海兹思专业做原子力显微镜。
高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.[4] Goldman RD,Spector cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.[6] 李栋栋,郭学彬,瞿安连.以三维荧光反卷
今天上了一节科学课,老师给我们拿来了四台显微镜.他要我们用显微镜来观察平时用肉眼看不到的东西.我们听了,感到既新奇又兴奋.老师首先要我们撕下一小块干净的白纸,再让我们用手去摸.我们告诉老师它不但很平整而且很光滑,老师又让我们看了看它,非常干净.等我们开始用显微镜时看的时候,纸的表面原来像山丘一样高低起伏,连绵不断,千沟万壑,有许多小的黑点.哦!原来纸是这个样子的,难怪用墨水在纸上能留下痕迹.因为下了雨,老师又叫我们到操场上的水洼去弄了一滴水,把它滴在载玻片上,放到显微镜下去观察.我看到了几只像鞋底一样的虫子.老师告诉我们它叫草履虫,它只有毫米长,用肉眼只能看到一个小白点,用放大镜可看到它在动,只有用显微镜,才能看到庐山真面目!“有谁用显微镜观察过皮肤?”老师问,我们一下子会意了,老师要我们观察皮肤.我们用镊子夹下手背上的一小块皮,放在显微镜下.它就像一张地图,有许多交错的纹络,还有许多小黑点,这些黑点就像地图上标明的城市.老师说那小黑点可能是灰尘,如果想看到皮肤细胞,那就只有用电子显微镜才能看到.仿佛一眨眼的功夫,这节课就过去了,它不但让我长了知识,还让我悟出了一个道理：同一个事物,从不同的角度来观察,就会有新的发现.
不知道怎么写的话也可以参考下别人是怎么写的呀~看下（材料科学）或者（材料化学前沿）这样类似的期刊多学习学习下呗~
今天上了一节科学课,老师给我们拿来了四台显微镜.他要我们用显微镜来观察平时用肉眼看不到的东西.我们听了,感到既新奇又兴奋.老师首先要我们撕下一小块干净的白纸,再让我们用手去摸.我们告诉老师它不但很平整而且很光滑,老师又让我们看了看它,非常干净.等我们开始用显微镜时看的时候,纸的表面原来像山丘一样高低起伏,连绵不断,千沟万壑,有许多小的黑点.哦!原来纸是这个样子的,难怪用墨水在纸上能留下痕迹.因为下了雨,老师又叫我们到操场上的水洼去弄了一滴水,把它滴在载玻片上,放到显微镜下去观察.我看到了几只像鞋底一样的虫子.老师告诉我们它叫草履虫,它只有毫米长,用肉眼只能看到一个小白点,用放大镜可看到它在动,只有用显微镜,才能看到庐山真面目!“有谁用显微镜观察过皮肤?”老师问,我们一下子会意了,老师要我们观察皮肤.我们用镊子夹下手背上的一小块皮,放在显微镜下.它就像一张地图,有许多交错的纹络,还有许多小黑点,这些黑点就像地图上标明的城市.老师说那小黑点可能是灰尘,如果想看到皮肤细胞,那就只有用电子显微镜才能看到.仿佛一眨眼的功夫,这节课就过去了,它不但让我长了知识,还让我悟出了一个道理：同一个事物,从不同的角度来观察,就会有新的发现.
我也不是很清楚的啊
【摘要】体育科学横跨自然科学与社会科学两大门类，具有极强的综合性特征，有其独特的研究对象和科学方法，体育科研论文的写作亦有自己的特点与要求。本文仅就体育科研论文的文章结构、基本格式以及内容与要求作一探讨。【关键词】科研论文；文章结构；基本格式；内容与要求OntheBasicStructureandFormofSportsScienceThesis【Keywords】Thesis;StructureandForm;ContentandRequirement＊＊＊1前言从事体育科学研究活动，必须具备多学科的知识、多方面的能力和科学的方法。体育科技写作，不仅是体育工作者应具备的知识和能力，而且是必须把握的一种具体的科研方法。因为，一切体育科学研究之成果最后大都以科研论文这种书面表达形式，经科技信息载体传播于世的。体育科研成果如不能最后写成科技作品（论文），公布于众，那么一切个人的科学见解和观点，一切创造和发明，都不可能得到传播和利用，产生应有的社会效益，而只能是研究者头脑里的一些思维活动罢了，世人是无法知晓的，如然，也就失去了科学研究的意义了。诚然，人们衡量体育科研论文质量的标准主要取决于其理论和实践价值的大小，然而，论文所反映的研究成果能否迅速的向社会传播并准确的被人们所理解则取决于论文写作水平的高低。这表明，一篇高质量的体育科研论文要求其内容和形式的统一。随着体育科学的迅速发展，科技信息量与日俱增，据报道，目前全世界体育期刊已达5000余种，每年问世的体育科技文献约25000—30000篇，平均天天有80余篇。体育科研成果的传播、贮存与利用，引起了人们的高度重视，借助于现代科技工具——计算机对体育科技成果、信息进行贮存、检索，使之迅速地传播与利用，已成为一种先进的传播交流手段。微机贮存与检索，要求体育科技学术期刊编排实现规范化，而期刊编排规范化首先要求论文写作的规范化。要实现体育科研论文写作的规范化，就必须了解体育科技写作知识，把握其写作方法和技巧。笔者因职业之原故，拜读体育科研论文原稿颇多，从研读原稿论文感到许多科研论文的选题和所研究的内容颇有价值，但论文写作不符合期刊编排规范化和科研论文撰写的要求。其中最为普遍的突出的问题是文章结构层次混乱、写作格式极不统一（尤其是理论型和实验型的“定量化”研究论文）。这不仅给编者和读者熟悉和理解论文之精髓增加了难度，也直接影响了体育科研成果的传播、贮存和利用。体育科技写作，作为一种科研方法，涉及的知识结构内容颇多，不同文体的体育科技作品有不同的写作要求。本文仅对体育科研论文的文章结构和基本撰写格式的内容与要求作一探讨。2体育科研论文的文章结构根据写作目的的不同、研究对象和方法的差别，体育科研论文大致分为两类，一类是学位论文，一类是学术论文。学位论文，是体育院校的学生或体育科研院（所）研究人员旨在取得学位而写作的论文。如学士论文、硕士论文、博士论文。学术论文，是广大体育工作者在体育实践中为研究和解决某一问题而写作的论文。目前，体育科学技术、理论研究的新成果大部分都是以学术论文的形式发表在体育科技学术刊物上。由于研究对象和方法的差别，学术论文又分为两种类型，即理论型论文和实验型论文。虽然体育科研论文的种类很多，构成的形式多样，但就其文章的主体结构有它的基本型，即序论、本论、结论的三段式。2。1序论部分的写作内容与要求序论，是论文的开头、引子，好比一出长剧的序幕，要有吸引力。通常以引言、导言、绪言、前言等小标题冠之，也可以不冠以任何小标题。该部分的写作内容主要有三个方面：①介绍课题研究的背景材料，前人的工作和现在的知识空白；②研究的理由、目的，理论依据和实验基础，预期结果及其在相关领域里的地位、作用和意义；③交待课题研究的范围、任务。这一部分要写得简明扼要，在整篇文章中它所占的比例要小。具体要求是背景材料的介绍要准确、具体，紧扣课题；研究的说明要实事求是，对作用意义不可夸大和自我评价；任务的交待应具体、明确。2。2本论部分的写作内容与要求本论也称正论，它是体育科研论文的主体，课题的“创造性”主要在这一部分表达出来，它反映了论文所建立的学术理论、采用的技术路线和研究方法达到的水平，简言之，本论水平决定了整个论文的水平。
高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.[4] Goldman RD,Spector cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.[6] 李栋栋,郭学彬,瞿安连.以三维荧光反卷
海兹思专业做原子力显微镜。
今天上了一节科学课,老师给我们拿来了四台显微镜.他要我们用显微镜来观察平时用肉眼看不到的东西.我们听了,感到既新奇又兴奋.老师首先要我们撕下一小块干净的白纸,再让我们用手去摸.我们告诉老师它不但很平整而且很光滑,老师又让我们看了看它,非常干净.等我们开始用显微镜时看的时候,纸的表面原来像山丘一样高低起伏,连绵不断,千沟万壑,有许多小的黑点.哦!原来纸是这个样子的,难怪用墨水在纸上能留下痕迹.因为下了雨,老师又叫我们到操场上的水洼去弄了一滴水,把它滴在载玻片上,放到显微镜下去观察.我看到了几只像鞋底一样的虫子.老师告诉我们它叫草履虫,它只有毫米长,用肉眼只能看到一个小白点,用放大镜可看到它在动,只有用显微镜,才能看到庐山真面目!“有谁用显微镜观察过皮肤?”老师问,我们一下子会意了,老师要我们观察皮肤.我们用镊子夹下手背上的一小块皮,放在显微镜下.它就像一张地图,有许多交错的纹络,还有许多小黑点,这些黑点就像地图上标明的城市.老师说那小黑点可能是灰尘,如果想看到皮肤细胞,那就只有用电子显微镜才能看到.仿佛一眨眼的功夫,这节课就过去了,它不但让我长了知识,还让我悟出了一个道理：同一个事物,从不同的角度来观察,就会有新的发现.
