不同免疫佐剂对丙肝核酸疫苗效果

【摘要】 目的：观察不同佐剂对hcvdna疫苗效果的影响。方法：雌性balb/c小鼠分别用脂质体ddab/epc和dcchol/dope、montanide isa 720和氢氧化铝为佐剂的hcvdna疫苗免疫3次，elispot法观察脾淋巴细胞受hcv核心、e2、e1/e2、ns3和ns5b蛋白刺激后细胞因子的产生。结果：ddab/epc组产生ifnγ较多，在大部分情况下，显著高于其它组。该组il2的产生也显著高于其它4组。该组il4的产生，在某些情况下也高于其它组。用ns5b刺激，氢氧化铝组il4的产生显著高于其它4组(p<0.05)。裸dna和两种脂质体组ifnγ的产生高于il4，而montanide和氢氧化铝组il4的产生高于ifnγ。结论：在4种佐剂中，ddab/epc效果最好，montanide和氢氧化铝可将dna疫苗th1为主的免疫特性转换为以th2为主。

【关键词】 核酸疫苗 丙型肝炎病毒 免疫佐剂

　　immunological effects of different adjuvants on hcvdna vaccine

　　jin bo, richard yanhui wang，cheng liufang, qiu qi, james waikuo shih.

　　department of digestive diseases, naval general hospital, beijing 100037, china

　　［abstract］ objective:the immunological effects of hcvdna vaccine with different adjuvants were detected by elispot in s:female balb/c mice were primed with naked hcvdna, hcvdna encapsulated by liposome ddab/epc or dcchol/dope, hcvdna mixed with montanide isa 720 or aluminum hydroxide, respectively, and boosted twice accordingly in a fourweek interval. cytokine production by splenocytes was assessed by s:in most cases, splenocytes from mice vaccinated with ddab/epc liposome produced more ifnγ. these splenocytes also have significant higher il2 production compared with the other groups. in expansion with ns5b, splenocytes from alum group have significance in il4 production compared with other groups. the profile of cytokine production revealed that the infγ overwhelmed il4 in naked dna, ddab/epc, and dcchol/dope groups while il4 surmounted ifnγ in alum and montanide sion:encapsulation with liposome ddab/epc has the strongest adjuvant effect in inducing th1 dominated immunity. alum and montanide can convert the th1 nature of dna vaccine to th2biased immunity.

　　［key words］ dna vaccines；hepatitis c virus(hcv)；immunologic adjuvants

　　丙型肝炎病毒(hepatitis c virus, hcv)感染是一个严重的全球性健康问题。据世界卫生组织在1999年的调查结果表明，全世界有大约一亿七千万人感染丙型肝炎病毒，占全世界人口总数的3%［1］。

　　在丙型肝炎病毒感染后，虽然机体可以产生很强的体液免疫反应，但仍有75%～85%的急性丙型肝炎病毒感染者不能清除病毒而成为慢性感染者。抗hcv的中和抗体虽然在一定情况下有助于病毒的清除, 但由于丙型肝炎病毒在患者体内可以不断发生演变，从而产生对中和性抗体有抗性的突变株。

　　因此, 虽然有hcv的中和抗体存在，但细胞免疫反应在防止和清除hcv感染过程中显得更为重要。因此，诱导产生针对hcv的特异性细胞免疫反应就不可避免地成为hcv疫苗研究的重点［2］。

　　dna疫苗可诱导以i型辅助性t细胞(t helper cell type ⅰ, th1)介导的细胞免疫。为观察不同类型免疫佐剂对hcvdna疫苗免疫效果的影响，我们比较了小鼠接种几种不同佐剂辅佐的hcvdna疫苗后免疫反应的改变。

　　1 材料与方法

　　1.1 hcvdna重组质粒的构建 将hcv1a型h株核心、e1、e2蛋白基因(1～746位氨基酸，核酸342～2 579)插入pvax1质粒(美国invitrogen corp.)bamh ⅰ限制酶切点，转化大肠杆菌增殖，用endofree plasmid giga kit(美国qiagen)纯化。将重组质粒转染chok1细胞，裂解细胞做western blot，确定可表达hcv核心和e1、e2蛋白。hcvns3、hcvns5b重组质粒的构建方法同上，插入片段分别为hcvns3基因(1 027～1 657位氨基酸，核酸3 420～5 312)和hcvns5b基因(2 421～3 011位氨基酸，核酸7 602～9 374)。

