重组血小板糖蛋白Ibα活性片段在CHO细胞中表达

【摘要】 目的：建立表达重组糖蛋白ibα活性片段（rgpibαh1v289）细胞株，并且纯化其表达产物，研究其生物学功能。方法：利用脂质体将含有编码gpibαh1v289 的dna质粒pcmv3转染cho细胞。用亲和层析法纯化重组片段。用sdspage和western blot鉴定纯化产品的纯度和免疫学活性。用血小板聚集法检测纯化产品对瑞斯托霉素诱导血小板聚集功能的影响。用elisa测定纯化产品对vwf与血小板结合能力的影响。结果：每1 l培养上清液可纯化到6.15 mg rgpibαh1v289重组产品。sdspage显示，纯化的重组片段主要在42 kd处显一蛋白区带，western blot显示，抗gpibα单抗sz2能与重组片段在42 kd处显单一蛋白区带。纯化重组片段能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能。elisa测定显示纯化产品抑制血浆vwf与血小板的结合能力。结论：cho细胞株a1能恒定表达rgpibαh1v289，重组片段具有较高的纯度、免疫学活性和生物学活性，有可能开发为有效的抗血栓药物。

【关键词】 cho细胞 重组糖蛋白ibα 表达 纯化

　　study of expression in chinese hamster ovary cells and function of recombinant active fragment of glycoprotein ibαh1v289

　　zhao yiming,shao bojing,dong ningzheng，shen fei，ruan changgeng.

　　jiangsu institute of hematology, the first affiliated hospital of soochow university, suzhou 215006, china

　　［abstract］ objective:to study the biological function of glycoprotein protein ibα, a cell line expressing recombinant active fragment rgpibαh1v289 was constructed and purified fragment was acquired to research its s:the cho cells were transfected with plasmid pcmv3 including gpibαh1v289 dna by recombinant fragment was purified with affinity chromatography column. the purity and immune activity of purified products were identified with sdspage and western blot respectively. the effect of rgpibαh1v289 on the platelet aggregation function was detected with platelet aggregation assay. the effect of purified product on binding activity between plasma vwf and platelet was measured with s:6.15 mg recombinant fragment in culture supernatants per liter could be purified with affinity chromatography. the recombinant fragment formed a main lane at the position of 42 kd with sdspage and could react with monoclonal antibody sz2 by western blot. it could inhibit the platelet aggregation induced by ristocetin and inhibit binding activity between plasma vwf and sion:cho cell line a1 can express rgpibαh1v28 stably and the recombinant fragment which has high purity, immune activity and biology activity, can be a potential antithrombosis drug.

　　［key words］ chinese hamster ovary cells；recombinant glycoproteinibα；express；purification

　　在正常生理条件下，循环中的血小板彼此之间不会发生聚集或黏附于内皮细胞上。当内皮细胞损伤后，vw因子(von willebrand factor, vwf)介导血小板与内皮下胶原结合，并与血小板膜上的受体gpib/ⅸ和gpiib/iiia结合，产生血小板活化信号，促使血小板在损伤的部位黏附，加速血小板聚集，起到初期止血的功能。gpibix受体复合物有3条肽链组成，由gpibα(mr 143 kd)和gpibβ(mr 22 kd)通过二硫键结合，再与gpix（mr 20 kd）通过非共价键连接［1］。血小板膜糖蛋白ib(gpib)是血小板膜上最主要的糖蛋白之一，gpib主要有两个功能：①vwf受体功能：在初期止血过程中，血小板上gpib与vwf相互作用是一个重要因素，血小板黏附于血管内皮细胞主要通过vwf的a1区结合于血小板上gpibα氨基末端分子量45 kd的片段(氨基酸1～290)来发挥止血功能［2］。②凝血酶受体功能：凝血酶是人体内最重要的生理性血小板活化剂之一，而gpib是血小板表面凝血酶主要受体之一，凝血酶和vw因子一样结合于gpibα氨基末端45 kd片段内（氨基酸239～299），因此重组gpibα（rgpibα）45 kd功能片段的表达，具有巨大的理论和应用价值［3］。

　　本研究拟在中国仓鼠卵巢（cho）细胞内获得恒定表达高水平的rgpibα活性片段（his1val 289，rgpibαh1v289，mr 42 kd），rgpibαh1v289在cho细胞是高度糖基化且属于分泌型蛋白，因此在cho培养上清液内能大规模地培养、生产和纯化，获得的产品以期能特异地抑制血液中vwf与血小板结合，为寻找抗血栓药物提供新的方向［4］。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株、菌种和质粒 中国仓鼠卵巢（cho）细胞、大肠杆菌tg1、m25由本室保存；质粒pcmv3(编码gpibα h1v 289)由比利时deckmyn h.教授惠赠［4］。