分子生物技术在微生物降解环境 污染物中的应用 [摘要〕介绍了与环境微生物关键降解酶基因的筛选、克隆及应用相关的分r生物技术，包括聚合酶链式反应技 术、基因重组技术、荧光原位杂交技术和生物信息学等技术，并对这些技术在污染物降解基因检测、筛选和克隆方 面的应用进行了阐述与探讨、 [关键词]分子生物技术;微生物;基因;环境污染物;降解 随着现代j:\地技术的发展，多环芳烃、含氯有 机物和硝基苯类化合物等人工合成井难以降解的 污染物大量排放，造成世界范围内的环境污染和生 态破坏，严重地威胁人类和其他生物的正常生存和 发展。利用微生物修复技术对受污染的水体及土 壤进行处理，凸显了其重要的意义和可行性。研究 人员发现并筛选到一些微生物，它们不仅对环境有 较高的适应性、对污染物有较高的耐受性，而且对 污染物有较强的降解效率和专一性。然而环境中 存在的大量微生物中仅有少于1%可通过传统的培 养方法进行培养、分离和纯化，绝大多数细菌需要 非常严格的营养条件川。因此，为了对修复环境有 所贡献却难以培养的微生物进行更全面了解，也为 了筛选到更多有利于降解环境污染物的微生物菌 种及其关键酶基因，分子生物技术和手段逐渐被广 泛应用到环境可降解污染物及降解机理方面的研 究中。 本文对近年来发展起来的聚合酶链式反应 (PCR)技术、基因重组技术、荧光原位杂交(FISH) 技术和生物信息学等多种分子生物技术进行了介 绍，并总结了它们在污染物降解基因检测、筛选和 克隆方面的应用。 1与环境污染物降解相关的分子生 物技术 及其相关技术 PCR是一种利用脱氧核糖核酸(DNA)半保留 复制原理，在体外扩增位于两段已知序列之间的 DNA区段从而得到大量拷贝的分子生物技术。根 据其模板、引物来源或扩增条件的不同，PcR技术 可分为以下几种:(l)反转录pCR(RT一PeR)技 术，将mRNA反转录为cDNA后再对其进行PCR 扩增，可用来构建cDNA文库，分析不同生长时期 的mRNA表达状况和相关性以及mRNA的定量测 定等;(2)巢式PCR技术，在扩增大片段目的DNA 时，先用非特意性引物扩增再用特意性引物对第一 次扩增产物进行第二次扩增，以获得可供分析的 DNA;(3)竞争PCR技术，是一种定量PCR，向PCR 反应体系中加人人工构建的带有突变的竞争模板， 通过控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度， 对目的模板作定量研究;(4)实时荧光定量PCR技 术，在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析，该法已广泛用于基因表 达研究、转基因研究等方面;(5)扩增的rDNA限制 酶切分析技术，根据原核生物rDNA序列的保守性， 将扩增的rDNA片段进行酶切，通过酶切图谱来分 析菌间的多样性;(6)RNA随机引导PCR技术，基 于任意寡核昔酸引物与RNA之间可能的配对，在 低严谨度条件下经聚合酶催化使链延伸，将细胞总 RNA或InRNA作为反转录反应的模板，此技术结 合单链构象多态性，用非变性胶分辨大小相同而构 象不同的片段，可用于诊断遗传突变及分析污染条 件下序列的多态性;(7)随机扩增多态DNA (RAPD)技术，是一种基于PCR检测PCR引物结合 位点序列改变的方法，通常以10bp的寡核昔酸序 列为引物，对基因组DNA随机扩增，电泳分离染色 扩‘增产物，再分析多态性。 技术 FISH技术利用荧光标记的探针在细胞内与特 异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光 来检测信号。荧光探针比放射性探针更安全，具有 较好的分辨力，不需要额外的检测步骤。近年来， 由于FISH技术具有灵敏、便捷等优点，迅速发展完 善成为研究环境微生物的有力工具。此外，可用不 同激发和散射波长的荧光染料标记探针，在一步反 应中同时检测几个靶序列。该技术主要包括试样 固定、预处理、预杂交、探针和试样变性、杂交、漂洗 去除未结合的探针、检测杂交信号等步骤。由于 165rRNA具有遗传稳定性，因此成为FISH技术检 测最常用的靶序列。 基因重组技术 基因重组技术是从供体生物的基因组中通过 酶切扩增等手段获取目的基因，与载体连接形成重 组DNA分子，再导入到受体细胞中，让外源基因得 以表达。在已经分离出的许多菌株中，与降解能力 有关的基因多在质粒体上。由于质粒很容易在细 菌的繁殖过程中遗失，对细菌降解能力的长期稳定 非常不利，可将其与污染物降解有关的酶基因重组 到大肠杆菌等微生物中进行表达，以此构建的各种 生物降解特性增强的重组菌可用于污染环境的治 理修复或发酵某些废弃物。 生物信息学 20世纪后期，生物学的迅猛发展，从数量上和 质量上极大地丰富了基因组数据库、蛋白质数据 库、酶数据库和文献数据库等许多生物科学的数据 资源。已有多个国家和国际科研组织建立了生物 信息数据库，如欧洲分子生物学实验室(Eur叩ean MolecularBiologyLaboratory)核酸序列数据库和美 国国家生物技术情报中心(Nationaleente:fo:Bio- technologyInformation，NCBI)基因序列数据库等。 科学家利用计算机及生物信息分析软件分析这些 数据资源，确定大分子序列、结构、表达模式和生化 途径与生物数据之间的关系，区分生物个体间遗传 差异，揭示DNA多样性。例如，基本局部比对搜索 工具(BasieLoealAlignmentSearehTool，BLAST)， 是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似 性比较的分析工具。它基于Altschul等的方法「2〕， 在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。 BLAST程序可对一条或多条、任何数量、任何形式的 序列在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对，甚 至将有缺口的比对序列也考虑在内，利用比较结果中 的得分对序列进行相似性说明。基因的序列分析可 揭示出生物物种之间的关系，在污染治理研究中可用 于生物基因组特殊区域或特异基因的测序。 2分子生物技术在环境污染物降解 中的应用 土壤试样总DNA的提取 用适当方法直接从土壤中提取DNA并纯化， 是从分子生物学角度对土壤微生物进行研究的前 提条件，而后可进行酶切、PCR扩增、核酸分子杂交 等分子生物学技术操作。从土壤中提取微生物 DNA主要分为汽接法和间接法}’{。直接法是在 ogram等的方法基础卜发展起来的，其主要包括2 个步骤:(l)原位细胞裂解;(2)DNA提取和纯化。 