辛伐他汀对缺血再灌注损伤大鼠肾脏的影响机理

　[摘要] 目的 探讨辛伐他汀（Simvastatin）对肾缺血再灌注损伤（IRI）的保护作用。 方法 建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，随机将动物分为Simvastatin组，缺血再灌注（IR）组，锌原卟啉（ZnPP）组，假手术（sham）组。测定各组大鼠血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）的含量，并进行肾组织光镜形态学观察和免疫组化分析血红素加氧酶-1（HO-1）的表达情况。 结果 IR组和ZnPP组BUN、Cr值升高，HO-1的表达少或几乎不表达，肾组织结构紊乱；Simvastatin组除HO-1表达明显增多外，还显著逆转上述改变，组间差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 Simvastatin可上调HO-1的表达，减轻大鼠肾脏的IRI。
　　[关键词] 辛伐他汀；缺血再灌注损伤；血红素加氧酶-1
　　[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）10（a）-0012-03
　　肾脏在缺血再灌注（IR）过程中会严重影响其生理功能，如何减轻肾缺血再灌注损伤（IRI），成为目前研究的热点。细胞在受到应激刺激时，会启动内源性保护机制[1]， HO-1就是其中的一种方式[2]，它可被许多因素诱导而表达[3]。HO-1与IRI密切相关[4]，其分解血红素得到的产物中有重要的自由基清除剂及抗IRI因子[5]。关于他汀类药物的体外实验已经证实该药物能诱导平滑肌细胞中HO-1的表达[6]而发挥血管保护功能。在心、脑等器官的IR过程中，辛伐他汀（Simvastatin）能诱导HO-1高表达减轻其损伤[7-8]。本实验采用肾脏IRI大鼠模型，应用Simvastatin干预，观察其对肾脏IRI组织中HO-1表达以及肾脏组织炎症反应程度的影响，并探讨其可能的机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 动物选择及分组
　　健康雄性Wistar大鼠40只，体重（250±20）g。大鼠实验前适应饲养环境7 d后随机分四组：Simvastatin组、IR组、锌原卟啉（ZnPP）组、假手术（sham）组，每组各10只。
　　1.2 IRI模型制备
　　Simvastatin组术前给予Simvastatin 10 mg/（kg·d）灌胃7 d；IR组术前给予等体积生理盐水灌胃7 d；ZnPP组术前24 h 给予HO-1抑制剂ZnPP 5 mg/kg腹腔注射；sham组常规饲养。各组末次给药24 h后，全部大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠40 mg/kg予以麻醉，从腹正中行4 cm纵行切口打开腹腔，仔细分离右肾蒂及肾周筋膜，充分游离右侧肾脏后结扎右肾蒂并切除右肾；同法分离左侧肾脏肾蒂，充分显露左肾动脉及肾脏组织，除sham组外均用动脉夹夹闭左肾蒂45 min，再灌注左肾，观察左肾色泽由暗红色变为鲜红色，表明灌注成功。还纳肠管于腹腔原位并缝合切口，放回原饲养场所待自然清醒并自由饮食。
　　1.3 标本制备及检测
　　1.3.1 尿素氮、肌酐水平测定 再灌注24 h后，抽取下腔静脉血样约3 mL，10 000 r/min离心10 min，上清置于-20℃冰箱保存。AU400生化分析仪测量血BUN、Cr水平。
　　1.3.2 肾脏组织学观察及HO-1免疫组化测定 抽血后处死大鼠取左肾，用于组织学观察的肾组织按照切片制备要求处理并保存，然后按免疫组化三步法制备切片。结果判断：HO-1阳性反应为胞质呈棕黄色颗粒染色，采用病理图像分析软件半定量分析。
　　1.4 统计学方法
　　采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，三组间比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 各组大鼠血清尿素氮、肌酐水平比较
