β—细辛醚通过PKA/CREB信号通路对快速老化痴呆小

　[摘要] 目的 研究β-细辛醚对快速老化痴呆小鼠大脑组织蛋白激酶A（PKA）、cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的影响。 方法 选取健康昆明小鼠10只作为对照组，30只快速老化小鼠被随机分为模型组（10只）、实验组（10只）、治疗组（10只）。对照组采用生理盐水灌胃，2 mL/次；实验组采用β-细辛醚混浊液灌胃，2 mL/次；治疗组采用脑复康水溶液5 mg/mL灌胃，2 mL/次；模型组采用生理盐水灌胃，2 mL/次。所有小鼠均每天灌胃1次，持续3周。3周后进行小鼠行为学测试，检测脑组织PKA、CREB酶改变及光镜和电镜下神经元细胞形态变化。 结果 实验组和治疗组与模型组相比，潜伏期明显缩短、在原平台停留时间延长，PKA、CREB 活性与模型组比较均明显增高，差异有统计学意义（P < 0.05）。光镜下观察实验组海马神经元损伤较轻，大部分细胞核清楚完整，电镜下核周隙清晰，细胞器清晰，神经纤维较丰富。 结论 β-细辛醚能提高快速老化痴呆小鼠知识记忆能力，影响PKA/CREB传导路径和突触结构，减少快速老化痴呆小鼠大脑组织神经元损伤，对快速老化痴呆小鼠有明显治疗作用。
　　[关键词] β-细辛醚；cAMP反应元件结合蛋白；神经元
　　[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）10（a）-0030-03
　　阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种神经系统退行性疾病，老年人多发，丧失生活能力，主要是在大脑海马区域出现淀粉样物质，即淀粉样β蛋白（amyloid β protein，Aβ），Aβ可以使组织产生大量自由基，干扰钙离子代谢，影响炎症反应，从而引起脑神经元发生改变，神经元功能也会发生改变，引起AD发生[1-2]，症状上表现学习和记忆障碍是最早出现的，目前国内外尚无特效药物进行治疗。石菖蒲挥发油是对机体中枢神经系统有保护作用有效成分， 其中β-细辛醚是石菖蒲挥发油的主要成分，β-细辛醚对机体自由基的产生有重要作用，是治疗神经系统的一种药物。β-细辛醚可促进氧自由基代谢，影响大脑学习和记忆能力。本文笔者通过将饲养动物分组后给予β-细辛醚探讨AD发病原因，且观察对老年痴呆小鼠PKA/CREB信号通路的影响作用和快速老化小鼠学习记忆能力影响，分析β-细辛醚药物作用机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 试剂与仪器 β-细辛醚购于武汉博士德生物工程有限公司，制成0.1 mg/mL混浊液，每天小鼠灌胃量是2 mL；PKA、CREB一抗、SP试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；DydatechMR4000型酶标仪购自SantaCruz公司，MPIAS-500病理图像分析系统由中国医学科学院药物研究所提供，其他均为国产分析醇试剂。
　　1.1.2 动物分组 选取健康昆明小鼠10只和快速老化小鼠30只，均为10个月大小、雄性、体重20～25 g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。健康昆明小鼠10只作为对照组，30只快速老化小鼠物随机分为模型组（10只）、实验组（10只）、治疗组（10只）。对照组采用生理盐水灌胃，2 mL/次；实验组采用β-细辛醚混浊液灌胃，2 mL/次；治疗组采用脑复康水溶液5 mg/mL灌胃，2 mL/次；模型组采用生理盐水灌胃，2 mL/次。所有小鼠均每天灌胃1次，持续3周。
　　1.2 方法
　　1.2.1 Morris水迷宫定位航行实验 实验小鼠灌胃3周后进行行为学测试，连续5 d，实验前1 d适应性训练，平台放在第一象限，其他3个象限将其放入水中，每天各测1次，在2 min内尚未找到平台，则将其放平台10 s；若120 s之内找到平台，则其在平台10 s，实验进行5 d。利用上台潜伏期代表实验小鼠的空间学习能力，采用Morrismicrosoft基础类应用程序纪录逃避潜伏期和游泳距离，两次潜伏期算术均值作为这一天成绩进行统计学分析，处理结果。