直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60%且省 力，但提取的DNA常常有折断、腐殖酸污染、甚至 提取物中还夹杂有未知的胞外DNA和真核生物的 DNA。最先报道间接法的是Faegri等[‘〕，其主要包 括4个步骤:(l)分散土壤;(2)分离细胞与土壤; (3)细胞裂解;(4)DNA纯化。间接法提取DNA 产量低且费力，但纯度较高、DNA损伤小，提取的 大片段DNA可用来构建cos而d和细菌人工染色体 文库等。 采用PCR及相关技术扩增分析DNA片段 可降解污染物的微生物必然能产生分解代谢 该污染物的酶。selvaratnam等L’l用编码苯酚单加 氧酶dmpN摹因的RT一PCR技术来检测序列间歇 式活性污泥反应器‘{一，降解酚的假单胞菌。检测结 果表明，RT一PCR技术不仅能检测微生物降解酚的 能力，还能测量dmpN基因的转录水平，从而确定假 单胞菌特殊的分解活性，发现了在转录水平下，酚 浓度与通气时间之问存在正相关关系。 将PCR技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)结 合起来，在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基 对，分辨率较高。染色后的凝胶用成像系统进行分 析，可在一定程度l几反应试样的复杂性。条带的多 少能反应试样「 一 }1微生物组成的差异，条带的亮度能 反应试样中微生物的多少。基于以上优点，日前该 技术在微生物群落结构的分析和动态研究方面得 到了厂‘泛应用。DGGE可通过分析PCR扩增的基 因点突变来探索微生物的复杂性。徐玉泉等[“〕从 某废水中分离出一株能以苯酚为惟一碳源的菌株 PHEA一2，使用PCR一DGGE技术对该菌165 rDNA进行分析，发现该菌与醋酸钙不动杆菌同源。 M盯sh等r了)利用PcR一DGGE技术获得了活性污泥 中真核微生物的种群变化情况。王峰等下8〕采用 PCR一DGGE技术对城市污水化学生物絮凝处理中 活性污泥和生物膜微生物种群结构进行了分析，结 果表明活性污泥培养前后微生物种群结构发生r 很大改变。 RAPD技术也是一种应用比较广泛的以多态性 引物来扩增某些片段的技术。RAPD技术可用于检 测含有混合微生物种群的各种微生物反应器中微 生物的多样性。用RAPD技术分析检测实验室规 模的油脂淤泥培养料中的细菌菌群发现，用油脂淤 泥改良过的培养料比未改良的更适于不同的微生 物种群生长[9j。vainio等t’。〕从516种孤立的菌落 中提取出165rDNA，经PCR扩增后进行测序，检测 活性污泥中微生物种群的结构。这些组合技术的 应用显著增强r对微生物的检测和鉴定能力，为理 论研究工艺优化及提高生物处理效率提供了条件。 基因重组 基因工程技术应用于环境保护起始于20世纪 80年代。其基本原理是通过基因分离和重组技术， 将目的基因片段，比如可编码降解某种污染物的 酶，转移到受体生物细胞中并表达，使受体生物具 有该目的基因表达显现的特殊性状，从而达到治理 污染的目的。找到特定污染的抗性基因，利用基因 重组技术转基因后也可获得其他抗性植株以及筛 选到可转化污染物的植物，还可开发超量积累植物 进行污染土壤的生物修复。 罗如新等L”〕用放射性同位素标记tfdc基因片 段作探针，Southemblot杂交定位Ll菌株的邻苯二 酚1，2一双加氧酶基因位于Pstl的I片段和BamH I的M、N片段，回收并将其直接克隆至表达载体 pKT230卜，获得的重组子能转化不具开环酶活性 的甲胺磷降解菌P2，得到高于天然宿主21倍的邻 苯二酚1，2一双加氧酶。stingley等{”〕通过构建基 因文库和重组质粒等基因工程方法证实了NidAB 双加氧酶是降解菲的关键酶类，并首次鉴定出此基 因通过磷苯二甲酸实现降解功能。chae等‘”}发现 不能降解苯酚的su如lobusso扣taricu、98/2菌株中 的儿茶酚2，3一双加氧酶基因与能降解苯酚的 sulfolo右u，，o如taricu、咫有[6J源区，分析得知它们 是山共同祖先进化而来。把儿茶酚2，3一双加氧酶 基因克隆到大肠杆菌中表达，可获得有较高降解活 性的双加氧酶。 重金属污染是环境污染的重要方面之一。随 着分子生物学技术的发展，越来越多的修复性蛋白 基因正被从植物、微生物和动物中陆续分离出来， 如汞离子还原酶基因、有机汞裂解酶基因、汞转运 蛋自基因、金属硫蛋白基因、植物络合素合成酶基 因、铁离子还原酶基因和锌转运蛋白基因L’‘〕。这些 基因通过基因工程的改造，重组到合适的受休细胞 中表达相应的蛋白质和酶，达到治理难以降解的有 毒有害污染物的目的。sorsa等〔”〕把MTS插人 LamB序列的153位点，在中表达MTs，解决 r细胞内MTs对金属离子有限的吸附能力。综L 所述，基因重组技术具有快速、高效的特性，已逐渐 成为环境生物技术的研究热点。 技术 FISH技术利用核糖体内长度适中(约1500bp)、 高度保守的165:RNA序列作为理想的基因分类靶 序列，其中使用的165:RNA寡核普酸探针一般是 进行了荧光标记的20bp左右特异性核昔酸片段， 利用该报告分子(如生物素、地高辛)与荧光素标记 的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测系 统对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 FISH技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分 布和原位生理学等信息。 硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧 菌，传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定 步骤，耗时长。HSH技术的引人解决了上述困难。 FlsH技术还被广泛用于活性污泥系统、硝化流化床 反应器和膜生物反应器等废水处理系统}’61。 基因工程微生物越来越多地被用于农业害虫 控制和环境污染的生物修复，对人类健康和环境的 影响引起广泛关注。1994年出现了一种新的标记 系统:绿色荧光蛋白(GFP)，由于GFP基因表达产 物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记 检测卜分方便、简单。在某些被污染的环境中可分 离出降解该污染物的细菌，通过基因重组等手段使 用GFP分子标记，可更容易的分离检测被标记的 细胞叫。 