重组蛋白F3Restin生物学活性的初步研究

【摘要】 目的：表达有生物学活性的新型融合蛋白f3restin，并纯化、鉴定，探讨f3restin融合肽的生物学活性。方法：在20℃、10h的条件下，iptg诱导融合表达载体pet32a(+)f3restin原核表达、纯化，得到分子量约为40kd的高纯度的可溶性蛋白f3restin，检测与huvec的亲和活性，cam试验检测抗血管活性。结果：重组蛋白f3restin具有特异结合血管内皮细胞的能力，并能抑制新血管的生成。结论：初步表明新型融合蛋白f3restin仍具特异结合血管内皮细胞，抑制新血管生长的能力。

【关键词】 f3restin蛋白;融合表达;抗血管生成

通过抑制或破坏肿瘤新生血管形成及生长，切断肿瘤的给养途径，可以有效达到控制肿瘤生长和转移的目的，folkman[1]1972年提出的这一“抗肿瘤新生血管形成”的设想已然成为当今癌症治疗研究的热点[2，3]。编码人类高迁移组蛋白2(hmgn2)n端31个氨基酸的f3肽能将其携带的噬菌体或绿色荧光蛋白特异性靶向肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞[4]，因此可以利用f3肽作为靶向肿瘤的药物载体用于肿瘤的靶向治疗。1999年，ramchandran[5]首先克隆并表达了人胶原xv的c末端非胶原结构域(nc10 domain of α1 chain of collagen type xv)，并将其命名为restin，此肽段由180个氨基酸组成。序列分析表明，restin与内皮抑素(endostatin)同源，可靶向抑制血管内皮细胞的迁移和生长。我们采用亚克隆技术已经构建人f3restin基因的融合表达载体pet32a(+)f3restin，并成功表达可溶性的目的蛋白[6]。本实验将进一步研究此种新型融合肽f3restin靶向肿瘤新生血管和抗肿瘤血管生长的活性及作用机理。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 质粒、菌株及细胞株 大肠杆菌dh5α、bl21(de3) 由本实验室保存, pet32a(+)载体购自merck公司，人脐静脉内皮细胞huevc由重庆医科大学组胚教研室提供，人正常肝细胞l02由重庆医科大学肝炎所提供。

　　1.1.2 主要试剂 iptg购自takara公司，异硫氰酸荧光素(fitc)及其他主要试剂为sigma公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 f3restin表达及表达产物的纯化、鉴定 用1.0mmol/l的iptg于20℃、10h诱导已经转化pet32a(+)f3restin的大肠杆菌bl21(de3)表达，经ni2+nta 琼脂糖树脂亲和层析纯化，透析去盐，得到分子量约为40kd的高纯度的蛋白[6]。western blotting鉴定, bradford 法对纯化的蛋白定量。

　　1.2.2 异硫氰酸荧光素(fitc)标记蛋白及与血管内皮细胞亲和活性的测定 将人脐静脉内皮细胞(huvec)、人正常肝细胞(l02)分别接种于放有放有薄的盖玻片的24孔板中，24h贴壁后换液，加入异硫氰酸荧光素( fitc) 标记的纯化后的f3restin，24h后取出盖玻片，用磷酸盐缓冲液( pbs) 冲洗3 次，于荧光共聚焦显微镜下观察fitc标记的蛋白在细胞的分布并照相。

　　1.2.3 f3restin抗血管活性检测 采用鸡胚绒毛膜尿囊膜试验(cam)。取9d龄受精鸡胚，蛋壳上开口，分别以浸有6μg f3restin和6μl pbs的1cm2无菌滤纸小块贴于鸡胚绒毛膜尿囊膜上，37℃，培养48h，剥开蛋壳，去除滤纸，光学显微镜下观察6组鸡胚绒毛膜尿囊膜上血管生成情况。

　　2 结 果

　　2.1 重组蛋白f3restin的鉴定 经iptg诱导表达、ni2+nta 琼脂糖树脂亲和层析纯化，透析去盐，得到的分子量约为40kd的高纯度的蛋白[6]。通过western blotting鉴定(见第91页彩色图版ⅳ之图1)。

　　2.2 与人脐静脉内皮细胞(huvec)亲和活性 fitc 标记的蛋白与huvec、l02 细胞共培养后，于荧光显微镜下检测显示，重组蛋白f3restin高选择性的靶向huvec细胞, 而对照组l02细胞几乎检测不到荧光(见第91页彩色图版ⅳ之图2)。

