研究生论文多少钱？研究生写论文是在研究生毕业的时候，要自己都要写论文的论文部分多少钱一斤的部分多少钱研究生的论文是没有价值价钱的，是无价之宝
这个还要买？你是不是没有做研究啊？做了的话怎么会写不出来？
第一章。山西财经大学硕士毕业论文要求字数3万一般字数是指正文字数，即第一章到最后一章，不含摘要、目录、致谢、参考文献、附录等，说的是字数而不是字符数，比如3万字毕业论文，就是3万字的汉字，不包括标点和空格。
这些全包括，但是不包括目录和附注，希望可以帮到你。1、论文题目：要求准确、简练、醒目、新颖。2、目录：目录是论文中主要段落的简表。（短篇论文不必列目录）3、提要：是文章主要内容的摘录，要求短、精、完整。字数少可几十字，多不超过三百字为宜。4、关键词或主题词：关键词是从论文的题名、提要和正文中选取出来的，是对表述论文的中心内容有实质意义的词汇。关键词是用作机系统标引论文内容特征的词语，便于信息系统汇集，以供读者检索。每篇论文一般选取3-8个词汇作为关键词，另起一行，排在“提要”的左下方。主题词是经过规范化的词，在确定主题词时，要对论文进行主题，依照标引和组配规则转换成主题词表中的规范词语。5、论文正文：（1）引言：引言又称前言、序言和导言，用在论文的开头。引言一般要概括地写出作者意图，说明选题的目的和意义,并指出论文写作的范围。引言要短小精悍、紧扣主题。〈2）论文正文：正文是论文的主体，正文应包括论点、论据、论证过程和结论。主体部分包括以下内容：a.提出-论点；b.分析问题-论据和论证；c.解决问题-论证与步骤；d.结论。6、一篇论文的参考文献是将论文在和写作中可参考或引证的主要文献资料，列于论文的末尾。参考文献应另起一页，标注方式按《gb7714-87文后参考文献著录规则》进行。中文：标题--作者--出版物信息（版地、版者、版期）：作者--标题--出版物信息所列参考文献的要求是：（1）所列参考文献应是正式出版物，以便读者考证。（2）所列举的参考文献要标明序号、著作或文章的标题、作者、出版物信息。
发表一篇论文的价格费用高低跟四个要素有关系，一个是期刊的级别，一个是论文的版面字数，还有一个论文发表的时间以及查重费用这几者构成了研究生发表论文的费用。
期刊费用
（一）、发表期刊的级别影响费用
1、省级期刊费用一般在600-1500元一个版面。
2、国家级期刊自己投稿费用一般在1200-2000元一个版面，如果是特殊的发表形式，比如法律或医学类型的期刊，相对会贵一些。根据不同要求去发表，价格最高的上万元甚至是更多都会有的。
3、普通学报费用在1000元左右一个版面
4、国内核心期刊费用几千甚至上万元不等，C刊发表的费用跟期刊的类别都有很大的关系，如果你们单位指的C刊是核心的话那费用多在3-5万元不等，也有一些需要数十万元的费用。
5、一般SCI论文的版面费在1000-1500美元左右，换算成人民币的话就是7000-10000人民币左右，但是也有少数期刊的版面费非常高，达到15000元以上。而且论文还需要请专业机构润色，一般润色费用大约2000-3000元。
（二）、论文字符
论文字符数越多，所占版面越多，价格越高。这2年国家大力整顿学术界，各大杂志社纷纷整改，字符数也比原来的增加了。
1、省级、国家级刊物对论文字符数要求3000-5000字左右
2、普通学报对论文字符数要求在5000-8000
3、核心期刊对论文要求8000以上。
（三）、出刊时间影响费用
按照正常刊期发表，费用最低，加急的时间越快，费用越高。
（四）、选择投稿方式不同，价格也不一样
自己投稿和选择代发机构帮忙投稿，价格也不同。在投稿过程中有特殊要求的话，价格也会提升。想要将发表价格控制在最低，可以选择自己投稿的方式，可以省去一部分的中间费用。
2-3万字。右江医学院临床专硕医学研究生毕业论文字数并没有明确的上限，会根据每个学校的学科规定，有个比较低的字数限定，通常对于临床医学硕士生的论文字数一般要在2-3万字。
中 国 医 科 大 学 文 件�医大校发〔1997〕研字9号�中国医科大学研究生奖学金管理办法(试行)为保证研究生本人基本生活需要，鼓励研究生在学期间勤奋学习、全面发展，依据国家教委、财政部教财〔1994〕50号文件及卫生部司(局)文件卫科教高函发〔1997〕35号文件的精神，特制定《中国医科大学研究生奖学金管理办法》。�第一条 享受奖学金的条件�1�凡国家计划内统招研究生均享受奖学金待遇。�2�热爱党、热爱社会主义祖国，拥护党的领导。�3�遵守国家有关法律和学校有关规章制度。�4�勤奋学习，努力掌握专业知识，各门课程学习成绩合格。�第二条 奖学金的标准�1�博士研究生�(1)入学前没有参加过实际工作(指应届毕业生及其他非在职人员，下同)和参加实际工作不满两年者，每生每月200元人民币。�(2)入学前为国家正式职工，大学毕业后参加实际工作累计时间满两年以上者，每生每月220元；大学毕业后参加实际工作累计时间满四年以上者，每生每月240元人民币。�2�硕士研究生�(1)入学前没有参加实际工作和参加实际工作累计时间不满两年者，每生每月160元人民币。(2)入学前为国家正式职工，大学毕业后参加实际工作累计时间满两年以上者，每生每月180元；大学毕业后参加实际工作累计时间满四年以上者，每生每月200元人民币。