Bastes等[’8]进行了苯酚降解菌染色体GFP基 因标记实验。通过PCR和Southemblot分析，证明 GFP基因已成功整合到宿主细胞的染色体中。对 标记菌与野生型的降解能力比较结果证明，GFP分 子标记的插人并不影响细胞的苯酚降解能力。 用G即标记Pseudomonasputida，研究活性淤 泥中细菌存活情况{’9飞。Pseudomonasputida被转到 活性淤泥2min后，观察到细胞在淤泥絮凝物间自 由游动;培养3d后，发现荧光细胞减少，大部分已 被合并到淤泥絮凝物中，以防止细菌被原生动物捕 食。用oFP标记石.eozi和Serraliamarceseern，考 察菌株附到絮凝物卜的过程{’()j。使用表面荧光显 微镜能将带有GFP标记的细胞从活性污泥中区分 开，井进行观察和记数。而聚焦激光扫描显微镜 (cLsM)可使GFP标记细菌产生三维轮廓，结合表 面荧光显微镜和CLSM观察GFP标记细胞，结果表 明，细胞表面疏水性在细菌附到絮凝物的过程中起 重要作用，两种细菌附在絮凝物上的模式有很大不 同，通过这种方法可更好地理解细菌赫附机理，有 助于提高废水处理效果。 3结语 分子生物技术的应用使研究人员可从微观的 角度更细致深人地了解微生物对污染物降解的具 体生理生化机制，在分子水平 _ _ [揭示生物体吸收、 迁移、积累有害物质最终被毒害，及适应、抗性等生 态问题，从而筛选到更多有利用价值的微生物。随 着越来越多微生物全部基因序列的解码，对各种细 菌体内可降解基因的分布和表达会有更深人的了 解，有关技术的发展和成熟必将对污染物的降解过 程有一个整体的、生态水平上的认识。 参考文献 l李凤，刘世贵 . 分子生物学技术在环境微生物研究中的 应用 . 世界科技研究与发展，2003，25(4):88一92 2AltsehulSF，GishW，MillerW， mentsearehtool . 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在医学领域中，中药学是实践性很强的专业学科，不仅要求学生掌握扎实的理论知识，还要求学生具有较强的动手、分析和解决实际问题的能力。下面是我为大家整理的中药学 毕业 论文，供大家参考。
浅谈临床中药学的学科建设与人才培养
临床中药学是指在传统中医药理论的指导下，以患者为主体，研究中药或其制剂在人体内的作用及机制与临床用药的合理性、有效性、安全性评价及应用规律的综合性学科。近年来，随着西药临床药学在各医疗机构的深入，临床药学在不良反应监测、合理用药及作用机制研究等多方面显示出独特的优势。
但是，由于中药与西药在结构、配伍、功能主治等各个方面的巨大差异，西药临床药学在中成药、中草药方剂方面的应用捉襟见肘，故以传统中医药理论与临床药学为背景的临床中药学应运而生[1-3]。临床中药学作为一个新兴学科，其学科建设及人才培养等方面均处于摸索阶段，本单位于2015年成立临床中药学硕士招生点，且于当年成功招生，现对该学科的学科建设、人才培养的方案及 经验 做一归纳 总结 ，以供同仁参考引智。
1 培养对象及培养目标
与西药临床药学类似，临床中药学是以向医疗机构提供具有临床及科研能力的临床中药师为最终目标的学科，而为满足临床的需求，临床中药师需具有中医学、中药学及科研等多重 教育 背景及能力，故临床中药学的培养对象需至少具有中医学或中药学的本科教育背景，在培养过程中，需掌握为患者提供安全、有效、经济、合理化用药的 方法 与手段，并以在临床实践中发现中药问题、解决问题为最终培养目标[4-6]。
2 培养模式及培养方案
培养时限及安排
本学科的培养时限为3年(6学期)，第1学期于校本部完成理论课的学习，第2学期至第5学期于本单位着重进行临床实践及科研，第6学期完成学位论文及答辩，即“1+4+1”的培养模式。
培养方式
本学科由研究生导师、医院药学部门及行内专家组成导师组，对研究生进行指导及培养。自研究生入学始，导师组根据培养方案、课题背景及个人特点讨论并制定培养方案，并于研究生完成理论课学习后开始实施。研究生需定期向导师组汇报学习及课题进展情况，导师组对存在的问题进行指导或纠正，并组织专家进行开题、中期汇报、答辩等环节。
理论课培养方案
本学科的理论学习目标旨在思想政治端正的前提下，拥有基本的科研思路及专业理论知识，故将课程分为3种类型：公共必修课、专业必修课及专业选修课，见表1。公共必修课进行政治思想、自然辩证法及英语的学习;专业必修课进行科研思路及科研统计方法的培养;专业选修课则是根据研究方向的需求及个人兴趣，个性化地进行专业知识的储备(至少选修3门)。
值得一提的是，由于临床中药学正处于萌芽阶段，其课程类型并不丰富，无法满足各个研究方向对理论知识的摄取，故允许研究生于其他教育部直属院校修习相关专业选修课，成绩合格后，学分亦予以承认。此举不仅满足了各研究方向对理论知识的要求，更能促进该学科的迅速发展与完善。
临床实践培养方案
总体要求与目标 临床中药学是与临床医学密不可分的学科，故需本专业研究生亲身融入到临床工作中去，这是整个培养历程中的重头戏，故临床实践的总学程为24个月(4学期)，并坚持理论与实践相结合且着重实践的原则，以研究生毕业后具备临床中药学实践技能及自主解决中药学问题的能力为总体目标，参照西药的《住院药师规范化培训标准》进行临床实践培养，由导师及轮转科室的临床教师对研究生进行临床实践培养[7-9]。
实践内容与安排 本学科临床实践主要分为2个阶段，各阶段学程均为12个月。
(1)通科实践阶段
该阶段需研究生在医院药学部门各岗位轮转完成，其包括门诊药房、中草药房、病房药房、药库、药检室、制剂室等部门，旨在通过实践，熟悉并掌握临床中药师的主要职业技能。
①门诊药房培养方案 研究生于该岗位需掌握处方审核、调配及发药的基本技能;需熟悉药品不良反应呈报方法及流程与“精、麻、毒、放”等特殊药品的管理办法与流程;需了解“药品管理法”、“处方管理办法”等法律法规文件，中成药的用药特点及用药原则，特殊人群用药特点及用药原则。
②中草药房培养方案 研究生于该岗位需掌握中草药处方审核、调配及发药的基本技能;熟悉至少100种常用中药饮片的鉴别特点，特殊饮片的管理方法与流程;了解煎药规程、操作及设施维护，煎药成品的质量控制技术。于该岗位实习约3个月。
③病房药房培养方案 研究生于该岗位需掌握常用中成药的名称、功能主治、规格、用法用量、适应证、禁忌证、不良反应及注意事项，与审核医嘱、调配及发药的基本技能，“麻、精、毒、放”等特殊药品的管理办法;需熟悉药品不良反应关联性评价方法，特殊人群用药特点及用药原则，药房自动化设备的使用及维护，需了解病区基数药品的管理办法。于该岗位实习约3个月。
