香烟焦油对小鼠急慢性毒性实验研究

【摘要】 目的：观察香烟焦油对小鼠的急、慢性毒性作用。方法：提取香烟中的焦油，小鼠40只，分为染毒组，乙醇组和生理盐水组作对照，腹腔注射法(1次/d)染毒，连续4 d，观察小鼠活动情况并记录。4 d后，处死小鼠，取胸骨骨髓常规制片，观察骨髓pce 细胞微核发生率。另取60只小白鼠，方法相同，连续观察小鼠30 d活动情况，最后1 d解剖,观察小鼠内脏各器官颜色、体积等改变。结果：急性毒性实验小鼠出现活动能力下降、尿失禁等现象，而慢性毒性实验小鼠出现体重下降、皮肤松弛、活动减少、尾部溃疡等症状，解剖后可观察到染毒内脏各器官肺、肝、肾、胃肠道颜色、体积等改变。小鼠骨髓细胞微核表明，香烟焦油可诱导微核形成，与对照组比较差异有统计学意义(p<0.05)。结论：香烟焦油对小鼠有较强的毒性作用,可能会对人体产生相应的危害。

【关键词】 香烟焦油;慢性毒性;嗜多染红细胞;微核;小鼠

　　abstract：objectiveto observe the acute and chronic toxicity effects of cigarette tar in extracting the tar in cigarettes，40 mice were divided into tar exposed group，ethanol exposed group and normal saline group as control which were by intraperitoneal injection (1 time / day) for 4 days，the activities of the mice were 4 days，the mice were killed，bone marrow of the sternum were made producers to observe micronucleus incidence of the bone marrow pce ing the same way，another 60 mice were used，after 30 days of continuous observation，all the mice were disected to observe color，size，etc of visceral sacute toxicity in mice showed the exposed mice activity dropping，urinary incontinence;chronic toxicity experiment showed the exposed mice body weight loss，skin relaxation，reduction in activity，ulcers of the tail，and other symptoms，color，size visceral organs including lung，liver，kidney，gastrointestinal tract after anatomy were uclei of bone marrow cells in mice showed that cigarette tar could induce micronucleus formation，compared with the control group were significantly sioncigarette tar has strong toxic effects in mice，may have the human body produce corresponding damages.

　　key words:cigarette tar;chronic toxicity;pce;micronucleus;mice

　　香烟中含有尼古丁、烟焦油、氢氰酸、醛等多种化学物质,成分十分复杂,估计含3 500多种化合物[1],且许多物质已证明具有致癌、致畸和致突变的作用。烟气中焦油是威胁人体健康的罪魁祸首，而烟焦油中的多环芳烃(polycyclic aromatic hydro2carbons,pa hs)是主要的致癌物质之一。苯并芘(bp)是香烟中pa hs的代表物,是导致人类肺癌的重要的化学致癌物。pa hs进入体内后,可在一系列酶的作用下,形成终致癌物与生物大分子发生共价结合,从而干扰细胞的正常机能,引起恶性肿瘤，烟焦油中的酚类及其衍生物则是一种促癌物质。促癌物质本身虽不能改变细胞的遗传结构，但能刺激被激发的细胞，导致癌瘤发展[2]。本研究旨在通过小鼠急慢性毒性实验，观察香烟焦油对小鼠各系统(中枢、骨骼肌、呼吸、心血管、消化系统等)产生的毒性作用。从而考察香烟焦油对人体产生的危害,为吸烟引起的相关疾病的发病因素和发病机制提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 试验动物：健康昆明种雄性小白鼠150只,体重25～35 g,由嘉兴学院医学院动物提供中心提供。以标准颗粒饲料,自由饮水。室温(20±2)℃,湿度40%～60%,采用12 h∶12 h明暗光照,定时通风。

　　1.1.2 仪器与试剂：由市场购得某牌过滤嘴香烟,烤烟型,焦油量17 mg、烟气烟碱量112 mg,索氏提取器,蒸发皿。

　　1.2 方法

　　1.2.1 提取香烟焦油：将3支烟蒂装入事先卷好的滤纸，放入脂肪提取器的套筒中，在75 ml 95%的乙醇中连续加热虹吸2.5 h。待多次发生虹吸(脂肪提取器中的溶液接近无色时)后，停止。分别记录第一次虹吸的时间和最后一次的时间，总共虹吸6次。最后把装置改为蒸馏装置，记录蒸馏的时间，馏头：77℃，蒸出大部分乙醇，再用25%乙醇75 ml溶解残留物[3]。