　　1.2.2 Morris水迷宫空间探索实验 实验小鼠进行空间探索试验是任选一个入水点将小鼠放入水池中进行试验，记录各组实验小鼠在规定的时间内游泳轨迹，考察各组实验小鼠对原平台记忆，选择任选一相同入水点将各组实验小鼠放入水池中，记录各组实验小鼠在实验进行2 min之内游泳路线，同时记录停留时间，并对其进行实验统计分析，处理结果。
　　1.2.3 PKA、CREB的测定 实验小鼠乙醚麻醉，断头取出含有海马组织的脑组织，福尔马林固定24 h，PBS洗涤，4℃保存12 h，梯度乙醇脱水，透明，浸蜡，石蜡包埋，切片组织厚度6 μm，采用海马组织分别测定PKA、CREB，37℃温箱孵育10 min，PBS洗涤，抗原修复10 min，正常羊血清37℃温箱孵育10 min，一抗（PKA、CREB为1 100）37℃温箱孵育1 h，PBS洗涤，二抗IgG-HRP加入后，37℃温箱孵育30 min，PBS洗涤，DAB显色液显色，PBS洗涤，苏木精染色，脱水，透明，封片，测定部位在海马区，使用病理图像分析系统测定吸光度值，计算阳性细胞数。
　　1.2.4 小鼠海马神经元形态学光镜观察 实验小鼠乙醚麻醉，断头处死，取出脑组织，沿冠状切面切下前囟尾侧2.2～4.3 mm的海马组织，福尔马林固定，PBS洗涤，4℃保存12 h，梯度乙醇脱水，透明，浸蜡，石蜡包埋，连续切片，切片厚7 μm，HE染色，光镜下观察拍照。
　　1.2.5 小鼠海马神经元形态学电镜观察 实验小鼠乙醚麻醉，打胸后心脏灌注固定液，快速取脑，分离海马，2.5%戊二醛预固定2 h、四氧化锇固定，梯度乙醇脱水，透明，浸蜡，石蜡包埋，连续切片，醋酸铀及枸橼酸铅双染色，电镜下观察拍照。
　　1.3 统计学方法
　　用SPSS 12.0统计软件处理分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果
　　2.1 Morris水迷宫定位航行实验和空间探索实验结果
　　Morris水迷宫实验中，模型组与对照组比较，平台潜伏期缩短，原平台停留时间缩短，差异有统计学意义（P < 0.05），说明模型稳定，可以用于实验研究。实验组、治疗组与模型组比较，潜伏期明显缩短，差异有统计学意义（P < 0.05），实验组、治疗组与模型组比较，原平台停留时间延长，差异有统计学意义（P < 0.05），提示β-细辛醚能改善快速老化小鼠的学习记忆能力、空间探索能力，增强小鼠的记忆力（表1）。
　　2.2 小鼠海马神经元PKA、CREB测定
　　小鼠海马神经元模型组与对照组比较，PKA、CREB 吸光度（A）数值明显降低，蛋白数量较少，差异有统计学意义（P < 0.05），表明模型组PKA表达减少， CREB信号表达减少。动物给药后实验组与模型组比较，PKA 表达增多，CREB信号表达增多，差异有统计学意义（P < 0.05），说明β-细辛醚对快速老化小鼠治疗有效（表2）。
　　2.3 光学显微镜观察小鼠海马神经元
　　倒置相差显微镜下观察，对照组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞清晰可见，细胞形状锥体形，细胞核清晰，细胞器丰富，可见明显的尼氏体，显示蛋白石合成旺盛（图1a）；模型组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞形态不规则，呈现多边形，细胞核较小，核仁不清晰，细胞整体损伤严重，细胞质中细胞器较少（图1b）；治疗组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞形状锥体形或、长梭形，细胞器部分可以看到（图1c）；实验组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞少量损伤，细胞边界较清晰，细胞形态较完整（图1d）。
　　2.4 电子显微镜观察小鼠海马神经元
