靶向骨桥蛋白shRNA表达载体的构建与鉴定

【摘要】 目的 通过构建骨桥蛋白(osteopontin，opn)shrna表达载体，探索卵巢癌基因治疗新途径。方法 根据基因库上的opn-mrna序列,设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用 t4dna连接酶连接到线性化的psilence质粒中,并对重组质粒进行酶切及序列鉴定。结果 opnsirna表达载体克隆构建成功，插入片段测序结果与合成的sirna结果一致。结论 靶向opn shrna表达载体的构建成功为研究降低卵巢癌opn表达的抗肿瘤效应，及与放化疗的协同效应打下了基础。

【关键词】 骨桥蛋白;shrna;表达载体;卵巢癌

construction and identification of targeting osteopontin shrna expression vector

　　xu wei, wei su, lu xiaoyuan*

　　(department of gynecology & obstetrics, affiliated hospital of xuzhou medical college,

　　xuzhou, jiangsu 221002, china)

　　abstract: objective to explore the new gene therapy for ovary cancer by the construction of osteopontin shrna expression vector. methods on the basis of opn-mrna genetic sequence database, an oligonucleotide chain consisting of 64 bases restriction sites at both ends was designed and synthesized. the annealed oligonucleotide chain was connected to the linearized plasmid psilence with t4dna ligase and was identified by enzyme digestion of recombinant plasmid and the opnsirna express vector cloning was successfully constructed, and the sequencing result was consistent with the synthesized sirna. conclusion the successful construction of targeting express vector of opnsirna lays the basis for studying the effect on gene therapy of ovary cancer to inhibit the express of opn and the synergistic effect of radiotherapy and chemotherapy.

　　key words: osteopontin; shrna; express vector; ovary cancer

　　骨桥蛋白 (osteopontin, opn) 是细胞外基质中的一种分泌型磷酸化糖蛋白,是 senger 等[1]于 1979 年首次在恶性转化的上皮细胞株中发现的, 称之为转化相关性磷酸蛋白。1986年,franzen 等[2]从骨组织中分离出一种磷蛋白, 其特性与senger等发现的磷蛋白相似, 正式命名为骨桥蛋白。近年研究表明, opn的过度表达与肿瘤细胞生长、增殖和侵袭、转移密切相关。

　　rna干扰(short interfering rna, sirna)技术是目前简单而高效阻断哺乳动物细胞内特异基因表达的最有效方法。本研究选择作为sirna的表达载体,构建针对opn的sirna的表达载体,它将为进一步研究opn在卵巢癌侵袭和转移中的作用机制提供很好的技术手段,并为进一步研究和将此技术应用于肿瘤治疗奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要材料和试剂 质粒psilencer3.1-h1neo购自ambion公司，该载体含有人h1启动子，包括bamhⅰ及hindⅲ酶切位点。

　　大肠杆菌dh-5α购自碧云天生物有限公司。bamhⅰ、hindⅲ、t4 dna连接酶购自mbi公司，质粒小量提取试剂盒购自tiangen生物公司。dna凝胶回收纯化试剂盒购自promega公司。

　　1.2 实验室及仪器 本实验在徐州医学院肿瘤生物治疗实验室完成。pcr仪(eppendorf公司)，高速离心机(eppendorf公司)，电热恒温水槽(上海跃进医疗器械厂)，摇床(太仓市实验设备厂)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 sirna设计与合成 根据genebank收录的骨桥蛋白的基因序列(nm000582)作为分析序列，采用ambion公司的网上设计软件()，参考sirna设计原则[4]，选择最佳干扰位点，本研究选取的靶位点是：acaggctgattctggaagt;agccaatgatgagagcaat;针对靶位点分别设计两条互补的寡核苷酸序列，寡核苷酸的两端带有与bamhⅰ和hind ⅲ酶切位点互补的粘端序列，能够直接与经bamhⅰ和hind ⅲ酶切的载体连接。并通过blast对所选择的靶序列进行同源分析,排除sirna非特异性抑制其他基因片段的可能。shrna序列茎环结构为9个与opn基因不互补的非同源碱基(ttcaagacg),末端终止子为tttttt 。设计的具有发夹结构的shrna干扰片段序列如下。结构模式为:bamhⅰ+sense+loop+antisense+终止信号+hindⅲ。共设计了2对opn特异性sirna编码序列,如下：

　　opn-shrna1:5′gatccgacaggctgattctggaagtttcaagagaacttccagaatcagcctgt t

　　tttttggaaa-3′;