④药库培养方案 研究生于该岗位需掌握中药饮片的鉴别与保管方法，中成药采购、贮存工作流程和要求，特殊药品的贮存方法;需熟悉药品价格信息管理，医院药事制度及药品采购管理规程;需了解药物经济学基本知识。于该岗位实习约1个月。
⑤药检室培养方案 研究生于该岗位需掌握药品的质量管理方法及常用医院制剂检验方法;需熟悉药品质量控制工作的内容及流程，“药品管理法”及《中国药典》中关于药品质量检测的相关内容，需了解药品质量问题追踪流程与评估 报告 。于该岗位实习约1个月。
⑥ 制剂室培养方案 研究生于该岗位需熟悉中药煮提操作方法，中药前处理、提取、精制、制剂成型等技术;需了解中药材炮制方法，中药特色技术传承。于该岗位实习约1个月，需至少完成10个批次的制剂配制，需至少进行1次日常设配的维护。
(2)专科实践阶段
该阶段分别在临床中药学室与各临床科室完成，研究生通过在临床中药学室的学习，掌握临床中药师的基本工作流程与技能，再根据各导师的研究方向及课题背景，选择某个临床科室，进行较为深入的临床中药学专科实践。在导师与临床带教老师的指导下参与日常医疗活动，培养临床思维及处理临床中药问题的能力。
①临床中药学室培养方案 研究生于该岗位需掌握审核医嘱及干预技能，治疗药物监测数据分析与评估，提供个体化用药建议，中药的治疗原则或治疗指南，药物信息检索和评估，药物咨询，患者教育，药历书写，与医护患的沟通技能;需熟悉药学监护计划的制定与 实施方案 ，特殊人群用药特点及用药原则，临床中药学室工作内容和流程;需了解药学查房，临床会诊及病例讨论。
② 临床科室培养方案 根据导师的研究方向或临床需要，将研究生派往相关临床科室，通过与医生、护士、患者的交流，发现及解决临床中的中药问题，在具体的临床实践中提高对临床中药学知识与技能的运用能力，同时通过专业化中药学服务，规范临床用药，促进医生与患者安全、有效、经济、合理地用药。
科研培养方案
研究生在导师的指导下，根据研究方向及课题背景，自主查阅文献资料，结合临床中药问题，确定选题，撰写开题报告及文献综述。于第三至第四学期在学院内进行开题考核，考核专家小组主要就研究课题的科学性、可行性及临床实用价值三方面进行评议。
根据考核专家小组的意见，进一步修改选题内容并制定详细的科研计划后，深入基层现场和中药学工作第一线，围绕中药临床应用研究与评价、个体化用药与实践、药物安全性与用药安全等方面展开研究，最终获得具有科学性、严谨性和一定实际参考价值的结论或解决方案，并撰写毕业论文。
3 思考与设想
学科建设与人才培养之间的关系相辅相成，它们均以“人”作为主体，学科建设的最终目的即为培养人才，培养出的人才更能推动该学科的迅猛发展[10-12]，对于临床中药学这一新兴学科更是如此。该学科的建设始终是以向医疗机构提供临床中药师作为出发点及最终目标，只有专业人才的输出与配置，才能真正规范临床合理用药，而临床中药师在临床实践及对研究生的“帮、传、带”中，又可促进该学科向规范化、合理化发展。就本单位对该学科的建设方案，提出以下几点思考与设想。
整合教学资源，扩大培养规模
诚然，临床中药学这一学科现阶段正处于摸索阶段，缺乏公认的、规范化的人才培养流程，故在本阶段的第一要务即为整合现有的全部临床、教学、科研资源，努力为研究生提供一个丰富、正规、严谨的培养环境，供其在学有所专、学有所长的基础上，开拓眼界，无缝接轨临床。第二方面，各医科院校应开设临床中药学专业，扩大招生份额，使本专业的人才数量呈梯度增长，以免出现人才断层。第三方面，应加速学科带头人的选拔与培养，发挥“领头羊”的作用，在个别单位形成优势学科，迅速推动该学科的建设。
政策适度支持，规范培养模式
作为一个新兴学科，没有政府卫生部门及各医疗单位的支持会举步维艰，而临床中药学能够促进临床安全、有效、经济、合理用药是有目共睹的，故望决策者们加大对该学科的建设，以促进其快速发展[13-15]。另一方面，临床中药学应参照西药临床药学的培养模式，于较有专业实力的三甲医院设立临床中药师培训基地，选拔各基层单位的中药师进行为期1年的规范化培训，结业后对考核合格者颁发临床中药师证书，以规范各单位的临床中药学工作。此外，还应大力开展各种在职培训及继续教育，这一方面可以迅速扩大临床中药学的培训范围，另一方面也促进了各单位中药师的技能提高及专业延伸。
吸纳多学科知识经验，发挥中医药独特优势
临床中药学本属一交叉学科，是中医学、中药学、西药临床药学、循证医学及临床科研等多学科结合的产物，故该学科的建设不应仅局限在现有师资的教学上，应根据不同研究方向的特点，制定个性化的培养方案，充分汲取其他学科优势，同时也丰富了本学科的内容与深度，本单位的理论课跨校选课即是在此方面的一大突破!
当然，临床中药学的立身之本乃传统中医药理论，故在学科建设与人才培养方面不能完全套用西药临床药学的培养模式，该学科必须依据传统中医药理论，发挥中医药的特点，围绕中成药配伍、中西药复方制剂与中西药配伍、中草药剂量与煎服法、不良反应监测、临床用药咨询及中药宣传与教育等方面开展工作，并以临床用药咨询、中成药处方点评为切入点，规范医护患安全、有效、经济、合理地使用中药。
结语
诚然，本单位于2015年刚刚开展临床中药学的学科建设与人才培养，其各个方面的建设均在摸索，恰恰与临床中药学在国内的现状相一致，但我们相信，通过大家不断的探索、挑战与尝试，最终会摸索出一条适合临床中药学快速发展的特色之路;临床中药师也会随着在临床的发光发热得到医生、护士、患者的信赖与支持!望同仁们共同努力，共铸临床中药学明日之辉煌!
浅谈中药学发展的前景
继承和发展是前提，发展是最好的继承，中药学发展离不开中西医药学结合。然而，无论是中药学发展还是中西医药学结合，在当前都还存在一些令人困惑不解的问题。其中既有理解的问题，也关系到科学观念的转变。现以中药学科学探讨对此问题作如下探讨。
1中药学现代研究的困惑与思考
中药西药化
以往所进行的中药学科学研究，大多探讨的都是中药西药化。因为无论它们是怎样表述的，其核心都是从现有的中药中寻找、分离及提纯所谓的“有效成分”或化学单体，其针对的大多都是西医学的疾病，而这不正是西药的发展历程吗?如青蒿素、黄连素等，大都失去了中医药学理论的表述和应用原则，我国《药典》也已将它们归入西药收载。中药西药化也许是新西药发现或创制的一条捷径，然而，其作为中药发展之路尚有明显的不足之处。其一，从已有的中药西药化的结果来看，其虽然有成功的范例，但与整个中药的数量比较就显得非常之少。其二，从西药目前的发展状况来看，现代西药的发展本身就似乎陷入了一个走不出的“迷宫”。鉴于已有药物的临床毒副作用和病原耐药性等问题，人们忍痛地否定了一批又一批药物的使用价值，不断寻求合成新的药物。
中西药合用