　　1.2.2 急性毒性试验：取小鼠40只，焦油组分成低、中、高(分别是1倍、2倍、3倍原溶液)三个剂量组，对照组(乙醇组和生理盐水组)，按0.25 ml腹腔注射染毒，连续染毒4 d，1次/d，观察小鼠的活动情况，并及时记录小鼠的反应。

　　1.2.3 微核试验：在进行急性小鼠毒性染毒4 d后，第5天剖杀，用颈椎脱臼法处死小鼠,取胸骨骨髓常规制片，观察骨髓pce细胞微核发生率。微核的判断标准:①微核形态为圆形或椭圆形,边缘光滑整齐;②直径<主核的1/3。与主核完全脱离;③嗜色性与主核一致或略淡。统计处理采用t检验。记录具有微核以及核异常的红细胞数,以百分率表示，即为微核与核异常细胞率之和为总核异常率。运用spss统计软件对结果进行分析,多组比较采用最小显著差法(lsd)和最小显著极差法(snk)进行多组间多重比较。

　　1.2.4 慢性毒性试验：取60只小白鼠进行称重，分为三组：分别为焦油组，乙醇对照组、生理盐水组，编号记录。染毒组1次/d，腹腔注射香烟焦油0.25 ml;对照组1给予25%乙醇0.25 ml;对照组2则给予相同剂量的生理盐水0.25 ml，为期30 d，60只小鼠给予相同饲养条件。仔细观察并记录小鼠每天注射前后性情、活动频率和行动速度等各方面的改变。每周定期称量各组小鼠的体重[注射液剂量计算：按人和小鼠体重之比(2 000∶1)，假设人每天吸烟20支，算出小鼠每天吸0.01支，再根据染毒所配制溶液的浓度3支/75ml,0.25ml稀释液即含0.01支香烟[5]]。30 d之后，解剖小鼠，观察并记录内脏各器官颜色、体积等改变。

　　2 结果

　　2.1 急性毒性试验表现：腹腔注射香烟焦油，可观察到低剂量组小鼠出现活动频率加快、异常兴奋等症状;高剂量组小鼠则活动能力下降，部分出现尿失禁，侧躺不能翻身等现象。低、中、高三个香烟焦油组对小鼠急性中毒的表现：低剂量组：活动频率增加，异常兴奋，部分小鼠竖尾，方向感较差，中枢神经、神经肌肉系统受累;中剂量组：活动能力下降，趴伏在桌上，部分小鼠有旋转， 中枢神经、神经肌肉系统受累尿失禁现象，胆碱能神经受累;高剂量组：侧躺，不能自行翻身，待4～5 min后恢复，四肢抽动，呼吸频率加快，胸式呼吸，部分小鼠有尿失禁，中枢神经、血管系统受累，心肺循环障碍，胆碱能神经受累。对照组小鼠注射乙醇和生理盐水后表现正常，无上述中毒表现。

　　2.2 微核试验：香烟焦油组的微核发生率与阴性对照组相比差异均有统计学意义(p<0.01)，说明香烟焦油可以引起香烟引起细胞的遗传损伤作用，见表1。表1 香烟焦油对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响注：染毒组与对照组比较，①p<0.01

　　2.3 慢性毒性试验表现：腹腔注射香烟焦油，进行小鼠慢性毒性染毒，染毒组小鼠出现体重下降、皮肤松弛、活动减少，尾部有溃疡等症状，对照组小鼠在染毒前、后变化不大，染毒组小鼠的体重改变大于对照组，差异有统计学意义(p<0.05)，见表2。表2 染毒组与对照组小鼠在染毒前后的体重变化注：染毒前后比较：①p<0.01

　　2.4 肉眼观察：染毒结束后解剖小鼠，观察到内脏各器官肺、肝、肾、胃肠道颜色、体积等发生改变。香烟焦油对小鼠的慢性中毒的表现：焦油组：咖啡色肺叶体积较小、褐色(色泽较深，且暗淡无光)、颜色较浅、皮质较白、肠蠕动减慢或消失、肠壁较薄、较小;生理盐水和乙醇组：暗红色、粉红(色泽较浅有光泽)、肺叶体积较大、颜色较深、皮质较红、肠蠕动正常、肠壁较厚(4～5次/min)。乙醇组和生理盐水组肉眼观察基本相同。