�第三条 有下列情况之一者，减发或停发奖学金�1�违反校规、校纪，情节较轻，受到警告、严重警告处分者，减发奖学金1～2个月。�2�受学校记过(含记过)纪律处分者，视其情节轻重，停发奖学金1～6个月。3�受留校察看处分者，察看期间停发奖学金。�4�学位课程考试一门不及格者，停发奖学金3个月。�5�因病休学者，休学期间停发其奖学金。�6�在学期间，因公派出国者，从办理离校手续的第二个月起，停发其奖学金，回国后自办理报到手续之日起，恢复其奖学金。�7�延期毕业者，延期期间不享受奖学金。�第四条 停发奖学金后，生活的确有困难者，原则上应由本人克服；如本人努力仍无法坚持学习时，可适当申请临时困难补助，审批时从严掌握。�第五条 奖学金的发放�由研究生处学生科负责，从新生入校注册日起，登记造册报计财处，由计财处统一发放；需停发时，由研究生处学生科通知计财处，由计财处直接停发。�第六条 特殊奖学金�1�基础医学、预防医学等各专业，按原享受的普通奖学金标准再上浮40元。2�研究生兼做助教、助研、助管工作，按国家文件规定由研究生处学生科按其工作量给予适当工作补贴。�第七条 本办法解释权归中国医科大学研究生处�第八条 本办法从一九九七年九月一日起实施�������中国医科大学�一九九七年十月十五日中 国 医 科 大 学 文 件�医大校发〔2000〕研字18号�中 国 医 科 大 学特殊奖学金使用及管理办法各院、系：�根据国家教委、财政部教财〔1994〕50号文件及卫生部司(局)文件卫科教高函发〔1997〕35号文件的精神，为了鼓励研究生在学期间勤奋学习、全面发展、更好完成学业，特制定《中国医科大学特殊奖学金使用管理办法》。�一、特殊奖学金的来源�按照国家规定统招统分博士、硕士研究生奖学金标准每人每月下浮40元人民币(除基础医学、预防医学等各专业)。据此，每年特殊奖学金总金额=480元×〔各年级统招统分研究生总数-各年级基础医学和预防医学(统招统分)研究生数〕。�二、特殊奖学金的使用范围�国家计划内统招统分研究生均有享受特殊奖学金的资格。�三、获特殊奖学金的条件与标准�(一) 在学期间以第一作者并署名为中国医科大学在核心期刊上发表与本人研究课题相关的论文每篇奖励200元人民币。被国际知名索引SCI、EI、ISTP收录的论文每篇奖励500元人民币。�(二) 在学期间获得省(部)级科研课题并担任第一负责人者，奖励1000元人民币，担任第二负责人者，奖励500元人民币；获得国家自然科学基金课题并担任第一负责人者，奖励2000元人民币，担任第二负责人者，奖励1000元人民币。(三) 在学期间获得省(部)级以上科技进步奖，有证书者每人奖励1000元。(四) 研究生在学期间应聘参加教室、活动室、寝室、微机室等各种协助教学并参与管理的助教、助管工作，视工作量适当给予补助。�(五) 参加学校运动会、其他文体活动并取得名次者，给予一定的奖励。�(六) 评优奖励、义务献血与生活困难的补助。四、特殊奖学金的申请办法�(一) 发表论文及获课题奖励。署名为第一作者，本人须在毕业前夕(6月1日-15日)提交杂志原件及论文复印件。据其论文发表杂志等级及是否与研究课题相关等情况登记造表。经研究生处审核并发放。�(二) 获省(部)级科研课题奖励。课题项目第一、第二负责人，本人须提交课题项目批件及复印件，根据课题等级登记造表；获省(部)级科技进步奖者，凭获奖证书及复印件登记造表。上述两项的申请时间与发表论文时间相同，经研究生处审核并发放。�(三) 应聘参加各种助管、助教工作的补助。由聘任科(室)根据工作时间、质量及工作态度提出补助标准后，按月或季发放。�(四) 参加大型文体活动的补助与奖励。根据训练时间、比赛成绩等情况给予补助与奖励。其标准按实际情况开列奖励明细表，随时发放。�(五) 困难补助的发放。研究生本人提出补助申请，经班级或科室同意后报研究生处。(六) 研究生参加义务献血和评优由研究生处审核制表。�五、特殊奖学金管理办法�(一) 上述各种奖励与补助均应填写相应的“登记表”，经研究生处主管人审核，研究生处负责人审批后，由计财处支付。�(二) 特殊奖学金一次领取总金额在一万元以下(含一万元)，由研究生处处长批准；金额超 过一万元须请主管副校长批准。�(三) 经批准的奖学金由研究生处相关科室统一负责领取并发至本人。领取人须在领取奖学金明细表上签字。�中国医科大学�二○○○年四月二十六日
你好，论文的3万字是指论文的正文的字数（包含标点符号），摘要，脚注，尾注不算在正文主体的字数………………
发表吧小编回答：硕士毕业论文字数一般是3-5万之间，学校不一样，专业不一样，字数也就不一样，一般指导老师都会给出一个大概的字数条件，然而就会有人疑惑，这个字数怎么算。比如3万字的毕业论文，怎样才算3万字了呢，这里就为大家讲解一下。1、一般字数是指正文字数，即第一章到最后一章，不含摘要、目录、致谢、参考文献、附录等，说的是字数而不是字符数，比如3万字毕业论文，就是3万字的汉字，不包括标点和空格。2、硕士毕业论文不单有字数要求还有页数要求，页数在60-80页之间就可以，这也是指的正文部分，同样不包括摘要、目录、致谢、参考文献、附录等。3、参考文献篇数一般不少于40篇，在其中外文参考文献不少于20篇，参考文献中近五年的文献数一般不少于总数的三分之一，而且还要用近两年的参考文献，参考文献在正文中要有引用标注。要同时符合以上三项要求才行，否则将被视为不合格毕业论文。