中西药合用最早可以追溯到张锡纯的《医学衷中参西录》。由于中药辨证与西药辨病治疗侧重和经验积累的不同，使中西药合用在很多情况下都收到了好于单纯中药或西药的临床疗效。然而，由于中西药分属于两个不同的医学理论体系，其临床适应症也各有不同，在没有合适的结合理论指导的前提下，尤其是在当今西医药学理论愈来愈强势，中医药学理论愈来愈弱化的条件下将它们合用，不仅难免发生用药理论和方法上的牵强附会与偏差，而且亦会常常影响它们的临床疗效，甚或导致严重的临床毒副反应发生。
2中医药学科特点认识
整体大于部分之和
“整体大于部分之和”是古希腊的一个哲学观念。然而，由于在“单因素线性分析” 上所取得的卓越成就，现代医药学乃至整个现代科学都将这一点忽略了。如现代医药学不仅注重对疾病发生的每一种因素的单独认识与把握，其虽然也用复方，或在处方中也常有两种以上的药物使用，但多是针对不同“病因”而各自为战的大拼盘;其也重视药物之间的相互作用，但其多局限于两种药物之间。而中医药学辨证施治不仅在诊断上强调要“四诊合参”，形成一个整体“证候”，而且在治疗上，也是采用君臣佐使理论将其多味中药组成为一个整体处方来进行试验与观察的。如研究发现，龙胆泻肝汤与关木通加六味地黄丸及关木通加滋阴药的配伍，能显著减少其煎液中的马兜铃酸A含量;关木通加利水药与关木通加清热药，其煎液中的马兜铃酸A含量减少不显著;而关木通加甘草与关木通加附子，均可显著地增加其煎液中的马兜铃酸A含量。关木通经过炒焦、与滑石粉炒和与麦麸炒后，其煎液中的马兜铃酸A含量均有显著性降低(P<)[1]。当代名医用附子，李可最大量一昼夜达600克，祝味菊最大量在45克，姜春华用9克，而李翰卿则用克治愈过心衰的患者，其间最大相差达到2000倍，而都取得了“起沉疴”的临床疗效[2]。这用传统科学的理念是无法理解的，对此应该引起我们足够的重视。
整体并不等于宏观
整体观念是中医药学的一大优势，但整体并不等于宏观。后者只是对宏观规律的认识与把握，前者则强调事物之间的相互联系与相互作用。由于事物之间的相互联系与相互作用，使整体具有了“非线性”与“整体大于部分之和”等复杂性科学的特点;从而使其整体的特性不仅取决于其物质的构成，而且更是由物质之间的关系与构成方式来决定的。如“蝴蝶效应”只能在特定的复杂气象条件下产生;由于中药的配伍、剂量与炮制等不同，使其处方的作用有很大区别等等。那么，中药学发展不仅要重视其有效成分等物质性研究，更不能忽视对其复方配伍、炮制及其临床辨证施治规律等的认识。中药的疗效与毒性，既不能唯成分而论，也不能简单地依据剂量的大小来确定;而是要综合考虑其辨证施治、处方配伍与药材炮制等诸多因素。
整体认识需要微观化但必须转变科学观念
整体认识不仅需要微观化，而且可以随着认识方法与观察指标的微观化而微观化，只是要以复杂性科学的观念为指导。这是因为：(1)证候状态的认识、分析与处理，不断需要新指标、新方法与新药物来提高、发展与丰富其水平、能力与手段。如有人将显微镜(及电子显微镜、X光、B超等)称为“放大眼”，把听诊器等叫做“放大耳”，它使我们看到和听到了以往未能见到的现象。再如温病学向称湿温缠绵难愈，因湿邪重着黏腻，湿与热合，如油入面;但诸如肠伤寒、钩端螺旋体病、布鲁氏杆菌病等湿温类温病，今天已知并非“缠绵难愈”，因为用特效抗生素治疗，多能迅速遏制病情[3]。(2)中医药学的辨证施治或对证候状态的认识、分析与处理，虽然说传统上以宏观指标与天然的动植物药物为主;但其并不是一成不变的，而且每一次随着新指标、新药物与新方法的引进，都给其临床疗效与辨证施治规律的认识带来了飞跃与发展。中医药学现代研究既要重视对每一种因素、每一种药物甚或单体物质的作用特点与规律的认识，更不能忽视对中药复方综合作用、处方配伍、剂量与炮制，尤其是其临床辨证施治规律的研究;并在新的历史条件下，在不断引进新指标、新药物与新方法的基础上，总结出新的辨证施治(证候状态分析与处理)规律，以更好地丰富与发展中医药学。
“做古生物研究，特别要坐得住冷板凳。”中科院南京地质古生物研究所研究员殷宗军说。十多年来，他始终专注于这个冷门学科，希望揭开化石背后隐藏的动物演化 历史 。这份坚持源于热爱，也来自于科研的进展、院所的支持。
一个个直径1毫米左右的微小化石，被小心翼翼地从岩石中分离出来后，放到显微镜下，使用超高分辨率X射线显微断层成像技术进行三维扫描，化石的立体结构就在显示仪上得以重构。在此基础上进行分析，就可以揭开化石背后隐藏的动物演化 历史 。
这是中科院南京地质古生物研究所研究员殷宗军每天的工作。这位35岁青年科学家领导的研究团队，采用最新三维无损成像技术，扫描了300多个旋孔虫化石标本，显示旋孔虫的内部存在细胞分裂现象——这种发育方式，与动物胚胎早期发育非常类似。“6亿年前的瓮安旋孔虫，是现代动物的远古近亲。”近期，他在《科学》杂志子刊《科学进展》发表的一篇论文中，给出了这样的结论。
“这是我对‘达尔文之困’的一个初步回答。”殷宗军说。个头不高、思维活跃、语速极快，卫衣上印着“自律给我自由”，像极了他一贯的行事风格。十多年来，这项研究和他的梦想，从未停止。
热爱，执着于动物起源之谜
2006年，中国地质大学（武汉）大三学生殷宗军放弃本校的研究生保送资格，选择了考研——向中科院南京地质古生物研究所这个全国古生物研究高地发起冲击。
为什么有这样大的决心？这和他为自己定下的研究道路有关。殷宗军从小生长在大别山区，姐姐送给他一套《小学生自然百科》，“这套书共6本，我最喜欢《地学》和《动物》，一个讲了地球上的岩石矿物、名山大川，一个从远古动物讲到人类诞生。我爱不释手，书很快就翻烂了。”殷宗军说。
地学与动物学交叉，不就是古生物学吗？许多年后回头看，他意识到，科学的种子在那时就已悄悄种在了心间。
考大学时，殷宗军填报了地质学专业。师兄师姐说，地质学这个专业的本科毕业生最吃香、有“钱途”，反而是往上读古生物学的硕士、博士，越来越冷门。但殷宗军却早早决定要读研。他在课堂上了解到，达尔文曾提到一个挑战进化论的难题：绝大多数现代高等动物的祖先，在亿到亿年前的寒武纪早期，以大爆发的形式突然出现在地层中，这一现象后世称之为“寒武纪生命大爆发”；而寒武纪之前地球的漫长 历史 中，却缺乏与动物相关的化石记录。
对此，达尔文的解释是化石记录保存的不完整性，寒武纪之前的动物可能没有留下化石记录。这个解释在此后100多年里引起了很大争议，被称为“达尔文之困”。“100多年过去了，‘达尔文之困’怎么还是个谜？”殷宗军给自己定下的目标就是，当科学家，探究知识的边界。
钻研，探究微小化石里的生物密码
带着追问，殷宗军来到南古所进行毕业设计。他选择的目标是瓮安生物群。
瓮安生物群，主产于贵州瓮安北斗山含磷地层，以磷酸盐化方式保存着6亿年前的化石，诞生于寒武纪大爆发以前。因此，这座可能保存了全世界最古老动物的化石库，被学界视为“动物世界的黎明”。