　　1.2 hcv重组蛋白抗原的制备

　　1.2.1 hcvns3重组蛋白［3］ 将hcvns3基因(1 027～1 657位氨基酸，核酸3 420～5 312)插入pqe11质粒(美国qiagen)的限制性内切酶bamh ⅰ位点，转化大肠杆菌dh5αf’iq，western blot选择阳性克隆增殖。溶菌酶溶解细菌，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化蛋白(分子量69 000)，鲎实验检测内毒素含量<0.02 eu/μg。同样方法表达hcvns5b基因(2 421～3 011位氨基酸，核酸位点7 602～9 374)和hcve2基因(384～746位氨基酸，核酸1 491～2 579)，制备hcvns5b重组蛋白(67 000)及截短型(truncated)hcve2重组蛋白。虽然插入hcve2全长基因，且加入蛋白酶抑制剂，但表达的hcve2蛋白仍为29 000而非40 000，因此该蛋白为截短型。

　　1.2.2 hcv核心蛋白［4］ hcv核心基因(1～164位氨基酸)插入ptrc99a质粒(美国pharmacia)nco ⅰ位点，转化dh5α株大肠杆菌表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化(分子量18 000)。

　　1.2.3 hcve1/e2重组蛋白 用bactobac baculovirus expression systems(美国invitrogen)。hcv核心、e1和e2基因(1～746位氨基酸，核酸342～2 579)插入供体pfastbac1质粒，转化大肠杆菌dh10bac，供体质粒将目的基因转位至菌体中的bacmid质粒，提取重组bacmid质粒转染sf9细胞株，提取培养液中重组杆状病毒(baculovirus)用于感染sf9细胞。溶解细胞，离心取上清过galanthus nivalis lectin亲和柱层析纯化hcv e1/e2蛋白，过滤除菌。

　　1.3 佐剂与hcvdna疫苗的混合

　　1.3.1 ddab/epc脂质体dna的制备［3］ 将3.96 μmol溴化二甲基二八癸胺(dimethyldioctadecylammonium，ddab)与3.96 μmol卵黄卵磷脂(egg yolk phosphatidylcholine, epc)(美国avanti polar lipids)氯仿溶液混合，氮气流吹干，加入0.6 ml注射用水，超声匀浆，再加入dna溶液(1 mg/ml)0.6 ml，充分震荡后于-70℃过夜。次日离心冻干，加入0.1×pbs 60 μl水合1小时，再加入1×pbs 600 μl混匀。

　　1.3.2 dcchol/dope脂质体dna的制备 将0.72 μmol lα磷脂酰乙醇胺(lαphosphatidylethanolamine, dope)与1.26 μmol和氢氧化胆甾醇基3βn二甲胺乙基氨基甲酸［cholesteryl 3βn(dimethylaminoethyl) carbamate hydrochloride, dcchol］(美国sigma)氯仿溶液混合，氮气流吹干，加入0.6 ml注射用水，超声匀浆，再加入dna溶液(1 mg/ml)0.6 ml，充分震荡后于-70℃过夜。次日离心冻干，加入0.1×pbs 60 μl再水合1小时，再加入1×pbs 600 μl混匀。

　　1.3.3 氢氧化铝dna混悬液 将0.35 ml的imject alum(含45 mg/ml氢氧化铝和40 mg/ml氢氧化镁)(美国pierce)逐滴加入3 mg/ml的dna溶液0.35 ml中，同时震荡，然后持续震荡30分钟。

　　1.3.4 montanide isa 720与dna混悬液 将0.35 ml的montanide isa 720(法国seppic)逐滴加入3 mg/ml的dna溶液0.35 ml中，同时震荡，然后持续震荡30分钟。

　　1.3.5 裸dna溶液 将dna溶于1×pbs中，调整dna浓度为1.5 mg/ml。

　　1.4 动物免疫 2月龄balb/c雌性小鼠50只(美国harlan)，随机分为10组，每组5只，按所用免疫佐剂分为hcvdna疫苗组和载体质粒dna对照组，见表1。疫苗组每鼠接种的dna由hcv结构区dna、ns3dna和ns5bdna各100 μg混合, 对照组每鼠接种pvax15质粒dna 300 μg。初次免疫后间隔4周再次免疫，再间隔3周行分析前免疫，1周后处死。免疫方法为肌肉注射。

