骨折愈合过程中BMP2和TGFβ1mRNA的表达

　　【关键词】 骨形成蛋白

　　关键词: 骨形成蛋白;转化生长因子β;骨折愈合;凋亡;原位杂交;原位末端标记法

　　摘 要:目的 探讨骨折愈合过程中骨形成蛋白2(BMP2)，转化生长因子β1(TGFβ1)mRNA的表达与凋亡发生的相关性及意义. 方法 建立颌骨骨折模型，利用原位杂交方法检测骨折愈合的不同时期BMP2和TGFβ1mRNA的表达，同时采用TUNEL法检测细胞凋亡，并进行相关性分析. 结果 ①骨折愈合早期(5～11d)的间充质细胞、成骨细胞和软骨细胞内有BMP2mRNA表达，而TGFβ1mRNA主要在骨折愈合后期(11～14d)的成骨细胞和软骨细胞内表达;②细胞凋亡在骨折愈合的5d和11d最多，以间充质细胞和软骨细胞为主;③BMP2mRNA的表达与凋亡具有正相关(r=0.887，P<0.01)，TGFβ1mRNA的表达与凋亡无相关性(r=0.51，P>0.05). 结论 骨折愈合过程伴随凋亡的发生，以控制细胞的数量和清除无用的细胞，BMP2可能直接参与了凋亡发生过程.

　　Keywords:bone morphogenetic protein;transforming growth factorβ;fracture healing;apoptosis;in situ hybridization;TUNEL

　　Abstract:AIM To elucidate the correlation of bone mor-phogenetic protein2(BMP2)，transforming growth factorβ1(TGFβ1)mRNA expression and apoptosis during fracture healing and its S An experimental　model of fracture was established to detect the expression of BMP2，TGFβ1mRNA and apoptosis in the different stages of healing by using in situ hybridization and TUNEL S ①BMP2mRNA was expressed in mesenchymal cells，osteoblasts and chondrocytes on5～11d whereas TGFβ1mRNA in osteoblasts and chondrocytes on11～14d post-fracture;②the apoptotic cells increased markedly on5d and11d，especially in mesenchymal cells and chondrocytes;and③there was positive correlation between BMP2mRNA expression and apoptosis(r=0.887，P<0.01).TGFβ1mR-NA and apoptosis had no correlation(r=0.51，P>0.05).CONCLUSION Apoptosis is a normal concomitant of frac-ture healing serving the purposes of controling cell number and eliminating useless 2may participate directly in inducing the apoptotic process.

　　0 引言

　　骨折修复愈合包含了细胞趋化、聚集、增殖和分化等一系列复杂的组织变化，有许多生长因子参与了这一过程，如BMP，TGFβ，FGF等，它们在胚胎发育的细胞凋亡中也扮演了重要的角色[1，2] .细胞凋亡是一种主动死亡过程，涉及一系列基因的激活、表达和调控，近年来发现凋亡也参与了创伤修复的全过程[3] .为了了解生长因子与细胞凋亡的关系，本实验在建立颌骨骨折模型的基础上，利用原位杂交法观察BMP2和TGFβ1mRNA在骨折愈合不同时期的表达，同时利用末端脱氧核苷酸酶TdT介导的dUTP-X切口末端标记(TdT-mediated dUTP-X nick end labeling，TUNEL)法，检测细胞凋亡的发生，探讨BMP2和TGFβ1与凋亡的相关性以及在骨修复中的作用.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 pSP65-BMP2质粒由美国遗传研究所Wozney博士惠赠;DIG-DNA labelling and detection kit购自德国Boehringer Mannheim公司;TGFβ1寡核苷酸探针和TUNEL kit购自美国Oncogene Sci-ence公司.家兔骨折模型的建立、标本处理(骨折后1，3，5，7，11，14，21和28d取材)、探针标记及原位杂交等均参照以往方法进行[4] .正常骨作为对照. 1.2 方法 切片常规脱蜡至水，PBS(0.05mol L-1 ，pH7.5)洗5min，蛋白酶K孵育15min;PBS洗涤后，在30mL L-1 H2 O2 中孵育5min;PBS洗涤后擦干切片周围，加平衡buffer25μL，37℃孵育1min;擦干切片周围，加TdT酶25μL，37℃孵育2h后，加入37℃预热的中止buffer，37℃孵育30min，每10min更换中止buffer1次;显色过程同原位杂交.正常骨作为对照.利用10×10网格，在40×物镜下，每个时间点随机选取5个视野(向同一方向移动切片，不重复，不重叠)，分别对BMP2和TGFβ1mRNA及凋亡阳性细胞计数.

　　统计学处理:采用统计学软件SPSS8.0进行Spearman相关性分析.