“2006年夏天，我从北斗山采了几百斤石头，打包发往南京，大海捞针一样寻找化石。”殷宗军记忆中，那个夏天非常炎热，他先用化学方法将几百斤石头融化，再在残渣中一点一点寻找化石，用显微镜观察。因为怕石头残渣被风吹散，也不敢开电扇。
终于，殷宗军找到了大量从未见过的化石。其中有一种化石十分特别，直径只有不到1毫米、外形很像现代动物胚胎、表面上长着螺旋状线圈，这就是后来被称为“瓮安旋孔虫”的化石。
通过显微镜和扫描电镜，观察分析新发现化石的形态学结构，对完成毕业论文来说就足够了。但神秘化石内部是什么结构？它们究竟是动物、植物，还是藻类？这些还需要深入研究。
“我想从事感兴趣的研究，只有一条路走到底。”殷宗军说。硕士二年级时，他接受遴选并获得了直接攻读博士学位的机会。
这些化石标本非常微小，当时最薄的刀片都比它们厚。想要重现内部结构，就要采用医院里CT扫描仪那样的专业设备。当时，欧洲拥有世界上最先进的同步辐射加速器，能扫描微米级别的物体内部结构。读博阶段，殷宗军申请到法国留学，带着几千枚样本，去探究小小化石中的生物密码。
但即便有了设备，“做CT”也不是易事。这种大型科学装置并非为扫描微体化石量身定制，因此用来给微体化石“做CT”时，扫描方法和诸多参数都要反复摸索和调整。例如光源设定，太弱了信号穿不透，太强了则易过曝。
“学习了几个月，才掌握扫描技术。遗憾的是，瓮安旋孔虫化石有很厚的囊包，内部结构大多已经腐烂，所有样本都没有扫描到内部结构，也就无从了解它究竟是什么。”好在留学期间殷宗军还有其他收获：通过扫描带来的其他样本，发现了最早的海绵动物、最早的胚胎化石……
这些研究，离回答“达尔文之困”还有一段距离。“我们不能每次都千里迢迢跑到欧洲，用别人的机器去扫描化石。”殷宗军开始思考，要有先进技术，让自己的团队来给化石“做CT”。
创新，让前沿技术助力古老学科
把先进的同步辐射加速器“搬”回来，并不现实。没别的路，只能依靠创新。
在南古所支持下，2012年博士毕业留所后，殷宗军着手建立化石显微CT实验室，并于2015年建成。走进这个实验室，仪器设备一应俱全：硬件上，有“CT机”、显微镜、图形工作站、数位屏；软件上，有各类专业的图像数据处理和三维可视化工具。它不仅用于瓮安生物群化石的研究，也支撑了琥珀中昆虫多样性、森林的起源等古生物学其他课题的研究。
“这个实验室有原始创新，也有集成创新。”殷宗军介绍，正在申请专利的多样本扫描技术就是一项自主创新。“人工将样本逐个放到样品台上扫描，费时耗力，如果能实现自动化不间断扫描，就可以帮助科研人员腾出手，大幅提高设备利用效率。”殷宗军说，前沿信息技术与这门古老学科可以碰撞出火花。他通过软件设定参数和程序，让样品台不仅“知道”每个样本的扫描时间和方式，还可以“找到”排着队的下一个样本，并且将它“请上台”。
去年6月，瓮安旋孔虫化石研究有了突破性进展，经过对化石内部结构和生物学信息的分析，证实了它们是单细胞生命，属于动物的“姐妹类群”，据此可以了解动物共同祖先的生物学信息，这对理解第一个动物究竟从何而来，提供了重要化石信息。
“做古生物研究，特别要坐得住冷板凳。我之所以能坚持下来，除了自身的热爱，也在于院所的无条件支持，以及研究过程中的一项项进展，让年轻科学家在起步阶段就可以大展拳脚，品尝到成功的喜悦。”殷宗军说，动物演化的真相正在逐渐显现，“达尔文之困”终有一天会彻底解开。
我认为确实是这样的一个现象，因为在眼睛里面配眼镜的话确实是比较坑人的，可能这个眼睛的成本特别的低，但是最后要几百元或者是要上千元，那眼镜店肯定是非常挣钱的。
现在去网上配眼镜的人也太多了。
大家都觉得网上配眼镜，不仅方便，有一张验光单就能配，而且超级便宜。
但是，很多人都不知道，网上配眼镜真的 ——
特别容易踩坑！
你以为省心省力了，其实可能后患无穷......
图片来源：研究所留言区
这样配出来的眼镜，可能让你的眼睛状况越来越糟糕！
今天，我们就和验光师、眼科医生，一起来扒一扒配眼镜最容易踩的三大坑。
不想让眼睛受罪，这篇文章真的要先收藏！马住！
第一大坑：
机打验光单配眼镜
度数容易不准确
准确的度数，是配眼镜的重要前提。
配眼镜的度数应该由三张单子构成：机打验光单、验光处方单和配镜处方单。
所以只有机打验光单，是不能用来配眼镜的！
通常情况下机打验光单长这样
R 右眼 - L 左眼 - S 近视（带负号）远视（带正号）- C 散光度数（默认为负值）- A 散光轴位 - PD 瞳距 - . 等效球镜度数
图片来源：自己拍的
由于每个人的眼睛都有调节能力的差异，配合度也不同，光凭机器测量，大概率导致度数的偏差。
比如有些小伙伴，验光前会一直刷手机，造成用眼疲劳，就可能导致验光结果的近视度数偏高。
所以，拿这样不确定因素较多的度数，去网上配眼镜，眼镜度数就很容易偏高或不准确。
也就是大家会感觉到的头晕，看近处无法长时间集中注意力的原因之一。
严重的甚至会导致眼睛疲劳、酸胀等症状。
图片来源：研究所留言区
如果要测出眼睛的真实度数，你需要的应该是一张验光处方单。
但是，一定要避开第二大坑。
第二大坑：
把验光处方
当做配镜处方
想要配眼镜，首先要知道眼睛的真实度数。
然后验光师会根据这个度数，结合你的个人情况，开出一份配镜处方单。
前者是实际情况，后者是私人订制，不是一回事儿。
这时候需要综合验光仪、你、验光师的三方努力。
综合验光仪
图片来源：作者
验光师一般会要求你额头紧紧贴在这个仪器上，然后调出各种画面，问你：
「这样清楚吗？」
「现在清楚吗？」
「左边清楚还是右边清楚？」
稍微没啥耐心的人可能就会被问烦了。
但其实，你和验光师的沟通配合非常重要！
验光师的专业判断，和你配合的程度，影响最终测出来的度数是否准确。
图片来源：站酷海洛
比如，能让眼睛放松的雾视技术。
一般会让你盯着模糊的视力表，再逐渐调节清晰，达到放松眼部调节的效果，避免度数配高了。
让近视度数检测更精准的方法之一，红绿视标（左），判断散光所使用的蜂窝视标（右）。
图片来源：作者
在验光过程中，验光师会反复调整度数镜片，根据你反馈的清晰程度，对度数进行精调。
偏振视标，用来测双眼平衡。
图片来源：作者
还有特别重要的一步，视力平衡。
很多小伙伴戴上新眼镜就不会走路了，总觉得有一只眼比较涨，可能就是因为左右眼的视力平衡没调好。
一整套验光流程下来，得费好一会儿功夫。（文末有验光流程表，可以先收藏）
最终的数据，经过验光师的判断，才能形成一张验光处方单。
图片来源：自己拍的
拿到验光处方单，不是按照上面的度数配就完事儿了。
在线下的配镜流程中，专业的验光师还对个体差异、用眼环境、视力需求等多方面进行确认。
比如，你是写字、刷手机多，还是走路、开车多......