毕业生有没有字数要求？毕业生当然也有字数要求。就是不同的学校，字数要求也不一样。与此同时，不同学历的论文，标准会有所不同。一般情况下，本科毕业论文要求不到上万字，大概在6000-8000字，有些专业比较严格一些，字数可能更高一些。与之相比，硕士论文要求的字数一般在3-5万字，控制在40,000字最好。 硕士生毕业论文查重有字数要求吗？毕业生当然也有字数要求。就是不同的学校，字数要求也不一样。与此同时，不同学历的论文，查重标准也会有所不同。一般情况下，本科毕业论文要求不到上万字，大概在6000-8000字，有些专业比较严格一些，字数可能更高一些。与之相比，硕士论文要求的字数一般在3-5万字，控制在40,000字最好。 1.标题部分需要字数。 不论是中文标题还是英文标题，标题字数不宜过长，一般控制在25字左右。题名即题，要概括核心要义，简明吸引人。 2.对报告摘要部分字数的要求。 文章的摘要字数一般控制在1500字左右。文摘作为一种独立体裁存在，字数也不能过分，但应较为详细地介绍论文研究方向、研究方法、研究过程、研究假设及最终结论。 3.关键字要求。 要害词有的学校或导师没有要求，可写可写。若要写，只写几篇就可以了，选一些精确、专业、有力的关键词。 4.报告开题部分。 研究生论文开题报告一般控制在3000-5000左右。开篇报告要说明您研究选题的学术基础，为以后研究的发展，对论文的主要研究思想和成果做一个高度概括和精炼总结。 5.论文的主体部分。 一般而言，硕士毕业论文要求为3-50,000字，那么就得算前面的项目有多少字，还有多少可以写。在撰写文章之前必须先做一个整体的论文构架，但不能完全拘泥于已有的结构和僵化的框架。 重点分析论文研究重点，细化描述；次要内容要简明扼要，不可有“喧宾夺主”之感，导致研究重点不清。事实上，写正文的时候要尽可能的细致入微，对字数多点的影响不大，但字数不够那就更麻烦了。
第一章。山西财经大学硕士毕业论文要求字数3万一般字数是指正文字数，即第一章到最后一章，不含摘要、目录、致谢、参考文献、附录等，说的是字数而不是字符数，比如3万字毕业论文，就是3万字的汉字，不包括标点和空格。
论文期刊，一篇60元，本科毕业论文是200元，博士论文，一篇是三百块，那就有点贵了。知网检测服务平台的资费标准，和中国许多论文查重服务平台的论文查重规范是不一样的，其他论文查重的服务平台，仿佛全是依照万字几块钱那样的资费标准来开展收费标准的多，有些是万字五元，有些是万字八元，也有的万字十几元，一般是万字两三元的，如果是一篇五千的毕业论文，以万字几块钱的资费标准来算，那么，价钱在二十上下的化，看起来是不贵的，可是中国知网的论文查重花费是依照篇幅来收费的，如果是论文期刊的话，一篇就是说60元，本科毕业论文是200元，如果是博士论文的话，一篇是三百块，那就有点贵了。很多人都说中国知网论文检测服务平台的收费标准很高，不划算，可是很多人也忽视了这一收费标准服务平台的收费标准实际上还是很有效的，由于，知网检测服务平台查的毕业论文的成功率要高许多，不象有的服务平台尽管收费标准划算，可是查的不精确，查的不精确的话，就必须再度开展论文查重，反复花费资金投入，都还没中国知网查一次的划得来，因此，看知网检测的状况，不可以光看表层，大部分，中国知网的论文查重，如果是第一次精确的，那么，之后就无需再查了，并且许多院校的老师都认同中国知网的论文查重，感觉中国知网的论文查重很技术专业和权威性，因此，有的高等院校的老师规定学员用知网检测来查论文的重复率，那样的话，检验毕业论文的重复率非常容易在校领导的检测软件上通过。那么，中国知网论文检测是否查一次就可以？这一需看实际的状况，假如确实只能查一次那就只查一次，关键是看这个毕业论文的重复率能否减少了，假如能一次性减少的话，就无需再查第二次了，查第二次是必须再度收费标准的。留意一个状况就是说查论文的重复率，查一次就给一次的钱，并不是中国知网这般，其他论文检测服务平台也是这般的，因此，在中国知网论文检测服务平台开展毕业论文论文查重，重复率第一次就要拿捏好，拿捏不好，花费就会很高。
论文查重收费标准如下：
1、中国知网溶解毕业论文系统软件的收费标准是每章35元上下。用以检验的毕业论文多见大学毕业生论文初稿，研究生论文分章节目录内容、博士论文分章节目录内容，每一次的检验论文字数不超过一万四千字。
2、知网期刊查重系统的收费标准是每章35元上下。关键用以检验论文期刊是不是存有一稿多投，是高等院校检验论文、科研院所检验评选职称论文的优选。
3、中国知网大学本科pmlc系统软件的收费标准是每章200多元化。它是当今最权威性的学校监测系统，主要是检验本科毕业论文、大专生论文，与中国知网VIP监测系统对比，没有在校大学生协同比照库，检验的毕业论文标识符范畴是六万以内。
4、中国知网VIP监测系统的收费标准是每章300多元化。它是95%之上的高等院校用以检验本科毕业论文、硕士研究生论文、博士研究生论文的监测系统，也称中国知网论文检测，检验结果与高等院校的检验结果一致。
