HPLC法同时测定八号烧伤膏中大黄素、大黄酚和大

【摘要】 　　目的 建立高效液相色谱法同时测定八号烧伤膏中大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量。方法 采用高效液相色谱法，以agilent tc-c18（250 mm×4.6 mm，5μm）为固定相；以甲醇-0.1%磷酸（85∶15, v∶v）为流动相；流速为1.0 ml·min-1；柱温为25℃；检测波长为254 nm。结果 大黄素在16.4～82.0μg·ml-1 (r=0.9999)，大黄酚在17.60～90.00μg·ml-1(r=0.999 9)，大黄素甲醚在16.16～80.80μg·ml-1(r=0.9999)范围内线性关系良好；平均加样回收率分别为101.40%、99.88%和99.74%；相对标准偏差分别为2.48%、2.28%和1.93%。结论 该方法简便、可靠、准确，可作为八号烧伤膏的质量控制方法。

【关键词】 高效液相色谱法 大黄素 大黄酚 大黄素甲醚 八号烧伤膏

　　simultaneous determination of the contents of emodin，chrysophanol and physcione in bahao burn slurry via hplc

　　gong peng，chen zhen，xu dujuan

　　department of pharmacy, the first affiliated hospital of anhui medical university, hefei 230022，china

　　［abstract］ objective to establish a method for the determination of the contents of emodin，chrysophanol and physcione in bahao burn s the measurement conditions used were as follows: agilent tc-c18 (250 mm×4.6 mm,5μm)column; mobile phase: methanol-0.1％phosphoric acid (85:15,v:v); flow rate:1.0 ml·min-1;column temperature:25℃;detection wavelength:s the linear ranges of emodin,chrysophanol and physcione were in 16.4-82.0μg·ml-1(r=0.9999)，17.60-90.00μg·ml-1(r=0.9999)and 16.16-80.80μg·ml-1(r=0.9999) , respectively. the average recoveries were 101.40%，99.88% and 99.74% ；and rsd were 2.48%,2.28% and 1.93%;sion the determination method is simple, accurate, reliable, and it can be used for quality control of bahao burn slurry.

　　［key words］ hplc; emodin; chrysophanol; physcione; bahao burn slurry

　　八号烧伤膏是我院特色中药制剂，组方中有大黄、地榆炭、五倍子等中药，具有清热燥湿、解毒疗疮、收敛生肌等功效，临床主要用于治疗ⅰ-ⅱ度烧伤、烫伤等，效果显著［1］，但是对于该制剂的质量控制方面的研究至今仍处于空白。为规范本品的生产,有效地控制该产品的质量及保证药效,本课题组对该制剂进行了质量控制方面的初步研究。本实验在文献报道的基础上，采用高效液相色谱法，分别对方中主药大黄的三种指标成分大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量同时进行了测定，为合理制定该制剂的质量标准和申报医院制剂批准文号提供了实验依据。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器

　　waters高效液相色谱仪（600泵，2487检测器，millennium 32工作站），bp 211 d电子天平(德国塞多利斯公司)，syz-b石英亚沸高纯水蒸馏器（江苏环宇科学仪器厂），hh-s型水浴锅(巩义市英峪予华仪器厂)，kq 3200 db型超声清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司)。

　　1.2 试药

　　八号烧伤膏（安徽医科大学第一附属医院制剂中心生产，批号：081019、090323、090714）；含量测定用对照品均购自中国药品生物制品检定所，批号分别为：大黄素（110756-200110）、大黄酚（0796-200208）、大黄素甲醚（0758-200610）；甲醇为色谱纯；水为二次重蒸水；磷酸、盐酸、三氯甲烷等试剂均为分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件及系统适用性试验

　　色谱柱：agilent tc-c18（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱温：25 ℃；检测波长：254 nm；流动相：甲醇-0.1％磷酸（85∶15，v∶v）；流速：1.0 ml·min-1；进样量 20 μl。理论板数以大黄素、大黄酚、大黄素甲醚计算均不低于 5 000，3个活性成分与相邻峰之间分离度均大于 1.5，对称因子在 0.95～1.05 之间。

　　2.2 对照品溶液的制备

　　精密称取五氧化二磷减压干燥的大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇分别制成1 ml 含大黄素、大黄酚、大黄素甲醚各0.2 mg左右的溶液；分别精密量取上述对照品溶液1.0 ml至50 ml量瓶中，混匀，即得。

　　2.3 供试品溶液的制备

　　精密称取八号烧伤膏剂约0.5 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25 ml，称定重量，超声，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 ml，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液用三氯甲烷提取3次，每次10 ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

　　2.4 专属性试验

　　按处方比例制成缺大黄阴性八号烧伤膏制剂，按“2.3”项下方法制备缺大黄阴性样品溶液，精密吸取上述对照品、供试品、阴性样品溶液各20 μl，照“2.1”项下色谱条件测定，结果阴性对照液在各个对照品保留时间位置上均未见干扰。对照品溶液、缺大黄的阴性样品溶液、样品溶液hplc见图1。