　　与sham组比较，另三组大鼠都有不同程度的肾功能损害（P < 0.01）；与IR及ZnPP组相比，Simvastatin组BUN、Cr值明显较低（P < 0.01）；ZnPP组肾功能损伤重于IR组（P < 0.01）。见表1。
　　2.2 各组大鼠肾脏病理变化的比较
　　取平展、细胞形态和组织结构清晰的组织切片，依据Paller法[9]可见，ZnPP组肾脏损伤最重，以管型形成、肾间质出血并炎性细胞浸润为主；除sham组外，Simvastatin组肾脏损伤最轻，仅见部分轻度水肿样变性，偶见管型及炎性细胞浸润。与sham组比较，各组肾小管评分均较高（P < 0.05）；与IR组相比，Simvastatin组肾小管评分明显降低（P < 0.05），表明Simvastatin的应用可减轻大鼠肾组织损伤。见表2。
　　2.3 各组大鼠HO-1表达水平比较
　　用半定量分析法，光镜下观察被染成棕褐色细胞的分布情况，无染色为0分，偶有染色为1分，局灶染色为2分，弥漫染色为3分。结果发现，ZnPP组HO-1几乎不表达，假手术组仅有微量表达，IR组呈局灶性表达，Simvastatin组HO-1表达最强。与sham组相比，另外三组HO-1表达差异均有统计学意义（P < 0.05）；Simvastatin组HO-1的表达高于其他组（P < 0.05），说明应用Simvastatin可以提高HO-1表达水平；应用ZnPP后，HO-1基本不表达。见表3。
　　3 讨论
　　他汀类药物又称HMG-CoA还原酶抑制剂，是经典和有效的降脂药物，已广泛应用于肾脏疾病的治疗。该类药物不仅具有降血脂的功能，而且还能保护肾脏，延缓肾脏疾病进展[10]。目前研究已证实在心脏、肝脏的IRI中，HO-1的高表达可有效地保护脏器的结构并改善其功能[11-12]。
　　Cr是肌酸的代谢终产物，而BUN是体内蛋白氮代谢的终产物，主要通过肾脏排泄，依据二者的含量变化可评估肾功能。本实验发现，肾脏IRI后大鼠血清Cr和BUN明显增高，而Simvastatin可以明显降低肾IRI大鼠血清Cr和BUN值。从光镜可以看到，单纯IR大鼠的肾组织切片中有肿胀明显的上皮细胞，该类细胞有程度不一的变性、坏死，间质可见明显充血水肿及炎性细胞浸润；相反Simvastatin组仅见轻度细胞肿胀，未见典型的缺血性改变。这些结果不仅说明本实验肾IRI模型建立成功，而且提示Simvastatin对急性肾IRI具有明显的保护作用。

　自20世纪80年代末发现HO-1并证实其具有和热休克蛋白32相同的结构后，引发了人们对HO-1作为应激反应蛋白新的认识。Stocker[13]发现在各种形式的氧化应激下HO-1均被诱导激活，于1990年提出这种酶可能对细胞起保护作用。大量实验研究表明，无论体内还是体外，HO-1是一种保护各种活性氧和活性氮所致氧化损伤的潜在抗氧化剂[14]。应用HO-1基因敲除的肾损伤动物模型，Nath等[15]证实，HO-1的表达是阻止肾小管间质炎症反应及炎症因子基因表达所必需的。笔者在本研究中除建立IRI模型外还应用HO-1抑制剂ZnPP作为对照进一步观察HO-1是否在肾IRI过程中发挥作用，ZnPP对HO-1的抑制主要是通过促进组织释放大量的微粒体血红素实现的。本实验发现，肾IRI作为应激原可诱导HO-1的表达，但并不能阻止肾脏损害的发生，如果在肾脏IRI前应用Simvastatin诱导HO-1表达，则可明显改善肾功能，减轻肾脏损害。本实验结果显示，sham组肾小球、肾小管结构基本正常，几乎无HO-1表达；IR组肾小管上皮细胞肿胀，出现不同程度的变性、坏死，HO-1表达较sham组显著增强；Simvastatin组缺血性改变较IR组明显减轻，接近正常，HO-1表达较高。Simvastatin使HO-1表达上调，可能是Simvastatin在转录和翻译水平上调肾缺血细胞HO-1的表达，从而使HO-1合成增加，使得肾脏对缺血及氧化损伤的抵抗能力增加，显著改善大鼠肾脏IRI。目前的研究报道显示，他汀类药物通过丝裂原活化蛋白激酶和核因子E2相关因子2等信号通路调节HO-1的表达[16]，但作为一种肾缺血再灌注的保护药物，在最佳剂量、安全性方面有待于进一步研究。
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