　　2 结果

　　2.1 原位杂交检测 阳性细胞的胞质呈紫蓝色颗粒.骨折后1d，骨折断端及周围的BMP2和TGFβ1阳性细胞极少;3d，骨折断端骨膜内散在分布的间充质细胞呈BMP2阳性，而TGFβ1阳性细胞仍很少;5d，骨膜内BMP2阳性细胞数明显增加(Fig1)，而TGFβ1基本同前;7d，新生骨周围的成骨细胞及未分化间充质细胞呈BMP2强阳性表达，TGFβ1为弱阳性;11d，成骨细胞和软骨细胞内仍呈BMP2的阳性，但强度减弱，而TGFβ1的阳性细胞数和强度增加;14d BMP2的阳性信号强度和数量均明显降低，TGFβ1的阳性细胞数和强度仍较强(Fig2);21和28d二者阳性细胞数和强度均很低，与正常骨类似.

　　2.2 凋亡检测 阳性细胞的胞核呈紫蓝色颗粒.骨折后1d，血肿区内见少量凋亡细胞;3d，凋亡细胞增加;5d，骨折部位凋亡细胞明显增多，以间充质细胞为主;7d，在类似于发育的细胞凝聚区内凋亡细胞数增加，而新生骨小梁部位偶见凋亡细胞;11d，软骨区内细胞皱缩，见较多的凋亡细胞(Fig3);14d，凋亡细胞明显减少，在新骨内可见少量骨细胞呈阳性反应;21和28d，新骨处于改建更新过程，偶见个别成骨细胞发生凋亡，与正常骨接近并趋于一致.BMP2和TGFβ1mRNA及凋亡阳性细胞相关性分析表明，BMP2mRNA的表达与凋亡具有相关性

　　图1 -图3 略

　　3 讨论

　　细胞凋亡是同增殖、分化机制一起共同维持机体内环境稳定的重要因素，它为机体正常细胞的更新和异常细胞的清除提供了手段，特别是许多精细器官的胚胎发生(人胚肢芽、淋巴细胞成熟、神经系统发育等)，无一例外地包含着凋亡的机制.若凋亡过程被打乱，最终导致功能障碍或先天畸形.

　　骨组织的生长发育、代谢和重建也与细胞凋亡密切相关.骨折愈合时细胞增殖和凋亡是同时发生的，软骨痂内的软骨细胞通过凋亡清除，随后被骨组织所替代[5，6] .

　　细胞凋亡是由不同细胞(生长)因子所介导的死亡和生存信号之间的平衡来决定的.在骨基质中包含有多种细胞(生长)因子，它们对成骨细胞的生存和死亡起着重要的调控作用.如IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ，bFGF和胰岛素等促进成骨细胞的存活，而单核细胞因子和TNF-α等加速凋亡的发生.在骨折愈合和骨缺损修复期，这些因子可从骨基质内释放出来共同调节成骨细胞的存活或死亡[7] .C3H/HeJ系小鼠是一种Fas缺失突变体或Fas配体突变体，通过Fas介导的细胞凋亡缺陷来诱导免疫功能紊乱，将BMP植入该小鼠体内，新骨的形成量与野生鼠相比明显增加，表明凋亡可能在BMP的诱骨作用中发挥重要作用[8] .TGFβ具有诱导细胞发生凋亡的作用，但有细胞类型特异性，如能够诱导肝细胞、白血病细胞、破骨细胞发生凋亡，但却以剂量和时期依赖的方式抑制胚胎发育期指(趾)间细胞的凋亡，促使其向软骨细胞转化[1，9] .

　　表1 BMP2和TGFβ1mRNA及凋亡的阳性细胞计数　略

　　我们观察到，BMP2和TGFβ1mRNA在骨折愈合的不同时期表达，发挥各自的生物学作用.BMP2在早期骨诱导中发挥作用，TGFβ1促进后期骨质的形成和成熟.在骨折后5和11d，凋亡细胞明显增加.5d为骨折愈合的膜内成骨期，此时骨断端附近的细胞处于去分化状态，增殖明显.在细胞去分化达到高峰时，凋亡细胞也达到最多，提示细胞增生和凋亡这两个过程是协调发生的，而在细胞分化和成熟期，凋亡细胞数量也减少;11d处于软骨形成期，软骨细胞逐渐肥大退化，在这一时期无坏死的发生，而是通过凋亡使得无用的软骨细胞从损伤部位被有序清除，为以后的软骨骨化作准备.本研究表明，BMP2mRNA表达的时间和部位与凋亡的发生相一致，且具有显著正相关，而TGFβ1mRNA的表达与凋亡无相关性， 提示BMP2可能在骨折愈合凋亡的发生过程中发挥一定的作用.

　　骨折愈合过程中BMP2和TGFβ1mRNA的协同表达可以加速组织的修复，同时伴有细胞凋亡的发生，以控制细胞数量和及时清除失去功能的、无用的细胞，BMP2表达丰富的区域，细胞凋亡的敏感性和发生率增高，BMP2可能直接参与了诱导骨折愈合过程中凋亡的发生，其作用机制有待于进一步研究.

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