5、中国知网大溶解监测系统的收费标准是每章120多元化。主要是对本科毕业论文、硕士研究生论文、论文期刊的原稿开展检验。
扫描版（部分文字乱码）分子生物学技术在动物营养学上的应用及其发展前景(上)摘要：本文从营养与基因表达调控、基因工程、转基因等三个方面综述了分子生物学技术在动物营养学中应用的最新进展，并对动物营养学的发展前景作了展望。自从发现双螺旋结构以来，分子生物学取得了飞跃性的发展，形成了以基因工程为主要内容的的现代分子生物学技术@在生物学、医学等研究中得到广泛的应用，几乎渗透到生命科学的每一个领域，成为研究和揭示生命现象本质和规律的一种重要工具。当前，世界各国都将分子生物学纳入本国科技发展的重点，可以预见，"21世纪将是生命科学的世纪，全世界所共同面临的许多重大问题，诸如饥饿与营养、疾病、能源与环境污染等问题的根本解决，在很大程度上将依赖于分子生物学技术的发展和应用。及时全面的了解和掌握分子生物学理论和技术的发展动态及研究热点，将具有重要的意义。就目前来看，我国动物营养学方面的研究工作基本尚处在机体水平：即在机体水平上研究各种营养素对机体的作用、在机体内的代谢与平衡、影响机体吸收营养素的因素等问题。分子水平方面的研究还刚刚起步，尚处于初级阶段。动物机体的生理病理变化，如生长发育、新陈代谢、遗传变异、免疫与疾病等，就本质而言，都是动物基因的表达调控发生了改变的结果，许多生理现象的彻底阐明，最终需要在基因水平上进行解释，所以动物营养学的各方面研究应与分子生物学技术，尤其是基因工程技术相结合，从分子水平上来解释各种营养素对机体的作用机制、动物机体的生理病理变化等问题，这也是动物营养学今后发展的必然趋势之一。*营养与基因的表达调控随着分子生物学技术不断发展，越来越多与代谢有关的动物基因被克隆和鉴定，人们对营养与基因调控的关系越来越感兴趣。营养与动物基因表达调控的研究已成为当今动物营养学研究的一个热点领域；如何通过改变日粮组成成分来调节体内相关基因的表达，从而使动物体处于最佳生长状况已成为现代动物营养学研究的重点；通过营养对动物基因表达的调控途径及其机制的研究，将为人们如何更加有效地对某些特定有益基因的表达提供理论依据。已有大量证据表明，主要的营养物质如糖、脂肪酸、氨基酸以及一些微量元素（如锌）对动物体内许多基因的表达都有影响。!"!营养对磷酸烯醇式丙酮酸激酶基因表达的调控PEPCK是动物肝和肾中糖元异生作用的关键酶，目前较为研究清楚的是日粮中糖含量对PEPCK基因表达的调控。糖类对PEPCK的调控主要是通过对其启动子的作用，当动物进食含有大量糖类的饲料时，PEPCK的启动了就会关闭，从而导致ABA8C水平大幅度下降，而当禁食或饲喂高蛋白质低糖的饲料时，PEPCK的启动子就会处于打开状态，从而PEPCK水平得到大幅度提高，其具体调控机制大致如下：?556D4（*0)#）等通过对大鼠ABA8C基因的分析表明，ABA8C基因启动子位于1 E+.至F#,之间，其中包含了大多数激素调控基因转录所必需的组织特异性调控元件。日粮中糖的含量水平会影响胰岛素、;?GA等激素的相对水平，而胰岛素与;?GA等激素相对水平又会影响到特异性!"#!转录因子的活性，特异性转录因子与$%$&’启动子上的相应调控元件结合与否，又会影响$%$&’基因的表达(，)。现有大量证据表明，$%$&’基因一系列复杂的调控元件中，有包括胰岛素、甲状腺激素、糖皮质激素、视黄酸对$%$&’基因转录的正调控元件和胰岛素对$%$&’基因转录的负控调元件，在上述调控元件中，*+,$调控元件-&.%/和$(-0/调控元件是最重要的两种，*+,$对$%$&’基因的诱导和胰岛素对$%$&’基因的抑制作用就是通过这两个调控元件来进行调控的。因此，当进食含大量糖类的饲料时，由于*+,$水平的急剧下降以及胰岛素水平的急剧上升，从而抑制$%$&’基因的表达，导致肝中$%$&’水平大幅度下降，当禁食或饲喂高蛋白低糖的饲料时，则情况恰好相反。!"#营养对脂肪酸合成酶（$%&）基因表达的调控1+2是脂肪酸合成的主要限制酶，存在于脂肪、肝脏及肺等组织中，在动物体内起催化丙二酰&3+连续缩合成长链脂肪酸的反应，其活性高低将直接控制着体内脂肪合成的强弱，从而影响整个机体中脂肪的含量。有关营养与1+2基因的表达调控，2!4!&56789-:;;(/曾报道：糖类能诱导1+2基因的转录，而脂肪则抑制这种诱导的表达。&3<=9等（:;;>）试验研究也表明，当给禁食后的成年鼠饲喂含高糖低脂肪的饲料时，1+2基因的表达就增强，而且相应的?.@+含量的增加幅度与碳水化合物的摄入量也成正比。糖类对1+2基因表达的影响。为区分活体中激素水平变化的协同作用，13
从简单地剪切致病基因，到开发出不再传播疾病的工程动物，基因编辑技术已经释放出巨大的潜力。随着研究的深入，科学界还发现，除了编辑具有遗传讯息的DNA片段，编辑RNA可以在不改变基因组的情况下，帮助调整基因表达方式，此外，RNA的寿命是相对短暂的，这也意味着它的变化是可以逆转的，从而避免基因工程中的巨大风险。