　　2.5 线性关系考察

　　精密量取含大黄素（0.205 mg·ml-1）、大黄酚（0.220 mg·ml-1）、大黄素甲醚（0.202 mg·ml-1）的混合对照品溶液1.0 ml,分别置50 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇勺，0.45 μm微孔滤膜滤过，分别精密吸取上述对照品液4,8,12,16,20μl,注入液相色谱仪，按“2.1”项下的色谱条件测定，以进样浓度（μg·ml-1）为横坐标，对峰面积为纵坐标进行线性回归，其回归方程及线性范围如下：

　　大黄素： a=35379.8 c-7058.8，r =0.9999，16.4-82.0 μg·ml-1；

　　大黄酚：a= 97283.9 c-19843.7，r=0.9999，17.60-90.00 μg·ml-1；
　
　　大黄素甲醚：a=21703.0 c-3862.8，r=0.9999，16.16-80.80 μg·ml-1。

　　2.6 精密度试验

　　精密量取标准品溶液20 μl，连续进样5次，测定大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积，计算其相对标准偏差(rsd)。大黄素、大黄酚和大黄素甲醚rsd值分别为1.20%、1.09%和1.01%。

　　2.7 稳定性试验

　　取标准品溶液分别在第0、2、4、8、16、24 h按“2.1”项下色谱条件测定，测定样品中大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积，计算其相对标准差值。大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的rsd值分别为1.54%、1.07%和1.49%，试验结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

　　2.8 重复性试验

　　取同一批号八号烧伤膏样品，平行制备5份供试品溶液，按上述色谱条件测定大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的峰面积并计算其相对标准偏差。大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积rsd值分别为 2.09%、1.87%和1.75%。

　　2.9 回收率试验

　　精密称取已知含量的样品（含大黄素0.228 mg·g-1、大黄酚 0.288 mg·g-1和大黄素甲醚 205 mg·g-1）6 份,每份约 0.3 g，分别精密加入一定量的大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品，按“2.3”项下方法制成溶液，按上述色谱条件测定，计算回收率。平均回收率分别为101.40%、99.88%和99.74%；rsd值 分别为2.48%、2.28%和1.93%；具体结果见表1。表1 加样回收率试验结果（略）

　　2.10 样品测定

　　取3批八号烧伤膏按“2.3”项下方法制备，每批样品2份，精密吸取供试品溶液20 μl，按照上述色谱条件测定并计算含量，具体结果见表2。表2 3批八号烧伤膏样品含量（略）

　　3 讨论

　　八号烧伤膏由大黄、地榆炭、五倍子等中药组成，其中大黄为主药之一。大黄含有游离的蒽醌类衍生物如大黄素、大黄酚、大黄酸等,它们对多种病毒和细菌具有抑制和杀灭作用［2］， 所以，制剂中大黄有效成分含量的高低是其质量好坏的重要标志之一。大黄中蒽醌类成分含量测定方法文献报道较多，色谱条件及制备方法也有多种多样，但是多采用单一成分含量测定。 中药是典型的复杂体系，对其的质量控制也是中药现代化的瓶颈之一，中药质量控制要体现中药整体、辨证的特点。随着中药质量控制技术的进展，测定中药或复方中的单一成分已不能满足全面控制中药制剂的质量要求，多成分含量测定则能够更进一步的控制中药质量。由于大黄中大黄素、大黄酚和大黄素甲醚3种蒽醌类成分含量均较高，故本实验选择以上3 种蒽醌类成分作为含量测定的指标成分，对八号烧伤膏的质量进行研究。在本实验研究过程中，参照文献报道的色谱条件［3,4］和中国药典2005年版一部［5］大黄项下样品制备方法，同时对3种蒽醌类成分进行定量测定，试验结果表明该方法可行，分离度较高，可作为八号烧伤膏的质量控制方法。

【参考文献】
　　［1］ 陈镇.中药八号膏治疗热水袋烫伤21例报告. 安徽医学，2006，27(5)：429.

　　［2］ 余玖霞，吴超，丁宁，等.抗菌抗病毒大黄素型蒽醌类成分提取分离技术的研究与应用.亚太传统医药,2009,5(1):42-45.

　　［3］ 胡晋娟，凌向阳.hplc测定清泻丸中大黄素、大黄酚的含量.广西中医学院学报，2009,12(1):53-54.

　　［4］ 唐洪梅，李得堂，闫雪，等.hplc同时测定疗筋涂膜剂中5种大黄成分的含量.中国现代应用药学杂志，2009,26 (5):409-411.

　　［5］ 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典.一部.北京：化学工业出版社，2005:17.