　　表1 动物分组（略）

　　tab.1 animal group

　　1.5 脾淋巴细胞分离及elispot测定 脾淋巴细胞分泌il4、il2和ifnγ的斑点形成单位(spot forming unit, sfu)数量用elispot方法检测。小鼠处死后用70%乙醇浸泡灭菌，用无菌剪刀顺序剪开皮肤、肌肉和腹膜，取出脾脏，放入细胞过滤器(cell strainer，100 mol/l nylon, bd labware, bedford, ma)，将细胞过滤器放入已加入5 ml完全rpmi1640培养基的6孔培养板内，用3 ml注射器的内芯在细胞过滤器上将脾脏研碎至无肉眼可见的组织块，用5 ml完全rpmi1640培养基冲洗研磨棒及细胞过滤器，吹打孔内细胞形成均匀的细胞悬液，然后缓慢加入已加有5 ml ficollpaque plus(amersham pharmacia biotech ab, sweden)的15 ml离心管内，1 500 r/min离心20分钟，吸取淋巴细胞层，用10 ml完全rpmi1640培养基洗涤细胞2次，然后行细胞计数，调整细胞浓度至1×107 ml-1。在24孔培养板上，每孔加入10 μg/ml的rns3抗原溶液0.9 ml，然后加入淋巴细胞悬液0.6 ml，细胞终浓度为4×106 ml-1。将培养板放入co2孵箱，在5%co2、99%湿度、37℃条件下培养40小时。elispot反应板采用以孔径0.45 μm的混合纤维素覆底的maha s45型96孔过滤平板(millipore, bedford, ma)。elispot反应板每孔用50 μl浓度为10 μg/ml纯化的大鼠抗小鼠il4或大鼠抗小鼠il2或大鼠抗小鼠ifnγ抗体(bd pharmingen)包被过夜，次日用5%小牛血清白蛋白100 μl/孔再包被90分钟，用pbs洗板2遍，然后每孔加入经抗原刺激培养后的淋巴细胞悬液100 μl（4×105个细胞），放入co2孵箱内继续培养过夜，使细胞产生il4、il2或ifnγ，并被膜上的相应抗体俘获。第3天弃去细胞悬液，用pbs洗板6遍后，加入50 μl浓度为1 μg/ml的生物素标记的大鼠抗小鼠il4或il2或ifnγ抗体(bd pharmingen)，37℃培养90分钟，以检测被包被抗体所俘获的细胞因子。弃去抗体后，再用pbs洗板6遍，然后加入1∶4 000稀释的sahrp 100 μl，37℃培养90分钟，再经pbs洗板后，加入opti4cn过氧化物酶底物(biorad laboratories, hercules, ca)显色30分钟，自来水洗板终止反应。反应板晾干后，用aid elispot reader system(aid autoimmun diagnostika gmbh, germany)以ifnγ系统为标准，读取每孔的斑点数。所有的实验均有4个复孔，以4个孔的sfu平均值减去相应载体组sfu平均值作为特异性的sfu数值。

　　1.6 统计学处理 用stata 7.0统计软件进行单因素方差分析，并进行bartlett方差齐性检验，如方差不齐，则采用wilcoxonmannwhitney秩和检验。p<0.05为相差显著。

　　2 结果

　　2.1 小鼠脾淋巴细胞对不同抗原的反应 见表2。

　　2.1.1 对hcvns5b的免疫反应 ddab/epc组ifnγ的分泌显著高于montanide组(p<0.05)，il2的分泌显著高于montanide组、氢氧化铝组和dcchol/dope组(p<0.05或p<0.01)，提示ddab/epc可诱导较强的细胞免疫。氢氧化铝组il4的分泌显著高于其它4组(均p<0.05)，提示氢氧化铝与其它4种疫苗相比，可诱导更强的体液免疫反应。

　　2.1.2 对hcvns3的免疫反应 ddab/epc组ifnγ的分泌显著高于montanide组和dcchol/dope组(均p<0.05)，il2的分泌显著高于其它4组(均p<0.001)，而il4的分泌显著高于裸dna组(p<0.05)。

　　2.1.3 对hcve1/e2的免疫反应 ddab/epc组ifnγ的分泌显著高于裸dna组、氢氧化铝组和dcchol/dope组(均p<0.05)，il2和il4的分泌显著高于其它4组(p<0.01或p<0.05)。

