高能聚焦电流场对u14宫颈癌荷瘤小鼠的治疗的分

　[摘要] 目的 观察高能聚焦电流场对u14小鼠宫颈癌杀伤作用以及对荷瘤小鼠生存转归状况的影响。 方法 取64只雌性ICR小鼠，制备u14宫颈癌皮下移植瘤模型。对治疗前后组织进行形态学观察、肿瘤体积变化曲线及小鼠体重变化分析，同时对照观察两组生存期和肿瘤转归状况，探讨高能聚焦电流场治疗肿瘤的有效性和安全性。 结果 组织学、术后肿瘤体积变化曲线及手术前后小鼠体重变化证实：高能聚焦电流场可直接杀死肿瘤细胞；组织形态学观察发现，肿瘤细胞变性坏死等征象，随时间推移坏死愈加明显。两组荷瘤小鼠术后31 d肿瘤转归状况：治疗组完全应答（CR）占69.56%。对照组全部为进展性疾病，死亡率为39.13%，两组差异有统计学意义（P < 0.05）。生存期分析表明两组差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 高能聚焦电流场对u14小鼠宫颈癌细胞具有杀灭作用，可延长荷瘤小鼠的生存期。
　　[关键词] 高能聚焦电流场；混频电流场；宫颈癌；u14
　　[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）10（a）-0014-04
　　高能聚焦电流场不同于传统的消融技术，临床上用于治疗宫颈炎、宫颈糜烂，但是其应用于宫颈癌以及其他肿瘤的治疗尚未见报道。为了了解高能聚焦电流场消融技术对宫颈癌的治疗作用，笔者采用高能聚焦电流场治疗仪直接作用于u14宫颈癌荷瘤小鼠，探讨其治疗宫颈癌的有效性和安全性。
　　1 材料与方法
　　1.1 高能聚焦电流场治疗仪
　　妇科消融仪（型号：AIRE3000，华年电子公司提供）利用混频电流场原理对蛋白质变性进行处理，以达到治疗的目的。该仪器能够实时温度控制与显示，最高治疗温度为70℃，最长治疗时间为100 min，其治疗电极（型号：Aire-1014，柱状）直径为4 mm。
　　1.2 动物模型分组及治疗
　　雌性ICR小鼠64只，鼠龄5～6周，重量15～18 g（清华大学实验动物中心提供）。传代腹水型ICR小鼠u14小鼠宫颈癌瘤株（中国科学院药物研究所提供）用无菌生理盐水稀释至1×107个/mL，于小鼠右后肢外侧行皮下接种0.2 mL，常温饲养。待肿瘤最大直径达0.9～1.0 cm时（游标卡尺测量），采用随机数字法随机将其分为治疗组和对照组，每组各32只。将各组小鼠采用1%戊巴比妥钠腹腔注射（2.5～3.0 mg/100 g）麻醉备皮后固定在治疗板上，充分暴露肿瘤组织。将高能聚焦电流场治疗仪的治疗电极放置并固定在肿瘤组织上。治疗组治疗条件设定为固定输出温度69℃，功率6 W，治疗电极作用于肿瘤组织（90±2）s。对照组仪器不做任何条件设定，将治疗电极放置肿瘤组织，行假手术。高能聚焦电流场消融技术术后两组小鼠同等条件下饲养。
　　1.3 形态学观察
　　术前（对照组）及术后（治疗组）即刻、第9天、第18天时间点处死3只小鼠，取瘤组织置10%中性甲醛中固定，行常规石蜡包埋、切片，HE染色后光镜下观察。对照组和治疗组术后即刻的瘤组织切取1 mm×1 mm×1 mm，戊二醛、锇酸固定，脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铀/铅染色，应用FEI Quanta 200型透射电镜观察其超微结构。
　　1.4 实验小鼠体重变化
　　术前及术后第35天称两组荷瘤鼠体重，计算平均值。
　　1.5 生存转归观察
　　术后第31天测量两组小鼠肿瘤体积（V）（单位：cm3）。瘤体V=1/2ab2（a：最长径，b：最短径）。采WHO肿瘤应答评估规则评价[1-2]：①完全应答（CR），指治疗至少30 d后未触及或测量的瘤体，皮肤完整性恢复；②部分应答（PR），指瘤体积减少> 50%；③稳定性疾病（SD），指瘤体积减少< 50%；④进展性疾病（PD），指瘤体积继续增加。
