小檗碱对人鼻咽癌CNE 2细胞内钙含量的影响

【关键词】 右江民族医学院附属医院肿瘤科，广西百色 533000

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　　研究表明，小檗碱对鼻咽癌细胞有明显的抑制作用［1］。细胞内线粒体参与了肿瘤细胞增殖、凋亡的过程，线粒体的功能与线粒体膜的通透性即跨膜电位差密切相关。有实验证实［2］，细胞内大量钙离子储存于线粒体内，钙离子在诱导细胞凋亡中起重大作用。本研究小檗碱作用于体外培养的人鼻咽癌cne2细胞，观察cne2细胞内钙离子浓度水平变化，探讨小檗碱对鼻咽癌cne2瘤株抑制的分子机理。

　　材料和方法

　　1.药品

　　小檗碱由本院自行采集， rpmi1640 培养基为 gibcobrl产品；其余试剂均为国产分析纯。钙离子荧光指示剂：fluo3/am为sigma公司产品，用二甲基亚砜(dmso)配成1.0 mm浓度。

2.细胞株

　　人鼻咽癌cne2 细胞株购自中科院上海生命科学院细胞库，本院传代保存。

3.方法

(1)细胞培养:cne2细胞株常规培养于含10%胎牛血清的 rpmi1640 完全培养液（青霉素 100 u/ml，链霉素 100 u/ml，谷氨酸 30 μg/ml）置37℃， 5%co2、饱和湿度中培养，所有实验均在细胞处于对数生长期进行。

(2)生长抑制实验［1］：取对数生长期细胞，用完全培养液调整细胞数为 1×106个/ml，接种于 96 孔板， 24 h后分别加入终浓度为：20 mg/l，40 mg/l的小檗碱，同时设置空白对照组（加实验组等体积培养液做对照），每组6复孔。药物作用48 h后，进行流式细胞仪检测。

(3)细胞内钙离子含量测定：①ieca测定方法［3］：用不含ca、mg的磷酸盐缓冲液(pbs)2 ml漂洗细胞2次（1000转/分，5分钟），弃上清后，用pbs稀释，调节cne2细胞数为6×105/ml配成细胞悬液。取两支5 ml试管，第1支加细胞悬液490 μl和10 μl 1.0 mm的fluo3/am液；第2支仅取500 μl细胞悬液，不加fluo3/am液，两支试管均在37℃条件下孵育30分钟，用无ca2+pbs缓冲液洗涤细胞2次，最后加500 μl无ca2+pbs缓冲液待检。②cne2细胞内钙离子(ieca2+)的流式细胞定量检测:应用facscalibur型流式细胞仪(美国bd公司生产)。每份标本(包括fluo3/am染色管和无fluo3/am染色管)均收检2万个cne2细胞。激光源为488 nm氩离子激光，取数之点图x轴取前向散射(fsc)y轴取侧向散射(ssc);以组方图检测荧光强度:荧光素fluo3强度为x轴、y轴为细胞数。③荧光散射强度fl3h以对数(log值)放大,计算机存储检数据。检测条件(包括染色时间、浓度、温度及电压等)保持稳定。以cellquestplot软件(bd公司生产)分析每例样品fluo3/am染色管或无fluo3/am染色管cne2细胞荧光强度(平均道数值)，得出每例ieca含量(以细胞内钙离子指数表示ieca2+):

ieca2+＝受fluo3/am作用后cne2细胞荧光强度平均道数无fluo3/am作用cne2细胞荧光强度平均道数×1000

　　结 果

　　20 mg/l、40 mg/l小檗碱对人鼻咽癌细胞cne2作用后细胞内钙离子浓度变化，经小檗碱处理cne2细胞内钙离子含量增多,与空白组比较有非常显著性差异(p＜0.01)。见表1。表1 小檗碱对人鼻咽癌cne2细胞作用后细胞内钙离子浓度变化（略）注：与空白组比较，※p＜0.01

　　讨 论

　　小檗碱对很多肿瘤细胞生长、繁殖有抑制作用，对鼻咽癌细胞有明显的抑制作用［1］，但作用的分子机制尚不清楚。离子钙是细胞内外ca2+唯一的生理活性形式，作为细胞内反应的第二信使，在细胞的生理调控中起着重要的作用。线粒体参与了肿瘤细胞增殖、凋亡的过程。在肿瘤细胞凋亡早期，线粒体首先出现形态改变，同时它参与细胞呼吸、氧的代谢、酶活性和能量供应。这些功能与线粒体膜的通透性即跨膜电位差密切相关。线粒体以一种独特的方式调控着与细胞凋亡有关的因子如钙离子等。线粒体释放这些因子可抑制或促进细胞凋亡，因此，被认为是凋亡调节中心［4］。细胞内大量钙离子储存于线粒体内，钙离子在诱导细胞凋亡中起着主要作用［2］。

　　本研究显示，小檗碱可上调鼻咽癌细胞cne2内ieca2+含量，提示小檗碱通过改变细胞内钙离子的变化影响线粒体的功能，参与肿瘤细胞增殖、凋亡的过程，其他参与小檗碱抗鼻咽癌cne2细胞增殖和促凋亡机制有待深入研究阐明。

【参考文献】
　　［1］罗彪，韦启后，梁谨,等.小檗碱对人鼻咽癌细胞生长的抑制作用［j］.右江医学,2006,34(4):373-374.

　　［2］fernandez mc,bick sis suppression by bcl-2 is correlated with the regulation of nuclear and cytosolic ca2+［j］.oncogene,1996,129110:2259-2265.

　　［3］尹格平，郝天羽，袁玮,等.妊高征患者外周血红细胞内钙含量测定及其临床价值［j］.中国优生与遗传杂志，2001，9（2）：20-23.

　　［4］罗菲君，胡智，曹亚，等.茶多酚诱导鼻咽癌cyclin d1表达下调［j］.癌症，2001，20（4）：358-362.

作者：罗彪，梁谨，黄世庆，黄冰，侯双雁，黄嵩峰作者单位：右江民族医学院附属医院肿瘤科，广西百色 533000