类的影响等。产生新的有机生命的研究也会取得进展。 1.生物制药现状 目前生物制药主要集中在以下几个方向： 1 肿瘤 在全世界肿瘤死亡率居首位，美国每年诊断为肿瘤的患者为100万，死于肿瘤者达万。用于肿瘤的治疗费用1020亿美元。肿瘤是多机制的复杂疾病，目前仍用早期诊断、放疗、化疗等综合手段治疗。今后10年抗肿瘤生物药物会急剧增加。如应用基因工程抗体抑制肿瘤，应用导向IL-2受体的融合毒素治疗CTCL肿瘤，应用基因治疗法治疗肿瘤(如应用γ-干扰素基因治疗骨髓瘤)。基质金属蛋白酶抑制剂(TNMPs)可抑制肿瘤血管生长，阻止肿瘤生长与转移。这类抑制剂有可能成为广谱抗肿瘤治疗剂，已有3种化合物进入临床试验。2 神经退化性疾病 老年痴呆症、帕金森氏病、脑中风及脊椎外伤的生物技术药物治疗，胰岛素生长因子rhIGF-1已进入Ⅲ期临床。神经生长因子(NGF)和BDNF(脑源神经营养因子)用于治疗末稍神经炎，肌萎缩硬化症，均已进入Ⅲ期临床。 美国每年有中风患者60万，死于中风的人数达15万。中风症的有效防治药物不多，尤其是可治疗不可逆脑损伤的药物更少，Cerestal已证明对中风患者的脑力能有明显改善和稳定作用，现已进入Ⅲ期临床。Genentech的溶栓活性酶(Activase重组tPA)用于中风患者治疗，可以消除症状30%。 3 自身免疫性疾病 许多炎症由自身免疫缺陷引起，如哮喘、风湿性关节炎、多发性硬化症、红斑狼疮等。风湿性关节炎患者多于4000万，每年医疗费达上千亿美元，一些制药公司正在积极攻克这类疾病。如 Genentech公司研究一种人源化单克隆抗体免疫球蛋白E用于治疗哮喘，已进入Ⅱ期临床;Cetor′s公司研制一种TNF-α抗体用于治疗风湿性关节炎，有效率达80%。Chiron公司的β-干扰素用于治疗多发性硬化病。还有的公司在应用基因疗法治疗糖尿病，如将胰岛素基因导入患者的皮肤细胞，再将细胞注入人体，使工程细胞产生全程胰岛素供应。 4 冠心病 美国有100万人死于冠心病，每年治疗费用高于1 170亿美元。今后10年，防治冠心病的药物将是制药工业的重要增长点。Centocor′s Reopro公司应用单克隆抗体治疗冠心病的心绞痛和恢复心脏功能取得成功，这标志着一种新型冠心病治疗药物的延生。基因组科学的建立与基因操作技术的日益成熟，使基因治疗与基因测序技术的商业化成为可能，正在达到未来治疗学的新高度。转基因技术用于构造转基因植物和转基因动物，已逐渐进入产业阶段，用转基因绵羊生产蛋白酶抑制剂ATT，用于治疗肺气肿和囊性纤维变性，已进入Ⅱ，Ⅲ期临床。大量的研究成果表明转基因动、植物将成为未来制药工业的另一个重要发展领域。 2.生物制药展望 今后10年生物技术将对当代重大疾病治疗剂创造更多的有效药物，并在所有前沿性的医学领域形成新领域。目前热门的药物生物技术如下：表1 热门药物生物技术技 术 新颖性 技 术 新颖性 组合化学 成熟领域 前导物综合鉴定技术 新生技术 药学基因组科学 发展领域 核糖酶 新生技术 蛋白质工程 发展领域 抗体酶 新生技术 基因治疗 发展领域 药物设计与人工智能 新生技术 糖类治疗剂 发展领域 功能抗原 新生技术 表2 正在研究开发的生物技术药物类型领 域 开发药物品种 领 域 开发药物品种 单克隆体 78 人生长激素 5 疫苗 62 组织纤溶酶原激活剂 4 基因治疗 28 凝血因子 3 白介素 11 集落细胞刺激因子 3 干扰素 10 促红细胞生成素 2 生长因子 10 SOD 1 重组可溶性受体 6 其他 56 反义药物 6 总数 284 生物学的革命不仅依赖于生物科学和生物技术的自身发展，而且依赖于很多相关领域的技术走向，例如微机电系统、材料科学、图像处理、传感器和信息技术等。