　　1.1.2 试剂 抗人vwf单抗sz34和抗gpibα单克隆抗体sz2由本室生产［5］；2d4由比利时deckmyn h. 教授惠赠［6］；lipofectamine 2000、dmem和g418为gibco公司产品；protein gsepharose4b亲和层析柱、cnbr活化的sepharose4b凝胶和fplc为pharmacia公司产品；hybondc硝酸纤维素膜购自amersham公司；丙烯酰胺、双丙烯酰胺和瑞斯托霉素为sigma公司产品；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 cho细胞的转染和转基因工程细胞株的筛选［7］ 含编码gpibα h1v 289 dna质粒pcmv3经lipofectamine转染cho细胞后，以600 mg/l g418，10%胎牛血清的dmem培养转染细胞以筛选抗性克隆，待抗药克隆长出后扩大培养。同时继续用600 mg/l g418以筛选恒定表达的转染细胞，并检测上清液中rgpibαh1v289的表达量。

　　1.2.2 免疫放射法（ira）测定cho培养上清液中rgpibαh1v289的表达量 用抗血小板gpibα单克隆抗体sz2igg作为包被抗体10 mg/l，100 μl/孔，4℃过夜。第2天用pbs吐温20洗板3次，封闭后，每孔加入100 μl细胞培养上清液，37℃反应2小时，同上洗板3次后，加入125i标记的抗血小板gpibα单克隆抗体2d4（125i2d4），每孔加入脉冲数1×105 cpm/0.1 ml，37℃反应1小时,同上洗涤6次后，在γ免疫计数仪上测定结合的脉冲数（cpm）。

　　1.2.3 cho工程细胞株克隆化及大批量培养 g418筛选到阳性cho抗药克隆经检测确证分泌rgpibαh1v289蛋白后，以有限稀释法进行克隆化，将克隆化生长状态良好、高表达rgpibαh1v289的细胞扩大培养，以5%小牛血清完全培养基37℃培养，收获上清-70℃保存备用。

　　1.2.4 rgpⅰbαh1v289表达产物的纯化 收集表达rgpibαh1v289培养上清液，经超滤浓缩后又经sz2iggsepharose4b亲和层析柱纯化，结合的rgpibαh1v289蛋白用ph 2.8 glyhcl缓冲液洗脱，收集的蛋白用1 mol/l tris调ph 7.4［8］。

　　1.2.5 12%sdspage鉴定亲和层析纯化的rgpibαh1v289纯度。

　　1.2.6 western blot测定纯化产品免疫活性 纯品和血小板溶解液经12%sdspage电泳后，将蛋白转移到硝酸纤维薄膜上，2%牛血清白蛋白封闭后，经sz2单抗37℃保温2小时后，gamhrp酶标二抗，37℃保温1小时后，氯萘酚显色反应。

　　1.2.7 纯化产品对瑞斯托霉素或adp诱导血小板聚集功能的影响 枸橼酸抗凝健康正常人全血，低速离心分离富含血小板血浆（prp），取20 μl rgpibαh1v289加入180 μl prp中，37℃孵育5分钟，加入终浓度为1.25 g/l瑞斯托霉素或2 μmol/l adp诱导血小板聚集，血小板聚集仪检测聚集结果。

　　1.2.8 纯化产品对血浆vwf与血小板结合能力的影响 血小板包被在酶标板（每孔5×105）上，4℃过夜，固定后，用tbs（0.05 mol/l trishcl, 0.15 mol/l nacl,0.1%吐温20,ph 7.4）洗涤3次，封闭后，每孔加入50 μl混合血浆（tbs稀释1∶8）和50 μl含有瑞斯托霉素的 rgpibαh1v289（浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625和0 mg/l），37℃孵育90分钟后，同上洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记的抗vwf单抗sz34，37℃孵育90分钟后，同上洗涤6次后，opd显色后，测定490 nm处的光吸收值a490。

　　2 结果

　　2.1 ira法测定阳性克隆细胞株上清中rgpibαh1v289表达量 经ira法检测转染cho细胞培养上清液，获得一株高表达rgpibαh1v289蛋白的基因工程细胞株命名为a1。

　　2.2 亲和层析柱纯化rgpibαh1v289产品 基因工程细胞株a1扩大培养后，收集上清液经超滤浓缩后，上亲和层析柱，每1 l培养上清液中可纯化得到6.15 mg rgpibαh1v289纯品。

　　2.3 sdspage和western blot鉴定纯化产品的纯度和免疫学活性 经12%sdspage电泳鉴定，纯化产品主要在42 kd处显一蛋白区带，见图1，产品纯度达90%以上；western blot显示，抗gpibα单抗sz2能与纯化的产品在42 kd处显单一蛋白区带，见图2，说明纯化的表达产品具有较高的纯度和免疫学活性。

　　图1 12%sdspage鉴定纯化rgpibαh1v289产品的纯度（略）

　　fig.1 identification of the purity of rgpibαh1v289 with 12%sdspage

　　note:lane ;lane αh1v289 purification(2.5 μg).

　　图2 western blot鉴定纯化rgpibαh1v289产品的免疫学活性（略）

　　fig.2 identification of the immune activity of rgpibαh1v289 with western blot

　　note:lane ;lane αh1v289(0.2 μg)+sz2 mcab;lane et lyse+sz2 mcab.