　　1.6 生存期观察
　　相同条件饲养两组小鼠，顺其自然生存，记录小鼠生存或死亡时间（以d为单位），并绘制荷瘤小鼠生存曲线。
　　1.7 统计学方法
　　采SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；生存期资料进行Log-rank检验，并用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线。以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 肉眼观察
　　对照组肿瘤组织，肉眼观察呈类球形，质韧，灰红色，表面血管丰富，与邻近组织连接紧密，剥离困难，直径约1 cm，剖面呈鱼肉状，中心无明显的出血坏死。治疗组术中，治疗电极作用处表皮无出血，术后立刻剖开肿瘤，质软，灰白色，有液化区域。术后第9天及第18天，治疗电极作用处表面结痂，切面有瘀血坏死区，质硬。随时间推移，部分焦痂脱落，皮肤完整性恢复，皮下未见瘤体。见图1。
　　2.2 光镜观察
　　肿瘤接种后7 d，对照组肿瘤细胞呈条索及团块状生长，呈多边形或不规则形，细胞核大，核膜厚，染色质粗，可见核分裂相，胞浆少，呈轻度嗜碱。对照组肿瘤接种后16、25 d与接种后7 d形态相似。治疗组在术后即刻切除的样本中发现，治疗部位的表皮组织形态与正常表皮组织形态有明显差异；光镜下观察发现，大部分肿瘤细胞结构尚完整，部分肿瘤细胞核结构疏松，少数肿瘤细胞有核固缩，肿瘤细胞有坏死；术后第9天发现，治疗部位的皮下脂肪、结缔组织、肌肉等组织内未见到肿瘤组织，有较多核碎裂的坏死细胞及炎性细胞浸润，血管扩张充血，部分区域纤维组织增生；术后第18天治疗部位可见痂下愈合，有再生的薄层鳞状上皮，其下脂肪结缔组织中未见肿瘤细胞，肌肉周围有纤维结缔组织增生，其间有较多炎性细胞及核碎裂的坏死细胞，血管内可见机化血栓。见图2。
　　2.3 透射电镜超微结构表现
　　对照组肿瘤细胞核大，核膜厚，核仁较大，细胞器少，胞浆内大量游离核蛋白体，少量粗面内质网及线粒体，伴轻度内室肿胀。治疗组肿瘤细胞膜失去连续性，核固缩、碎裂、溶解，多脂滴，细胞器受损较严重无法辨认结构，以上说明肿瘤细胞受到不可逆性损伤。见图3。

　2.4 实验小鼠体重变化
　　术后小鼠饮食、睡眠、活动力等一般生命体征良好，治疗电极接触的靶区皮肤发白，皮肤温度升高。根据实验小鼠术后和术前的体重变化观察，随着各组荷瘤鼠的鼠龄增长，体重增加。术前和术后第35天，治疗组荷瘤鼠体重与对照组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
　　2.5 生存转归观察
　　在观察期内（高能聚焦电流场消融术后35 d），治疗组术后第2天肿瘤表面开始结痂的小鼠占65.21%，切面可见瘀血坏死区，质变硬。随时间推移，术后9～11 d约有36%的小鼠焦痂开始脱落，待30～31 d 69.60%的小鼠皮肤完整性恢复，且皮下未见瘤体。术后第31天，治疗组荷瘤小鼠23只，CR 16只，占69.56%，PD 6只，占26.09%，1只术后第1天死亡，占4.35%。而对照组23只均为PD，其中，死亡9只，死亡率达39.13%。对照组随着时间延长，荷瘤鼠的肿瘤体积增大，肿瘤组织呈灰红色，质硬，肿瘤体积逐渐增加。对照组与治疗组在术后35 d的观察期内，肿瘤体积差异有统计学差异（P < 0.05）。见图4。
　　2.6 生存期观察
　　术后荷瘤小鼠生存期明显延长。如图5所示，小鼠荷瘤生长前44 d，治疗组与对照组生存期差异无统计学意义（P > 0.05），44 d后对照组荷瘤小鼠死亡数量增加。分析发现，术后90 d，对照组荷瘤小鼠全部死亡，治疗组22只小鼠仍存活，生存率达95.65%，两组差异有高度统计学意义（P < 0.01）。对照组荷瘤小鼠中位生存天数为50 d。