尽管生物技术的高速发展使人们难以作出准确的预测，但是基因组图谱、克隆技术、遗传修改技术、生物医学工程、疾病疗法和药物开发方面的进展正在加快。除了遗传学之外，生物技术还可以继续改进预防和治疗疾病的疗法。这些新疗法可以封锁病原体进入人体并进行传播的能力，使病原体变得更加脆弱并且使人的免疫功能对新的病原体作出反应。这些方法可以克服病原体对抗生素的耐受性越来越强的不良趋势，对感染形成新的攻势。 除了解决传统的细菌和病毒问题之外，人们正在开发解决化学不平衡和化学成分积累的新疗法。例如，正在开发之中的抗体可以攻击体内的可卡因，将来可以用于治疗成瘾问题。这种方法不仅有助于改善瘾君子的状况，而且对于解决全球性非法毒品贸易问题具有重大影响。 各种新技术的出现有助于新药物的开发。计算机模拟和分子图像处理技术(例如原子力显微镜、质量分光仪和扫描探测显微镜)相结合可以继续提高设计具有特定功能特性的分子的能力，成为药物研究和药物设计的得力工具。药物与使用该药物的生物系统相互作用的模拟在理解药效和药物安全方面会成为越来越有用的工具。例如，美国食品药物管理局(FDA)在药物审批的过程中利用Dennis Noble的虚拟心脏模拟系统了解心脏药物的机理和临床试验观测结果的意义。这种方法到2015年可能会成为心脏等系统临床药物试验的主流方法，而复杂系统(例如大脑)的药物临床试验需要对这些系统的功能和生物学进行更为深入的研究。 到下世纪初生物技术药物的种类数目尚不会超过一般药物的总数，但生物技术制药公司总数将超过前10年的6倍。目前主要生物技术公司多分布在美国，如Amgen,Genetics institute,Genzyme,Genentech和Chiron，还有Biogen也发展较快。1987年尚没有一种重组DNA药物进入世界药品销售额排名前列表，但到1996年已有多种生物工程药物榜上有名。经上市的生物技术药物主要含3大类，即重组治疗蛋白质、重组疫苗和诊断或治疗用的单克隆抗体。 药物的研究开发成本目前已经高到难以为继的程度，每种药物投放市场前的平均成本大约为6亿美元。这样高的成本会迫使医药工业对技术的进步进行巨大的投资，以增强医药工业的长期生存能力。综合利用遗传图谱、基于表现型的定制药物开发、化学模拟程序和工程程序以及药物试验模拟等技术已经使药物开发从尝试型方法转变为定制型开发，即根据服药群体对药物反应的深入了解会设计、试验和使用新的药物。这种方法还可以挽救过去在临床试验中被少数患者排斥但有可能被多数患者接受的药物。这种方法可以改善成功率、降低试验成本、为适用范围较窄的药物开辟新的市场、使药物更加适合适用对症群体的需要。如果这种技术趋于成熟，可以对制药工业和健康保险业产生重大影响。 值得注意的是，制药工业的知识产权保护在世界各地是不平衡的。某些地区(例如亚洲)会继续以生产专利过期药物为主，有些地区(如美国和欧洲)除了继续生产低利润的药物外会不断开发新的药物。 总之，综合多学科的努力，通过新技术的创立可以大大拓宽发明新药的空间，增加发明新药的机遇与速度。因为这些手段可以寻找快速鉴定药物作用的靶，更有效地发现更多新的先导物化学实体，从而为发明新药提供更加广阔的前景。
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