　　图3 rgpibαh1v289对瑞斯托霉素和adp诱导的血小板聚集试验的影响（略）

　　fig.3 the effects of rgpibαh1v289 on platelet aggregation induced by adp and ristocetin

　　note:ris:rgpibαh1v289 inhibit the platelet aggregation induced by ristocetin;a.0.15 mol/l nacl,50 mmol/l trishcl+1.25 g/l ristocetin;b.8.17 mg/l rgpibαh1v289+1.25 g/l ristocetin. adp:rgpibαh1v289 does not inhibit the platelet aggregation induced by adp;c.0.15 mol/l nacl,50 mmol/l trishcl+2 μmol/l adp;d.8.17 mg/l rgpibαh1v289+2 μmol/l adp.

　　图4 rgpibαh1v289对血浆中vwf与血小板结合能力的影响（略）

　　fig.4 the effect of rgpibαh1v289 on binding activity between plasma vwf and platelet

　　2.4 纯化产品对血小板聚集功能影响 实验显示纯化产品能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能，当产品终浓度为8.17 mg/l时，其血小板聚集抑制率为86.7%，但纯化产品不抑制adp诱导的血小板聚集功能，见图3，说明纯化的表达产品具有较高的生物学活性。

　　2.5 rgpibαh1v289对血浆vwf与血小板结合能力的影响 elisa实验显示rgpibαh1v289抑制血浆内的vwf与血小板的结合能力，见图4。随着重组片段浓度增高，vwf与血小板结合能力下降，说明纯化的表达产品具有较高的生物学功能。

　　3 讨论

　　gpibα是血小板膜上含糖量最多的糖蛋白，糖含量超过总分子量的60%，其糖成分在gpibα功能上有重要作用，因此为了保持rgpibα功能的完整性，我们选择在真核细胞cho细胞内表达rgpibαh1v289，并且表达的活性片段属于分泌型蛋白，释放到培养的上清液中，成为可溶性蛋白，大量培养后，收集其上清液进行分离纯化。

　　血小板上gpibα是血栓形成过程中的的一个重要蛋白，在初期止血阶段发挥着重要作用。血管损伤后内皮下胶原或内皮下基质暴露，血小板黏附于血管内皮下基质主要通过vwf的a1区结合于血小板上 gpibα氨基末端分子量45 kd的片段上，然后通过信号传递使血小板聚集，最终导致血栓形成。因此，阻断vwfa1区与血小板gpibα结合可抑制血小板的黏附和聚集，从而抑制血栓形成。因此表达42 kd重组活性片段rgpibα h1v289具有巨大的理论和应用价值。

　　1991年murata等［9］在哺乳动物细胞内成功地表达了含有可与vwf结合的gpibα（his 1～302）片段，kitaguchi等［10］证实此重组片段具有与vwf结合活性，并且在体外证实其能增强血小板的功能。arya等［11］证实，在gpibα与vwf结合区上第2个富含亮氨酸的重复区，在gp ibα与vwf结合中起着关键作用。

　　本研究结果表明pcmv3质粒经lipofectamine 2000转染cho细胞，经g418筛选和ira法检测，获得1株高表达rgpibαh1v289蛋白的基因工程细胞株a1。细胞株a1培养上清液经超滤浓缩后，经sz2iggsepharose4b亲和层析柱纯化，每1l培养上清液中可纯化得到6.15 mg rgpibαh1v289纯品。纯化rgpibαh1v289产品经12%sdspage电泳鉴定，该产品主要在42 kd处显一蛋白区带，产品纯度达90%以上；western blot显示，抗gpibα单克隆抗体sz2能与纯化的产品在42 kd处显单一蛋白区带，说明纯化产品具有较高纯度和免疫学活性。血小板聚集实验显示，rgpibαh1v289产品能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能，当rgpibαh1v289产品终浓度为8.17 mg/l时，其血小板聚集抑制率为86.7%；elisa实验显示rgpibαh1v289产品能抑制血浆内的vwf与血小板的结合能力，表明rgpibαh1v289产品能与血浆中的vwf的 a1区结合，从而抑制了瑞斯托霉素诱导血小板聚集，可起到抗血栓的功能。其抗血栓的机理是：rgpibαh1v289产品进入血液后，竞争性地先与循环的血液中vwf 结合，从而封闭了血液循环中血小板gpibα与vwf的结合部位a1区，阻断了血小板gpibα与vwfa1区结合，使得血小板不能与受损的血管壁发生黏附作用，从而有效地抑制血栓形成。因此cho细胞稳定表达的重组活性片段蛋白具有较高的生物学功能。但当rgpibαh1v289产品应用于体内试验时，应该考虑体内复杂因素，如该产品在体内的稳定性和出血性等问题，因此在体内实验时需要测定其半衰期，同时要监测出血时间和血小板聚集功能等试验。

　　总之，基因工程细胞株a1能恒定高表达重组活性片段rgpibαh1v289，而且用亲和层析纯化的产品具有较高的纯度、免疫学活性和生物学功能，可获得足量的高纯度重组蛋白，该重组活性片段rgpibαh1v289有可能开发为有效的抗血栓药物，为下一阶段深入研究血栓形成的机制、临床诊断和寻找新的抗血栓药物方向奠定了坚实基础。

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