补肾祛瘀汤对子宫内膜异位症大鼠细胞凋亡的影

摘　要：目的：研究补肾祛瘀汤（BQT）对子宫内膜异位症（EMS）模型大鼠肿瘤坏死因子（TNF-α）及survivin蛋白的影响，探讨补肾祛瘀汤对EMS的疗效机理。方法：SD大鼠50只随机分为5组：正常组、模型组、补肾祛瘀汤组、孕三烯酮组、补肾祛瘀汤加孕三烯酮组，除正常组外其余均采用大鼠子宫内膜组织自体移植手术建立子宫内膜异位症模型，灌胃给药28 d后检测各组大鼠血清中和子宫内膜移植物局部TNF-α和survivin蛋白表达。结果：①与正常组相比，模型组大鼠血浆TNF-α显著升高，差异有统计学意义（P=0.004）；与模型组相比，西药组、中药组大鼠血清中TNF-α下降，差异有统计学意义（P=0.035，P=0.037）；中西结合组大鼠血清中TNF-α与正常组相比，差异有统计学意义（P=0.01）；②与正常组相比，模型组大鼠异位内膜中survivin蛋白的表达是显著上调的（P=0.005），与模型组大鼠相比，各个治疗组大鼠异位内膜中survivin蛋白的表达明显下降（P＜0.01），而西药组和中西结合组相比，EMS模型大鼠异位内膜当中survivin的含量差异有统计学意义（P=0.018，P＜0.05）。结论：补肾祛瘀汤对大鼠子宫内膜异位症具有治疗作用，其作用机制可能与增强异位内膜细胞的凋亡有关，运用传统中药治疗子宫内膜异位症更具优势。