2017年10月，来自Broad研究所的张锋研究团队在《自然》期刊上发表了题为“RNA targeting with CRISPR-Cas13”的文章，首次将CRISPR-Cas13系统公之于众，证实了CRISPR-Cas13可以靶向哺乳动物细胞中的RNA。仅仅时隔三周，又一篇名为“RNA editing with CRISPR-Cas13”的力作发表于《科学》期刊。在该研究中，张锋研究团队再次展示了这一RNA编辑系统，能有效地对RNA中的腺嘌呤进行编辑。
在CRISPR出现之前，RNAi是调节基因表达的理想方法。但是Cas13a酶一大优势在于更强的特异性，而且这种本身来自细菌的系统对哺乳动物细胞来说，并不是内源性的，因此不太可能干扰细胞中天然的转录。相反，RNAi利用内源性机制进行基因敲除，对本身的影响较大。但CRISPR-Cas13系统还有一个重要的问题，Cas13a酶本质上是一种相对较大的蛋白质，因此很难被包装到靶组织中，这也可能成为RNA编辑技术临床应用的一大障碍。
2018年3月16日，一项发表在《细胞》期刊的重磅成果为RNA编辑技术带来一大步飞跃，来自美国Salk研究所的科学家利用全新的CRISPR家族酶扩展了RNA编辑能力，并将这个新系统命名为“CasRx”。
CasRx（品红色）在人类细胞核中靶向RNA（灰色），Salk研究所
“生物工程师就像自然界的侦探一样，在DNA模式中寻找线索来帮助解决遗传疾病。CRISPR彻底改变了基因工程，我们希望将编辑工具从DNA扩展到RNA。”研究领导者Patrick Hsu博士表示，“RNA信息是许多生物过程的关键介质。在许多疾病中，这些RNA信息失去了平衡，因此直接靶向RNA的技术将成为DNA编辑的重要补充。”
除了高效性且无明显脱靶效应，新系统的一个关键特征是其依赖于一种比以前研究中物理尺寸更小的酶。 这对RNA编辑技术至关重要，这使得该编辑工具能够更容易被包装到病毒载体，并进入细胞进行RNA编辑。来自东京大学的科学家Hiroshi Nishimasu并未参与这项研究，他表示：“在这项研究中，研究人员发现了一种较Cas13d更加‘紧凑’的酶CasRx。从基础研究到治疗应用，我认为CasRx将成为非常有用的工具。”
此外，在这项研究中，研究人员还展示了利用这种新型RNA编辑系统来纠正RNA过程的能力。他们将CasRx包装到病毒载体中，并将其递送到利用额颞叶痴呆（FTD）患者干细胞中培养的神经细胞，最终使tau蛋白水平恢复到健康水平上，有效率达到80%。
Patrick Hsu博士最后说道：“基因编辑技术通过对DNA的切割带来基因序列的改变。在经过基因编辑的细胞中，其效果是永久的。虽然基因编辑技术能够很好地将基因完全关闭，但对调节基因的表达上并不那么优秀。展望未来，这一最新工具将在RNA生物学研究中发挥重要作用，并有望在未来凭借该技术对RNA相关疾病进行治疗。”
该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默。
3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默，证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性，通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝脏，有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比，Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比，Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低Pten的质粒、尾静脉注射敲低Pcsk9的AAV8病毒、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到Pten基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调，Pcsk9下调造成血清胆固醇下调；Vegfa下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
2020年3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向 Pten 基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了 Pten 的高效沉默， 证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性， 通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向 Pscsk9 的sgRNA到小鼠肝脏， 有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平 。