　　对照组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞形状是锥体形，细胞器丰富，可见大量的粗面内质网，神经原纤维丰富、排列规则有序（图2a）。模型组则小鼠海马神经元脑组织锥体细胞损伤严重，细胞体积缩小，细胞核周边结构混乱，脂滴较多，细胞器较少（图2b）。治疗组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞结构清晰，细胞器清晰可见，线粒体丰富，异物颗粒较少（图2c）。实验组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞损伤较少，细胞结构较完整，神经原纤维较丰富，突触小泡较多（图2d）。
　　3 讨论
　　AD是一种临床常见的老年性记忆障碍疾病，由多种原因造成，国内外对于AD病因并不很清楚，AD的产生与大脑海马神经细胞淀粉样蛋白沉积、胆碱能神经纤维损伤、老年斑沉积形成、神经胶质细胞增生、化学性突触结构改变、突触密度丧失、神经递质和神经调质的生成减少等[3]有关。祖国传统医学认为AD的发生是脾肾亏虚，痰湿阻滞，痰浊淤血所致，治疗上以调节脾肾亏虚为主，痰浊淤血为辅。
　　AD动物模型首推SAM-P/8小鼠，该模型是日本京都大学竹田俊男教授开发的一种较理想的快速老化小鼠模型，SAM-P/8小鼠模型寿命较短、老化较快、海马神经元变性坏死、小鼠脑皮质萎缩等病理改变典型，老年性痴呆是小鼠的主要症状特征。本文应用β-细辛醚观察对快速老化SAM-P/8小鼠PKA、CREB蛋白表达影响，快速老化小鼠Morris水迷宫实验表明，β-细辛醚可明显改善SAM-P/8小鼠学习和记忆能力，模型组与正常组比较，寻找平台潜伏期长，差异有统计学意义（P < 0.05）。实验组能缩短寻找平台潜伏期，与模型组相比，差异有统计学意义（P < 0.05），说明β-细辛醚对SAM-P/8小鼠学习和记忆能力有所改善。
　　β-细辛醚还可以影响细胞Ca2+的代谢，通过刺激大脑海马神经元，细胞质内Ca2+浓度增加，导致第二信使cAMP浓度增加，激活蛋白质依赖的PKA磷酸化，磷酸化有活性的PKA能改善化学性突触结构功能改变[4-6]。活化的PKA可以磷酸化CREB 转录因子的转录，调节蛋白质表达，使各种信息可以长期保存，就会记住事件的发生过程。动物给药后实验组与模型组比较，PKA 表达增多，CREB信号表达增多，差异有统计学意义（P < 0.05），说明β-细辛醚对快速老化小鼠治疗有效果。β-细辛醚可增强PKA蛋白的表达量，来维持大脑海马神经元PKA/CREB这种特殊的信号通路传导。
　　光镜下对照组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞清晰可见，细胞形状锥体形，细胞核清晰，细胞器丰富，可见明显的尼氏体，显示蛋白石合成旺盛；模型组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞形态不规则，呈现多边形，细胞核较小，核仁不清晰，细胞整体损伤严重，细胞质中细胞器较少；治疗组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞形状呈锥体形或长梭形，细胞器部分可以看到；实验组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞少量损伤，细胞边界较清晰，细胞形态较完整，这些显示β-细辛醚可改善老年性痴呆痴呆模型中大脑海马神经元的病理特点，增强海马神经元的学习记忆能力，减弱老年性痴呆的症状。电镜下模型组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞损伤严重，细胞体积缩小，细胞核周边结构混乱，脂滴较多，细胞器较少。治疗组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞结构清晰，细胞器清晰可见，线粒体丰富，异物颗粒较少。实验组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞损伤较少，细胞结构较完整，神经原纤维较丰富，突触小泡较多，电镜照片显示β-细辛醚能减轻痴呆小鼠大脑海马神经元的损伤。
　　综上所述，β-细辛醚对老年痴呆的PKA/CREB信号通路有明显的改善作用，β-细辛醚能增强该信号通路的传导，达到治疗老年性痴呆的目的。
　　[参考文献]
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