　　反向互补序列：5′agcttttccaaaaaaacaggctgattctggaagttctcttgaaacttccagaatc

　　agcctgtcg-3′;

　　opn-shrna2:5′gatccgagccaatgatgacagcaatttcaagagaattgctgtcatcattggctt

　　tttttggaaa-3′;

　　其反向互补序列:5′-agcttttccaaaaaaag

　　ccaatgatgacagcaattctcttgaaattgctgtcatcattggctcg-3′。

　　阴性对照序列:以上寡核苷酸序列单链由上海生工生物工程公司合成。

　　1.3.2 双链寡核苷酸的合成 将合成的单链寡核苷酸溶解于无核酶水中，终浓度为1 g/l。将互补的两条寡核苷酸各取2 μl，加入46 μl的退火缓冲液，置pcr反应仪上，设定反应条件为：90℃ 3 min，37 ℃1 h，得到退火产物。-20℃保存备用。

　　1.3.3 psilencer3.1-h1neo载体的线性化 取1.5 ml ep管，分别加入无核酶水78 μl，10×buffer 10 μl，psilencer3.1-h1neo载体10 μl，hindⅲ 1μl，bamh ⅰ 1 μl，混匀， 37℃水浴保温8 h。取酶切产物5 μl在1%的琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察鉴定已切开。将所有酶切产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，长波紫外灯下切下4.2 kb左右线性化条带的凝胶，使用promega凝胶回收纯化试剂盒进行回收线性化载体。用紫外分光光度计测浓度为0.05 g/l。

　　1.3.4 退火产物与线性化psilencer3.1-h1neo载体的连接 取100 μl ep管，分别加入4 μl无核酶水，3 μl退火产物，1 μl线性载体，1 μl 10×buffer，1 μl t4 dna连接酶，共10 μl反应液混匀，室温放置3 h，然后置4℃冰箱过夜。得到连接产物。同时设立阴性对照：退火产物以无核酶水代替。

　　1.3.5 连接产物转化感受态细胞 将感受态细胞取出置于冰上10 min，各取5 μl过夜连接产物加入感受态细胞50 μl中，轻柔混匀。置冰浴中30 min。迅速移入42℃水浴中热休克90 s，取出置于冰浴中2 min，加入无抗生素的液体lb培养基200 μl，在37℃以低速180 r/min振摇55 min使细菌复苏并表达质粒的amp抗性标记基因。取转化产物150 μl均匀涂于含氨苄青霉素(125 μg/ml)的lb琼脂平板上。倒置于37℃培养箱培养过夜。次日从每个平板上各挑取3个单克隆接种于含amp抗性的lb培养液中，37℃ 恒温摇床(200 r/min)培养过夜。

　　1.3.6 重组质粒的提取及酶切鉴定 收集上述培养菌液,用小提试剂盒(tiangen公司)参照质粒提取试剂盒提取步骤小量提取质粒。将提取的质粒行双酶切,加入无核酶水78 μl，10×buffer 10 μl，psilencer3.1-h1neo载体10 μl，hindⅲ1 μl，bamhⅰ1 μl，混匀，共100 μl反应体系，37℃水浴保温8 h。取5 μl 反应产物在1 %琼脂糖凝胶中电泳鉴定。

　　1.3.7 测序鉴定 为进一步验证重组质粒构建的准确性,经酶切鉴定后,将连接正确的重组质粒菌液送上海生工生物工程公司进行测序。

　　2 结 果

　　2.1 酶切鉴定 见图1。

　　图1 重组质粒酶切鉴定图

　　-shrna1/bamh- hindⅲ酶切表达质粒;-shrna2/bamh- hindⅲ酶切表达质粒;-shrna1表达质粒;-shrna2表达质粒2.2 重组质粒的测序分析 测序结果表明合成的寡核苷酸已成功克隆入psilencer3.1-hneo载体, 未发现缺失、突变等插入异常存在,表明已成功构建了opn的psilencer3.1-hneo表达质粒分别为psilencer3.1-opn-shrna1和psilencer3.1-opn-shrna2(图2)。图2 重组质粒测序鉴定图