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也 探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低 Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积**，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比， Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％ ，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比， Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的 ，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性 。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低 Pten 的质粒、尾静脉注射敲低 Pcsk9 的AAV8病毒、眼部注射敲低 Vegfa 的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到 Pten 基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调， Pcsk9 下调造成血清胆固醇下调； Vegfa 下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
图1 CasRx介导的 Pten 体内体外的下调（ Protein & Cell ）
A.质粒示意图；细胞中 Pten 的下调；检测PTEN及AKT的表达； 与shRNA脱靶比较；E.尾静脉注射质粒示意图；.免疫荧光，qPCR，western分别检测 Pten 及p-AKT的表达
图2 血清胆固醇的调节以及 Pcsk9 的可逆调控（ Protein & Cell ）
A.针对 Pcsk9 的AAV8病毒注射示意图；B.肝组织中 Pcsk9 的表达量；C.血清 PCSK9 的表达量；D.血清胆固醇水平；.血清ALT和AST的测定；G.可逆调节注射示意图； H. Pcsk9 的动态调控。
图3 AAV介导CasRx减少了AMD小鼠模型中CNV的面积（National Science Review）
A.小鼠和人序列比较以及sgRNA示意图；.在293T和N2a细胞中敲低 Vegfa ；蛋白的表达；病毒质粒示意图；F.实验流程图；的mRNA表达水平；.激光烧伤之前或之后7天的 Vegfa mRNA水平；诱导3天后的VEGFA蛋白水平；K.激光烧伤7天后，用PBS或AAV-CasRx- Vegfa 注射的代表性CNV图像；面积统计。
2020 年 4 月 8 日， Cell 期刊在线发表了题为 《Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice》 的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室 杨辉 研究组完成。
该项研究通过运用最新开发的 RNA 靶向 CRISPR 系统 CasRx 特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低 Ptbp1 基因的表达，首次在成体中实现了视神经节细胞的再生，并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时，该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元，并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。
人类的神经系统包含成百上千种不同类型的神经元细胞。在成熟的神经系统中，神经元一般不会再生，一旦死亡，就是永久性的。神经元的死亡会导致不同的神经退行性疾病，常见的有阿尔兹海默症和帕金森症。此类疾病的病因尚不明确且没有根治的方法，因此对人类的健康造成巨大威胁。据统计，目前全球大约有 1 亿多的人患有神经退行性疾病，而且随着老龄化的加剧，神经退行性疾病患者数量也将逐渐增多。
在常见的神经性疾病中，视神经节细胞死亡导致的永久性失明和多巴胺神经元死亡导致的帕金森疾病是尤为特殊的两类，它们都是由于特殊类型的神经元死亡导致。我们之所以能看到外界绚烂多彩的世界，是因为我们的眼睛和大脑中存在一套完整的视觉通路，而连接眼睛和大脑的神经元就是视神经节细胞。
作为眼睛和大脑的唯一一座桥梁，视神经节细胞对外界的不良刺激非常敏感。研究发现很多眼疾都可以导致视神经节细胞的死亡，急性的如缺血性视网膜病，慢性的如青光眼。视神经节细胞一旦死亡就会导致永久性失明。据统计，仅青光眼致盲的人数在全球就超过一千万人。
帕金森疾病是一种常见的老年神经退行性疾病。它的发生是由于脑内黑质区域中一种叫做多巴胺神经元的死亡，从而导致黑质多巴胺神经元不能通过黑质-纹状体通路将多巴胺运输到大脑的另一个区域纹状体。目前，全球有将近一千万人患有此病，我国尤为严重，占了大约一半的病人。 如何在成体中再生出以上两种特异类型的神经元，一直是全世界众多科学家努力的方向。
