CGGBP1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

　　0引言

　　脆性x综合征（fragile x syndrome, fxs）是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的fxs是由脆性x智障基因1（fragile x mental retardation, fmr1）中5′端非编码区cgg三核苷酸重复序列不稳定扩增及其cpg岛异常甲基化导致. fmr1基因的表达产物fmrp的缺乏导致fxs的发生［1-2］. 本实验对编码基因存在于3号染色体［3］，能与fmr1 基因5′ d (cgg)n3′重复序列特异性结合的蛋白cggbp1进行原核表达，并对其dna结合活性进行研究.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　大肠杆菌dh5α, bl21（ de3）和表达载体prset a均为本实验室保存. 质粒提取试剂盒购自sigma公司； 限制性内切酶bamh i和kpni购自宝生物工程公司；t4 dna连接酶购自promega公司； ni2+nta金属螯合蛋白质纯化系统购自qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司.

　　1.2方法

　　1.2.1表达载体的构建

　　根据cggbp1基因起始密码子和终止子邻近序列设计pcr引物：cggbp1f cgc gga tcc gag cga ttg tag taa cag ca，cggbp1r ggg gta cct caa caa tct tgt gag ttg ag. 其上游及下游引物分别加入bamhi和kpni酶切识别位点序列(引物序列下划线部分). pcr反应以人淋巴细胞cdna文库为模板，扩增编码cggbp1的基因序列. 设计pcr扩增体系25 μl，灭菌去离子水10 μl，10×反应缓冲液2.5 μl，25 mmol/l mgcl2 2.0 μl，dmso 2.5 μl，4× dntp混合物（每种2.5 mmol/l）2 μl，cggbp1f和cggbp1r各10 pmol，模板3.5 μl（50 ng/μl）， taq dna（5 μ/μl）聚合酶0.5 μl. 扩增条件：95℃预变性5 min，再94℃ 30 s， 53℃ 1 min，72℃ 1 min循环40次，最后72℃终末延伸产物10 min. pcr产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因. 用bamhi和kpni酶切pcr产物和prset a，酶切产物电泳后回收，在ｔ4连接酶作用下，目的片段定向克隆至prset a的bamhi和kpni克隆位点. 将重组质粒转入大肠杆菌dh5α，接种到含氨苄青霉素的lb培养基平板并挑取单菌落.

　　1.2.2融合蛋白的诱导表达

　　将测序正确的重组质粒转入bl21（ de3）. 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/l氨苄青霉素的lb培养基中， 37℃振荡培养12 h， 按10 ml/l比例转接于新鲜培养基，37℃振荡培养至对数生长期时，加入iptg至终浓度1 mmol/l，32℃诱导振荡培养4 h，离心收集菌体，sdspage分析重组蛋白的表达.

　　1.2.3蛋白表达形式的分析

　　取5 ml菌液离心，用500 μl的裂解液（10 mmol/l 咪唑，300 mmol/l nacl及50 mmol/l磷酸二氢钠 ph 8.0）重悬，加溶菌酶至终浓度为1 mg/ml，冰浴30 min，超声波裂菌，离心后分别将上清和沉淀进行sdspage分析.

　　1.2.4融合蛋白的纯化

　　将1 ml 500 ml/l ni2+nta悬液和4 ml细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min，直接过柱. 过柱结束后，用4 ml漂洗液（20 mmol/l 咪唑，300 mmol/l nacl及50 mmol/l 磷酸二氢钠 ph 8.0），洗脱未和ni珠结合的杂蛋白. 经过2次漂洗后再用0.5 ml洗脱液(250 mmol/l 咪唑，300 mmol/l nacl及50 mmol/l 磷酸二氢钠 ph 8.0) 3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集. 取收集液，进行sdspage分析.

　　1.2.5cggbp1与（cgg）29重复序列双链dna结合

　　实验取10 μl磁珠用1 ml的无rna酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂. 1×生物素亲和素结合缓冲液（10 mmol/l trishcl，2 mol/l nacl，1 mmol/l edta，1 g/l tween 20）15 μl重悬磁珠，各5 μl分3组实验. 其中一组加入25 μl（100 ng/μl）生物素化的（cgg）29重复序列双链dna，另外两组分别加入25 μl（100 ng/μl）非生物素化的（cgg）29重复序列双链dna和25 μl三蒸水做对照；三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μl，25℃轻摇1 h. 经磁力吸附后，弃上清. 重复上述步骤3次；加入纯化后cggbp1（500 μg/ml）15 μl 和2×核酸蛋白结合缓冲液（20 mmol/l hepes，100 mmol/l nacl，0.5 mmol/l dtt，100 g/l甘油）20 μl，室温下静置30 min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10 μl，沸水煮10 min，进行sdspage分析.