　　3 讨论

　　本实验通过小鼠急慢性毒性染毒和小鼠骨髓微核染毒观察香烟焦油对小鼠的毒性作用，进而推断其对人体的毒性作用。小鼠的急性毒性染毒表明，染毒小鼠表现为活动频率增加，方向感变差，共济失调。这与香烟中的焦油类物质超过了呼吸系统自身的净化作用，附着在肺泡的表面影响血液与肺泡之间的气体交换，导致血氧量下降，使肌细胞缺氧，机体活动的耐力下降有关[7]。慢性小鼠毒性染毒小鼠出现体重下降，皮肤松弛、活动减少等症状。染毒组小鼠体重每周相对增长，幅度变化较对照组显著减慢，这是因为被动吸烟有兴奋交感神经的作用，它抑制消化道运动和消化腺分泌，造成胃的排空延长和小肠吸收功能障碍，导致对食物的厌恶，致使实验组体重净增长量小，周体重的增长量与吸入的烟量成反比关系[8]。慢性毒性染毒表明，染毒小鼠肺部呈褐色，有不同程度的黑色斑块，一部分小鼠的尾巴有溃疡形成。由此可见，香烟焦油对肺、肝脏有不同程度的危害。其受累程度不断加深，可见香烟中的焦油成分是引起慢性支气管炎、肺气肿、肺炎、肺癌、冠心病的重要因素。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验(mnt)是目前最常用的遗传毒理学试验[9]，它的遗传学终点是观察染色体或有丝分裂器损伤后在未完全成熟的红细胞中形成的微核[10]。由于其测定结果与染色体畸变率有很好的一致性，测定方法比较简便、可靠，近年来已成为筛选和鉴定化学致突变物的一种常用方法[11]。对生物体有害的物质往往都会造成遗传物质的损伤而成为诱变剂，用遗传物质受损程度判断有害物质的毒性是当前灵敏度相当高的常规手段，而相应判断一种物质是否有减毒作用(即抗诱变作用) 则看该物质能否减少诱变物质对遗传物质的损伤。据此原理本实验以出现微核的小鼠骨髓嗜多染红细胞频率为指标,检测香烟焦油的毒性作用。本次实验中，小鼠骨髓微核染色染毒表明香烟焦油染毒组微核发生率明显高于对照组，结果发现在所取样本中，见表1，说明香烟焦油有一定的致突变作用。各受试物组小鼠中微核细胞率均比阴性对照组明显升高，说明各受试物对小鼠遗传物质有不同程度的损伤作用。与对照组比较，香烟焦油组差异有统计学意义(p<0.05)。暗示香烟焦油的致畸作用，会对人体健康造成潜在的危害。而香烟焦油致突变的具体机制还有待进一步研究。

【参考文献】
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　　[3] 吴 源,吴庆四.香烟烟雾水溶物对小鼠的急性毒性和骨髓嗜多染红细胞微核率的影响[j].海峡预防医学杂志，2006，12(3)：11.

　　[4] 孙 波，张桂荣,兰 莉，等.100种香烟毒性快速检测及毒性分析[j].中国初级卫生保健杂志，2007，10(4)：110.

　　[5] 李延兰,丰慧根,孙 璐,等.高温与香烟联合对小鼠骨髓细胞微核的影响[j]. 新乡医学院学报,1998，15 (2)：108.

　　[6] 赵贤四，熊振虹，廖 晖，等.香烟烟雾提取物的成分分析及遗传毒性研究[j].中国公共卫生学，1997，16(5)：213.

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　　[8] 曹 能，敖新宇.葛根在减少烟焦油诱发小鼠骨髓细胞微核的研究[j].云南师范大学学报，2004，16(2)：104.

　　[9] 赵保路，谢卫华.吸烟、自由基和癌[j].自然杂志,1989，12(2)：453.

　　[10] 陆宝玉，王厚德.三种卷烟的成分及其对健康的影响[j].卫生研究 ，1990，19(2) ：18.

　　[11] 郑行建，田晓文.被动吸烟对小白鼠及后代的影响[j].陕西师范大学学报，2007，6(35)：150.