该研究中，研究人员首先在体外细胞系中筛选了高效抑制 Ptbp1 表达的 gRNA，设计了特异性标记穆勒胶质细胞和在穆勒胶质细胞中表达 CasRx 的系统。所有元件以双质粒系统的形式被包装在 AAV 中并且通过视网膜下注射，特异性地在成年小鼠的穆勒胶质细胞中下调 Ptbp1 基因的表达。
大约一个月后，研究人员在视网膜视神经节细胞层发现了由穆勒胶质细胞转分化而来的视神经节细胞，并且转分化而来的视神经节细胞可以像正常的细胞那样对光刺激产生相应的电信号。
研究人员进一步发现，转分化而来的视神经节细胞可以通过视神经和大脑中正确的脑区建立功能性的联系，并且将视觉信号传输到大脑。在视神经节细胞损伤的小鼠模型中，研究人员发现转分化的视神经细胞可以让永久性视力损伤的小鼠重新建立对光的敏感性。
为进一步发掘 Ptbp1 介导的胶质细胞向神经元转分化的治疗潜能，研究人员证明了该策略还能特异性地将纹状体中的星形胶质细胞非常高效的转分化为多巴胺神经元，并且证明了转分化而来的多巴胺神经元能够展现出和黑质中多巴胺神经元相似的特性。
在行为学测试中，研究人员发现这些转分化而来的多巴胺神经元可以弥补黑质中缺失的多巴胺神经元的功能，从而将帕金森模型小鼠的运动障碍逆转到接近正常小鼠的水平。
需要指出的是，虽然科学家们在实验室里取得了重要进展，但是要将研究成果真正应用于人类疾病的治疗，还有很多工作要做：人类的视神经节细胞能否再生？帕金森患者是否能通过该方法被治愈？这些问题有待全世界的科研工作者共同努力去寻找答案。
（上）CasRx 通过靶向的降解 Ptbp1 mRNA 从而实现 Ptbp1 基因表达的下调。
（中）视网膜下注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将视网膜穆勒胶质细胞转分化为视神经节细胞，转分化而来视神经节细胞可以和正确的脑区建立功能性的联系，并且提高永久性视力损伤模型小鼠的视力。
（下）在纹状体中注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将星形胶质细胞转分化为多巴胺神经元，从而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的运动症状。
RNA-editing Cas13 enzymes have taken the CRISPR world by storm. Like RNA interference, these enzymes can knock down RNA without altering the genome , but Cas13s have higher on-target specificity. New work from Konermann et al. and Yan et al. describes new Cas13d enzymes that average only kb in size and are easy to package in low-capacity vectors! These small, but mighty type VI-D enzymes are the latest tools in the transcriptome engineering toolbox.
Microbial CRISPR diversity is impressive, and researchers are just beginning to tap the wealth of CRISPR possibilities. To identify Cas13d, both groups used very general bioinformatic screens that looked for a CRISPR repeat array near a putative effector nuclease. The Cas13d proteins they identified have little sequence similarity to previously identified Cas13a-c orthologs, but they do include HEPN nuclease domains characteristic of the Cas13 superfamily. Yan et al. proceeded to study orthologs from Eubacterium siraeum (EsCas13d) and Ruminococcus sp. (RspCas13d), while Konermann et al. characterized orthologs from “Anaerobic digester metagenome” (AdmCas13d) and Ruminococcus flavefaciens (nicknamed CasRx), as well as EsCas13d.