　　2结果

　　2.1原核表达载体的构建及鉴定

　　扩增产物在15 g/l的琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条约504 bp的条带（图1）； 重组质粒prset a/cggbp1及质粒prset a分别用bamhi和kpni酶切，prset a/cggbp1分为两个片段，分别为2.9 ku和504 bp（图2），均与预计结果相同.

　　2.2cggbp1的表达

　　用bamhi和kpni双酶切prset a/cggbp1表达质粒，筛选阳性重组质粒. 携带有prset a/cggbp1质粒的 bl21(de3)菌株，经iptg诱导后，在mr 约25 000处出现1条表达条带；而未经iptg诱导的菌体则无此条带. 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解，离心后分为上清和沉淀两部分. 经sdspage分析表明，cggbp1部分存在于细菌裂解液的上清中，为可溶性蛋白，上清液中的目标蛋白相对较少（图3）.

　　2.3cggbp1蛋白纯化

　　在表达质粒prset a多克隆酶切位点的上游， 插入有连续6个组氨酸的序列 —(his )6 tag. 重组质粒经诱导表达后，(his )6 tag可以和外源插入片段共同表达. 利用(his )6 tag 和金属ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方法，是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方法. sdspage显示，cggbp1得到较高程度的纯化（图4）.

　　2.4cggbp1与5′d（cgg）293′重复序列

　　双链dna结合实验生物素化的5′d（cgg）29 3′重复序列双链dna被固定到链酶亲和素磁珠上，非生物素化的5′d（cgg）293′重复序列双链dna因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉. 同理，加入cggbp1后，未和5′d (cgg）293′重复序列双链dna结合的蛋白也被洗脱（图5）.

　　3讨论

　　关于微卫星的产生机制，普遍认为是dna复制过程中dna聚合酶的滑动［4］，或dna复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失. 已发现微卫星可能是一种非常活跃的碱基序列，通常各种简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域，这个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强. 这些区域在核糖体rna基因中非常复杂，同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合，成为“染色质折叠密码”［5-6］，参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程. 脆性x综合征是igarashi等［7］研究报道的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种. 该蛋白只和（cgg）n重复序列发生特异性结合，而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合［8］. 因此，对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义.
　　
　　本实验成功地构建了含cggbp1的重组质粒，以可溶性蛋白形式获得较高表达. 通过ni2+nta柱纯化，获得纯化的目标融合蛋白质，同时证明了该蛋白能和人fmr1基因5′d (cgg)293′重复序列双链dna特异性结合. 这将为进一步开展真核生物蛋白cggbp1功能的研究和阐释cgg三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础.

【参考文献】

　［1］wells rd, warren st. genetic instabilities and hereditary neurological disorders ［m］. academic press, san diego,1998:46-96.

　　［2］cleary jd, nichol k, wang yh, et al. evidence of cisacting factors in replicationmediated trinucleotide repeat instability in primate cells［j］. nat genet, 2002, 31(1)：37-46.

　　［3］deissler h, wilm m, genc b, et al. rapid protein sequencing by tandem mass spectrometry and cdna cloning of cggbp1［j］.biol chem, 1997,272(27):16761-16768.

　　［4］sinden rr, potaman vn, oussatcheva ea, et al. triplet repeat dna structures and human genetic disease: dynamic mutations from dynamic dna ［j］. bioscience, 2002,27(1 suppl 1):53-65.

　　［5］wahls wp. meiotic recombination hot spots: shapping the genome and insight into hypervariable minisatellite dna change［j］.curr top dev bio1, 1998,37:37-75.

　　［6］wahls wp, moore pd. recombination hotspot activity of hypervariable minisatellite dna requires minisatellite dna binding proteins［j］.somat cell mol genet, 1998,24(1):41-51.

　　［7］igarashi s, tsuji s. the molecular mechanisms of the instability of the cag repeat［j］. nippon rinsho,1998,56(4):1064-1073.

　　［8］deissler h, behnkrappa a, doerfler w. purification of nuclear proteins from human hela cells that bind specifically to the unstable tandem repeat (cgg)n in the human fmr1 gene［j］. biol chem, 1996,271(8):4327-4334.