　　-shrna1;-shrna2

　　3 讨 论

　　目前许多研究证明opn可促进肿瘤的浸润、转移，如hirama等[3]研究证明， 肿瘤细胞产生的opn可以作为一个有效的血管生成因子促进肿瘤的生长;cook等[4]也发现,opn能影响乳腺癌模型中促使癌形成的基因的表达;而 wai等[5]通过小分子干扰rna(sirna)质粒抑制该蛋白的表达而使结肠腺癌细胞的运动性和侵袭性减弱，从而减弱肿瘤的转移，提示如果成功抑制opn的基因表达或破坏其作用途径，有可能阻止或减弱肿瘤的转移而延长患者生存时间，因此opn也有可能成为恶性肿瘤治疗(包括卵巢癌在内)的新靶点。

　　作为一个肿瘤转移相关蛋白，opn在多种肿瘤中存在过度表达或分泌，能通过促进肿瘤细胞生长， 诱导局部新生血管的形成，抑制转移微环境对肿瘤细胞的凋亡诱导，促进肿瘤的淋巴转移等途径参与恶性肿瘤的进展和转移，这就使opn成为治疗肿瘤的一个新的理想靶点，阻断opn与其受体的信号传导可能成为治疗肿瘤新的生物靶点。对opn在肿瘤转移中作用机制的进一步研究将加深对肿瘤转移的理解，为肿瘤患者的治疗与预防提供更多的理论支持。

　　如何有效抑制opn基因在转录和翻译水平的表达成为关键。现在抑制基因表达的方法有很多种, 如反义核酸法、核酶法、基因敲除以及最近提出的rna干扰方法。在哺乳动物细胞的rna干扰研究中, sirnas主要有以下几种方法生成: 体外化学合成、体外转录以及用质粒或病毒表达载体在细胞内直接生成sirnas等几种方式。其中通过质粒等表达载体在细胞内直接转录sirnas不仅具有经济和容易操作等优点, 更重要的是可以通过建立稳定地表达sirnas的细胞克隆而达到延长rna干扰的效应。本研究所构建的质粒psilencer3.1是通过体内转录的方式生成发夹状双链rna分子, 然后通过dicer酶生成sirnas分子从而引发基因沉默。该质粒采用h1启动子, h1启动子属于rna聚合酶ⅲ启动子, 能够在哺乳动物细胞中指导合成发夹状双链rna分子, 诱导基因特异性沉默。paddison等[6]发现, 短发夹状rna(short hairpin rna, shrna)可以在哺乳动物细胞中调控基因的表达, 用带有rna聚合酶ⅲ启动子并表达shrna的表达载体转染细胞后, 细胞能产生长期稳定的基因沉默[7-9]。

【参考文献】
　[1] senger dr, wirth df, hynes ro. transformed mammalian cells secrete specific proteins and phosphoproteins [j].cell,1979,16(4):885-893.

　　[2] franzén a, heinegrd d. isolation and characterization of two sialopro2teins present only in bone calcified matrix [j]. biochem j,1985,232(3):715-724.

　　[3] hirama m,takahashi f, takahashi k,et ontin overproduced by tumor cells acts as a potent angiogenic factor contributing to tumor growth [j].cancer lett,2003,198(1):107-117.

　　[4] cook ac,tuck ab, mccarthy s, et al. osteopontin induces multiple changes in gene expression that reflect the six "hallmarks of cancer"in a model of breast cancer progression [j].mol carcinog,2005,43(4):225-236.

　　[5] wai py, mi z, guo h, et al. osteopontin silencing by small interfering rna suppresses in vitro and in vivo ct26 murine colon adenocarcinoma metastasis[j].carcinogenesis,2005,26(4):741-751.

　　[6] paddison pj, caudy aa, sachidanandam r, et al. short hairpin activated gene silencing in mammalian cells [j]. methods mol biol,2004,265:85-100.

　　[7] paddison pj, caudy aa, bernstein e, et al. short hairpin rnas(shrnas)induce sequence-specific silencing in mammalian cells [j]. genes dev,2002,16(8):948-958.

　　[8] paul cp, good pd, winer i, et al. effective expression of small interfering rna in human cells [j]. nat biotechnol, 2002,20(5):505-508.

　　[9] brummelkamp tr, bernards r, agami r. a system for stable expression of short interfering rnas in mammalian cells [j]. science,2002,296(5567):550-553.