Like other Cas13 enzymes, the Cas13d orthologs described in these papers can independently process their own CRISPR arrays into guide RNAs. crRNA cleavage is retained in dCas13d and is thus HEPN-independent. These enzymes also do not require a protospacer flanking sequence, so you can target virtually any RNA sequence ! In bacteria, Cas13d-mediated cleavage promotes collateral cleavage of other RNAs. As with other Cas13s, this collateral cleavage does not occur when Cas13d is expressed in a mammalian system.
Since Cas13d is functionally similar to previously discovered Cas13 enzymes - what makes these orthologs so special? The first property is size - Cas13d enzymes have a median length of ~930aa - making them 17-26% smaller than other Cas13s and a whopping 33% smaller than Cas9! Their small size makes then easy to package in low-capacity vectors like AAV, a popular vector due to its low immunogenicity. But these studies also identified other advantages, including Cas13d-specific regulatory proteins and high targeting efficiency, both of which are described below.
The majority of Type VI-D loci contain accessory proteins with WYL domains (named for the three conserved amino acids in the domain). Yan et al. from Arbor Biotechnologies found that RspCas13d accessory protein RspWYL1 increases both targeted and collateral RNA degradation by RspCas13d. RspWYL1 also increased EsCas13d activity, indicating that WYL domain-containing proteins may be broader regulators of Cas13d activity. This property makes WYL proteins an intriguing counterpart to anti-CRISPR proteins that negatively modulate the activity of Cas enzymes, some of which are also functional in multiple species (read Arbor Biotechnologies' press release about their Cas13d deposit here ).
Not all Cas13d proteins are functional in mammalian cells, but Konermann et al. saw great results with CasRx and AdmCas13d fused to a nuclear localization signal (NLS). In a HEK293 mCherry reporter assay, CasRx and AdmCas13d produced 92% and 87% mCherry protein knockdown measured by flow cytometry, respectively. Cas13d CRISPR array processing is robust, with CasRx and either an unprocessed or processed gRNA array (22 nt spacer with 30 nt direct repeat) mediating potent knockdown. Multiplexing from the CRISPR array yielded >90% knockdown by CasRx for each of four targets, including two mRNAs and two nuclear long non-coding RNAs.
One interesting twist to Cas13d enzymes is their cleavage pattern: EsCas13d produced very similar cleavage products even when guides were tiled across a target RNA, indicating that this enzyme does not cleave at a predictable distance from the targeted region. Konermann et al. show that EsCas13d favors cleavage at uracils, but a more detailed exploration of this cleavage pattern is necessary.
Konermann et al. compared CasRx to multiple RNA regulating methods: small hairpin RNA interference, dCas9-mediated transcriptional inhibition (CRISPRi), and Cas13a/Cas13b RNA knockdown. CasRx was the clear winner with median knockdown of 96% compared to 65% for shRNA, 53% for CRISPRi, and 66-80% for other Cas13a and Cas13b effectors. Like previously characterized Cas13 enzymes, CasRx also displays very high on-target efficiency; where shRNA treatment produced 500-900 significant off-targets, CasRx displayed zero. Unlike Cas9, for which efficiency varies widely across guide RNAs, each guide tested with CasRx yielded >80% knockdown. It seems that CasRx may make it possible to target essentially any RNA in a cell.
Since catalytically dead dCasRx maintains its RNA-binding properties, Konermann et al. tested its ability to manipulate RNA species through exon skipping. Previous CRISPR exon-skipping approaches used two guide RNAs to remove a given exon from the genome, and showed success in models of muscular dystrophy . In this case, Konermann et al. targeted MAPT , the gene encoding dementia-associated tau, delivering dCasRx and a 3-spacer array targeting the MAPT exon 10 splice acceptor and two putative splice enhancers. After AAV-mediated delivery to iPS-derived cortical neurons, dCasRx-mediated exon skipping improved the ratio of pathogenic to non-pathogenic tau by nearly 50%, showing proof-of-concept for pre-clinical and clinical applications of dCasRx.
The identification of Type VI Cas13d enzymes is another win for bioinformatic data mining. As we continue to harness the natural diversity of CRISPR systems, only time will tell how large the genome and transcriptome engineering toolbox will be. It is, however, certain that the impact of CRISPR scientific sharing will continue to grow, and we at Addgene appreciate our depositors for making their tools available to the broader community.
References
Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1. PubMed PMID: 29551272
Yan, Winston X., et al. “Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.” Mol Cell. (2018) pii: S1097-2765(18)30173-4. PubMed PMID: 29551514
\1. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors
\2. CRISPR genetic editing takes another big step forward, targeting RNA
\3. How Editing RNA—Not DNA—Could Cure Disease in the Future
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