　　2.3 抗血管活性 鸡胚绒毛膜尿囊膜(cam)试验结果显示：对照组血管呈叶状生长，加pbs后，血管密度无降低;而重组蛋白f3restin实验组加样后能明显抑制鸡胚绒毛膜尿囊膜血管生成(见第91页彩色图版ⅳ之图3)。

　　3 讨 论

　　目前用于蛋白标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocynate,fitc)或罗达明(lissamine rhodamine b200, rb200)。在碱性条件下fitc的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的蛋白仍保持相应的结合能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测[7]。实验中，fitc保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解;fitcdmso液要临用时配制，碳酸盐缓冲液要新鲜配制。此外，加入标记蛋白的量一定要适当。本实验中，经过条件优化，在200μl的培养液中加入10μl的f3restin，可以得到比较理想的结果。

　　鸡胚绒毛膜尿囊膜(cam)试验是肿瘤学和病毒学常用的一种实验技术。最先由fraser用来有关新血管生成的研究[8]，并已有很多相关的报道[9，10]，是研究药物抗血管生成简单有效的模型。cam是一种体外呼吸器官，随胚龄增加而加大，毛细血管生成增加，变化极其丰富。cam法作为研究体内血管效应的一项实用性技术，具有实验材料易得、操作简便、实验周期短、经济、结果易于观察、不需特殊设备等优点，所以我们采用此方法测定f3restin融合肽的生物学活性。

　　重组蛋白f3restin是f3肽和restin肽由一段6个甘氨酸组成的柔性片段连接而成。f3肽几乎能与所有被测试的肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞高选择性地结合。动物实验表明，兔子静脉注射hmgn2后，在体内能定向分布到hl60 和 mdamb435 的肿瘤生长部位[4]。restin是血管生成抑制肽，通过抑制新血管的生成，阻断肿瘤细胞的营养供应，抑制肿瘤细胞的生长。本文的目的就是要检测重组蛋白f3restin是否仍然具有对肿瘤血管的高选择性及抑制肿瘤新血管生成的活性。生物学活性试验初步表明我们的基因工程表达产物f3restin，仍具有靶向血管内皮细胞的活性，具有显著抑制体外培养的内皮细胞增殖及体内抗新血管生成活性，为进一步研究融合蛋白f3restin的功能及作用机理奠定了基础,有望开发出更安全、更有效的抗肿瘤生物制剂。

【参考文献】
[1] folkman angiogenesis：new concept for therapy of solid tumors[j]. ann surg ，1972，175：409416.

　　[2] 刘都户，张学庸，黄裕新，等.血管内皮生长因子的表达和血管生成与人胃癌移植瘤生长的关系[j].中国肿瘤生物治疗杂志，2001，8(1)：1719.

　　[3] 王若宁，刘玲玲，张一呜，等.血管生成抑素的原核表达及多克隆抗体的制备[j].中国肿瘤生物治疗杂志，2001，8(1)：1012.

　　[4] kimmo p， pirjo l， jason a， et al. a fragment of the hmgn2 protein homes to the nuclei of tumor cells and tumor endothelial cells in vivo[j]. pnas ， 2002，99(11)：74447449.

　　[5] ramchandran rj，dhanabal m，volk r，et al. antiangiogenic activity of restin，nc10 dom ainof human collagen xv：comparison to endostatin[j]. biochem biophys res commun，1999，255：735739.

　　[6] 刘洋，曾昭淳. 人f3restin基因的克隆与表达[j]. 长江大学学报(自然版)医学卷， 2009，6(3)：1113.

　　[7] wang ww， das d， tang xl， et al. antigen targeting to dendritic cells with bispecific antibodies[j]. immunol methods，2005，306(12)：8092.

　　[8] ellis em， stalker al. experimental angiogenesis in the chorioallantoic membrane[j]. bibl anat，1979， 18：2527.

　　[9] gould j， aramburo c， capdevielle m， et al. angiogenic activity of anterior pituitary tissue and growth hormone on the chick embryo chorioallantoic membrane: a novel action of gh [j]. life sci， 1995，56(8)：587594.

　　[10] griffoni c， spisni e， santi s， et al. knockdown of caveolin1 by antisense oligonucleotides impairs angiogenesis in vitro and in vivo [j]. biochem biophys res commun， 2000， 276(2)：756761.