关键词：补肾祛瘀汤；子宫内膜异位症；TNF-α；survivin蛋白；大鼠

 EMS虽是一种良性疾病，但是具有病变广泛、形态多样、极具侵润性、易形成严重粘连、易复发等特点，且在细胞增殖、凋亡、血管形成、侵袭性等方面与恶性肿瘤相似，现已成为一种常见病[1]。有研究表明，患有EMS 2年的复发率为21.5%，2～5年的复发率会增加至40%～50%[2]。补肾祛瘀汤（BQT）是国家名老中医姜松鹤老先生在临床中治疗本病疗效确切的经验方药，文章以子宫内异症模型大鼠为研究对象，应用酶联免疫吸附试验（ELESA）检测大鼠血清中肿瘤坏死因子（TNF-α）和SP免疫组化法观察异位子宫内膜当中survivin蛋白的含量，借以探讨BQT治疗EMS的作用机理。
1 资料与方法
1.1  一般资料：实验动物：清洁级9周龄成熟雌性未交配SD大鼠造模成功后随机分为5组：正常组、模型组、中药组（补肾祛瘀汤组）、西药组（孕三烯酮组）、中西结合组（补肾祛瘀汤加孕三烯酮组），10只/组，体重225～250 g，由大连大学实验动物中心提供，自然光照，常规饲养。主要药品和试剂：己烯雌酚：合肥久联制药有限公司；孕三烯酮胶囊：北京紫竹药业有限公司生产；TNF-α试剂盒、survivin免疫组化试剂盒：上海锐聪生物科技有限公司；补肾祛瘀汤方剂：由大连大学中药实验研究室制备，生药量1.4 g/ml。主要仪器：石蜡切片机：沈阳龙首电子仪器有限公司；全自动酶标仪：美国伯乐；正置荧光落射显微镜：日本nikon公司生产；高清晰度彩色病理图文报告分析系统：日本尼康公司。
1.2  实验方法
1.2.1 动物模型的制备[3]：SD大鼠除10只留作正常对照组外，其余适应性饲养1周后，于造模前24 h己烯雌酚（1 mg/kg，相当于人体10倍量）灌胃促情每只0.2 mg/4 ml，同时在造模后第3天开始给予低剂量己烯雌酚每天0.02 mg/kg，连续3 d。普通级环境饲养连续28 d后再次麻醉状态下打开腹腔，肉眼见异位病灶呈米粒大小之结节，切面可见一线性闭合水孔，异位内膜组织均形成囊状，囊内无色透明液体，或囊内形成串珠状，周围可见血管形成，表明造模成功。选取移植物有积液形成且积液高度≥2 mm者切取右侧腹壁移植物进行病理形态学观察。
1.2.2 实验分组及给药方法：造模成功后按组进行给药实验：正常组不予任何处置，常规饲养；模型组给予生理盐水灌胃；中药对照组： 补肾祛瘀汤28 g/kg，每天给药一次；西药对照组：孕三烯酮0.4 mg/kg，2次/周；中西结合组：补肾祛瘀汤1次/d，孕三烯酮2次/周，给药剂量同上两组；连续给药28 d后观察结果。
1.2.3 取材方法：取材前24 h予己烯雌酚0.2 mg/只灌胃以促使子宫内膜膨大，便于取材。末次给药24 h后于无菌状态下眼球取血1.5 ml，随后颈椎脱臼处死大鼠迅速剖腹采集异位内膜及在位内膜置于4%的多聚甲醛固定待测。
1.2.4 观察指标及测定方法：TNF：采用双抗体夹心ELISA法检测大鼠外周血清中TNF表达。Survivin：免疫组化法检测Survivin蛋白在大鼠异位内膜组织中的表达：将固定好的内膜组织于石蜡包埋，连续切片，厚约4 μm。切片常规二甲苯脱蜡梯度乙醇水化后采用SP法进行染色，实验过程严格按说明书进行操作；阴性对照用PBS代替一抗，阳性对照为已知阳性切片。鼠抗人survivin多克隆抗体工作浓度为1:150。
1.2.5 结果判定：survivin蛋白主要为胞浆和胞核表达，将免疫组化切片于正置荧光落射显微镜400倍下盲法观察，免疫荧光显微镜—专业高清晰度彩色病理图文报告系统分析软件（该系统由同一人在同一条件下操作）自动检测测阳性细胞，镜下于不同的区域随机取5个不同的视野根据光密度的大小将阳性细胞显色深浅分级不显色或显色不清为阴性（-）；浅黄色为弱阳性（+）；棕黄色为中度阳性（++）；深褐色为强阳性（+++）。
1.3  统计学方法：采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，计量资料结果以均数±标准差（ ）表示，组间比较采用单因素方差分析，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1  各组EMS大鼠血清中TNF-α含量比较：正常组血清中TNF-α含量为（14.40±1.12）pg/ml；与正常组比较，模型组大鼠和补肾祛瘀汤加孕三烯酮组血清TNF-α显著下降，分别为（12.06±0.55）pg/ml（12.32±2.28）pg/ml，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，孕三烯酮组、补肾祛瘀汤组大鼠血清中TNF-α下降，分别为（10.40±2.46）pg/ml，（10.37±1.48）pg/ml，差异有统计学意义（P＜0.01），补肾祛瘀汤组和孕三烯酮组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.2  各组EMS大鼠异位内膜组织中survivin蛋白表达：survivin蛋白在正常组大鼠子宫内膜中几乎是不表达的，而在模型组和3个治疗组当中是高表达的。与正常组相比，模型组大鼠异位内膜中survivin蛋白的表达是显著上调的，与模型组大鼠相比，各个治疗组大鼠异位内膜中survivin蛋白的表达明显下降（P＜0.01），中药组和西药组大鼠异位内膜中survivin的表达差异无统计学意义（P=0.67，P＞0.05），表明我们所运用的BQT在对EMS疗效方面与传统西药孕三烯酮相比是相同的。详见表2。
表2  BQT对E MS大鼠异位内膜survivin蛋白表达的影响