　　3 讨论
　　热疗具有放射增敏和化疗增敏作用，热疗联合其他治疗主要应用于进展性及复发性宫颈癌。研究认为，当温度达到43℃时可以使肿瘤细胞生长受到抑制及产生热诱导凋亡[3-4]，可以延长患者5年的生存期和提高局部肿瘤控制率，有较广的临床应用前景[5-6]。在临床上高能聚焦电流场消融技术手术主要集中用于宫颈炎、宫颈糜烂的治疗。为了进一步了解高能聚焦电流场对宫颈癌的治疗，需要进一步动物实验。
　　前期实验证实，高能聚焦电流场治疗仪4 mm直径的柱状治疗电极作用于肿瘤组织（90±2）s，仪器设定输出温度69℃，功率6 W可选择性杀伤肿瘤细胞，减少对正常组织的损害。本实验高能聚焦电流场消融技术手术中，小鼠生命体征平稳，治疗部位肌肉有短暂收缩反应，小鼠均能耐受，治疗电极1.2～1.5 cm范围内肿瘤细胞出现凝固性坏死。随时间延长，坏死细胞增多，炎性细胞浸润增多，肿瘤体积缩小，小鼠体重恢复，表面焦痂脱落未见瘤体。治疗电极外1.2～1.5 cm的正常组织，损伤后可在56 d内恢复。血管内的机化血栓对于电场覆盖不到的较大肿瘤的边缘区瘤细胞，有很好的补充杀伤作用[7-8]。荷瘤鼠术中及术后观察无任何远期副作用。
　　实验结果显示，高能聚焦电流场消融技术对宫颈癌移植瘤有杀伤及抑制效应，可以改善荷瘤小鼠生存状况，延长其生存期，损伤后修复良好，治疗比较安全。高能聚焦电流场治疗宫颈癌荷瘤鼠，与放疗、化疗、手术相比是种损伤相对较小的局部物理治疗宫颈癌的手段之一，期望临床中进一步研究、探讨，成为人类宫颈癌治疗方法之一。
　　[参考文献]
　　[1] Hyacinthe M，Jaroszeski MJ，Dand VV，et al. Electrically enhanced droug delivery for the treatment of soft tissue sarcoma [J]. Cancer，1999，85（2）：409-417.
　　[2] Mir LM，Glass LF，Sersa G，et al. Effective treatment of cutaneous and subcutaneous malignant tumours by electrochemotheray [J]. Br J Cancer，1998，77（12）：2336-2342.
　　[3] Moper HR，Delman KA. The role of hyperthermia in optimizing tumor response toregional therapy [J]. Hyperthermia，2008，24（3）：251-261.
　　[4] 周菊梅，唐劲天，廖遇平，等.不同温度热疗对宫颈癌Caski细胞坏死和凋亡的分析[J].中国微创外科杂志，2009，9（3）：255-257.
　　[5] Van -Rhoon GC. Cervical cancer： radiotherapy and hyperthermia [J]. Hyperthermia，2006，22（3）：229-234.
　　. Hyperthermia，2007，23（5）：443-450.
　　. Biol Chem，2004，279（22）：22964-22972.
　　[8] Chen N，Schoenbach KH，Kolb JF，et al. Leukemic cell intracellular responses to nanosecond electric fields [J]. Biochem Biophys Res Commun，2004，317（2）：421-427.