每个情景对眼睛视力的要求都不一样，有时候不需要那么清晰，有时候要非常清晰。
确认这些信息后，验光师才会在验光数据的基础上，开出一份配镜处方单。
这样配出来的眼镜才能达到舒适、持久、清晰的标准。
而这一点，网上配眼镜是做不到的。
图片来源：站酷海洛
有的小伙伴可能觉得反正差得也不多，戴几天就习惯了。
这里不得不分享一个血泪经验。
在进行正经验光之前，我一直以为自己的度数是 375 度。
后来才发现，原来是我的真实度数是 275 度！
左：375 度，右：275 度，足足高了 100 度，我的眼睛这些年居然受了这么大的委屈！
图片来源：自己拍的
有小伙伴一个鲤鱼打挺坐起来了，现在就想去验个光。
别急，验光完不试戴，也不行！
第三大坑：
配眼镜不试戴
真的浪费钱
买衣服还要试试才知道呢。
想要配到合适的眼镜度数，更要试戴！试戴！试戴！
只有试戴了你才会发现，这个度数的眼镜戴上舒不舒服，适不适合自己。
图片来源：站酷海洛
试戴时间也最好在十分钟以上，要尽可能多的模拟日常生活场景。
比如上下楼梯、蹲下起立、刷刷手机等等，远处近处都要多看看！
如果不舒服，验光师会现场给你调整，一直到你觉得 ok。
万一配好还是不舒服，一些大型连锁眼镜店还会帮你重新配镜。
但是网上配眼镜，是不会提供试戴服务的！眼镜一旦配好就是不退不换。
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如果配出来的眼镜你觉得不舒服，客服只会告诉你：
新眼镜都是这样的，习惯就好了。
这句话是非常不负责任的！
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的确，我们的眼睛有一定容错率。
一点小差错，时间久了可能真的就感觉不出来了。
但是大家有没有想过，我们配眼镜的目的，就是为了看东西不费力，减少用眼疲劳。
让眼睛反过来去适应不适合的眼镜，不就本末倒置了吗！？
更何况每个人眼睛的容错率有高有低，年龄大的人更是经不起折腾。
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从短期来看，好像除了眼睛偶尔有点酸胀，就没什么了。
但是长此以往，视力下降，视功能越来越差，那可都是难以逆转的损失！
我们以为网上配眼镜，不会被坑钱，没想到最后被坑的可能是自己的健康。
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说到这里，有些小伙伴可能委屈得要哭了，一开始也没人说这事儿啊？
的确，并不是咱不爱惜自己，也不是我们不谨慎，而是很多网店打定了浑水摸鱼的心思！
有些网店
存心误导消费者！
为了顺应大家怕麻烦的心理，有些网店把配眼镜这件事宣传得极其简单 ——
管你怎么验光的呢，瞳距瞳高都不问你要，提供度数，就能配了。
有些甚至告诉你，不验光也行，把旧眼镜寄过去就能配了......
对于大部分日常用眼较多，有视力波动或眼部不适的人来说，这种配镜方法真的是在害人！
你们怎么敢的啊！
图片来源：网络
这样配出来眼镜，合不合适全靠运气！就是在用消费者的眼睛去赌博！
万一配出来的眼镜不合适，都没办法确认，到底是哪个环节出了问题。
还要投入更多时间成本和精力成本去扯皮。天理何在！？
图片来源：网络
再唠叨一句，配眼镜真的不像看尺码买衣服那么简单。
甚至在很多地方，眼镜都被视作一种医疗器械，验光更是医疗业，而不是服务业。
网上配镜如此不负责任，还是因为他们吃定了咱不知道、不了解。
所以说，真的应该把这篇内容转发给更多人。
咱们最起码要掌握一些配镜的常识和流程，才能在关键时刻避免被忽悠！
配眼镜 Tips
➊ 如果你想去实体店配眼镜，可以挑选知名度高的大型连锁店，或者视光中心。
➋ 如果你想去医院配眼镜，可以挑选有眼科优势的医院。
➌ 如果你想省点儿钱，可以在网上买镜框，再去连锁店、视光中心进行验光、配镜。
➍ 如果你近期无用眼不适，验光后度数与旧镜无变化，也有试戴过合适的镜框，实在想在网上配，也行。
➎ 如果你是儿童青少年，或者度数存在波动的成年人、平常工作用眼强度大、眼睛容易感到不适，就老老实实在线下配吧！
最后唠叨一句，这些建议只能让大家尽可能少被糊弄，具体情况真需要咱多长个心眼。
我们还整理了一份验光流程表，大家赶紧 ——
收藏！收藏！收藏！
图片来源：丁香生活研究所
顺便快把这篇内容转发到朋友圈，让更多人知道配眼镜真不是件小事儿。
只有大家都重视起来，拒绝被无良网店糊弄，才能倒逼这些从业者规范起来。
如果大家还有配眼镜的其他疑问，可以点赞 人数足够多的话，我们就再整理一篇。
科学审核祝冬强
内容策划煮碗鱼
参考文献
[1] 李岩, 魏航. 电脑验光, 检影验光以及综合验光仪主觉验光在眼科临床应用的差异比较[J]. 中国眼镜科技杂志, 2013 (1): 131-133.
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[3] 徐常山, 梅小飞. 成人近视不同验光方法的差异和相关因素分析[J]. 临床医药文献杂志 (电子版), 2017, 4(32): 6261-6261.
[4] 褚仁远, 瞿小妹. 医学验光的含义和实施[J]. 眼视光学杂志, 2002, 4(2): 116-117.
监制Emma
拍摄金鑫
封面图来源站酷海洛
眼镜店坑的话，那医院都不知道叫啥了，一毛钱的折扣都没有，有的人还不知道自己花那么多钱到底配了个什么在医院，如果去到不错的眼镜店，人家不仅会给你讲清楚花钱买的什么样的东西，而且还有折扣，配下来价位还低，比医院要便宜好多，所以其实找到好的专业的眼镜店配镜性价比是很高的。
只要是取得了工商营业执照和卫生许可证的眼镜店配镜都靠谱。因为，眼镜店在申请工商营业执照和卫生许可证时，工商、质检、技监和卫生等部门均要对其进行严格的审查，合格后才能取证营业。现在这个行业慢慢的更加专业化和规范化，所以正规的连锁眼镜店挺靠谱的。现在仍有不少人认为配眼镜只需要验光就可以，实际上，对眼睛做全面的视觉功能检查是配眼镜注意事项重要的一个步骤。合格的眼镜店里除了应有合格的验光仪、镜片箱、检影镜等硬件外，最关键的是配镜人员的技术水平和素质。质量不合格的眼镜不但起不到矫正视力的作用，可能还会对眼睛造成伤害。下面就让我们一起来看看。一：配镜应去正规医院或信誉好的眼镜店。切忌图便宜或省事，要查看眼镜企业是否取得了眼镜产品生产许可证；眼镜企业的验光设备和检测仪器是否有合格标记；验光、制作人员是否持证上岗；眼镜有无合格标识(证)。眼镜企业的“四证”，是保证配镜质量的前提。二：配制眼镜必须经过验光、试戴等程序。按医生要求，必要时应做散瞳验光，特别是未成年人和初次配镜者。验光后，要索取验光单。因验光易受情绪、身体状况的影响，故应在数天内经过两次验光，以达到科学准确的验光结果。三：注意眼镜的材质选择。一般眼镜片分为树脂、玻璃和水晶等几种，镜片和镜框都应有保质期。镜片、镜框、镜架如果是进口材料，应有进口商检证书。树脂镜片因为具备重量轻等优点，很受学生欢迎，但是保养要求也比较高。如温度超过60摄氏度，高温下由于各层的膨胀率不同，镜片就会有一定损坏，进而变得模糊，其耐磨系数也明显低于玻璃镜，所以消费者平时佩戴时要注意对镜片的保护。如果想投资开眼镜店创业的话，在资金预算方面要提前预计好，一个多少平方米的眼镜店需要大概多少的资金量才够，同时，还需要预算到自己这个店铺的一个租金、日常花费等核算进去，最大限度的给予自己最大的资金周转空间。【点击了解更多加盟项目】