　　2.1.4 对hcve2的免疫反应 ddab/epc组ifnγ和il2的分泌显著高于其它4组(均p<0.01)，il4的分泌显著高于裸dna组和dcchol/dope组(均p<0.01)。

　　2.1.5 对hcv核心蛋白的免疫反应 ddab/epc组ifnγ和il2的分泌显著高于其它4组(p<0.001)，il4的分泌显著高于裸dna组(p<0.05)；dcchol/dope组ifnγ的分泌显著高于montanide组和氢氧化铝组(均p<0.05)，il2的分泌显著高于montanide组(p<0.05)。

　　图1 不同抗原刺激后，细胞因子il4/ifnγ的产生（略）

　　fig.1 il4/ifnγ production profile upon different antigen expansion

　　表2 经hcv抗原刺激后elispot检测细胞因子的产生（略）

　　tab.2 cytokines production upon hcv antigen expansion detected by elispot

　　note:compared with ddab/epc, 1) p<0.05;compared with ddab/epc, 2) p<0.01;compared with imject alum, 3) p<0.05;compared with dcchol/dope, 4) p<0.05. data expressed as the sfu of immunized mice minus the mean sfu value of the corresponding control group. the mean value of the control group(unimmunized) was presented in parenthesis. sfu: spot forming unit.

　　2.2 不同佐剂对dna疫苗免疫反应特性的影响 见图1。经过5种不同的hcv抗原刺激后，裸dna组和ddab/epc组及dcchol/dope组ifnγ的分泌均高于il4，表明这3种疫苗免疫后小鼠免疫反应是以th1为主；而montanide组和氢氧化铝组，il4的分泌均高于ifnγ，提示这两种疫苗诱导的免疫反应是以th2为主。

　　3 讨论

　　将编码抗原的dna分子直接注射到体内，dna分子可被细胞摄取，进入细胞核转染成为核内游离基因，进而表达抗原分子，诱导体液和细胞免疫［5］。裸dna疫苗是将dna直接注射到肌肉，免疫效果依赖于肌细胞摄取dna的能力，有些dna分子可被局部抗原提呈细胞(antigen presenting cells, apc)吞噬，也有些进入淋巴系统，被局部淋巴结内的apc吞噬。研究表明，被apc摄入的dna分子，更有利于诱导免疫反应［6］。

　　裸dna疫苗免疫效果不理想的主要原因之一是dna分子在进入细胞前被间质核糖核酸酶所降解。脂质体的外层脂质可以保护内部的dna分子免受核糖核酸酶所降解。另外由于dna分子和细胞膜都带负电荷，静电的排斥作用也不利于dna进入细胞。阳离子脂质体由于其正电性，易与细胞膜接近，有利于dna进入细胞，更重要的是阳离子脂质体可能主要被apc摄取，诱导更强的免疫反应［7］。本实验结果表明，小鼠接种阳离子脂质体ddab/epc包被hcvdna疫苗后，脾淋巴细胞在受到hcv核心、e1/e2或e2抗原刺激后，产生的ifn γ显著多于裸dna组及其它3种佐剂组。受ns3刺激后，ifn γ虽较裸dna组有所升高，但无统计学意义。我们前期研究用ddab/epc包被ns3 dna免疫小鼠后，ifn γ的产生显著高于裸dna组［3］。其原因可能是不同序列dna混合后，诱导的免疫反应发生变化。dcchol是一种阳离子性的胆固醇衍生物，它与中性脂质dope形成阳离子脂质体dcchol/dope作为免疫佐剂，可提高单价分割灭活流感疫苗的免疫功效，小鼠皮下接种可诱导以th1为主的免疫反应［8］。用dcchol/dope/epc脂质体作为流感病毒核蛋白dna疫苗佐剂，可显著提高疫苗的体液免疫活性［9］。我们的结果表明，dcchol/dope脂质体对本实验的hcvdna疫苗无明显佐剂效应，仅在受hcv核心抗原刺激后，产生的ifnγ多于montanide isa 720或氢氧化铝组。

　　montanide为油包水乳剂型免疫佐剂，有montanide isa 720和51两型。montanide isa 720是由植物油和表面活性剂(单油酸二缩甘露醇)构成［10］。这种结构可延缓抗原释放，乳剂可引起局部免疫反应，使apc聚集，表面活性剂可与细胞膜作用，有利于apc摄取抗原，也可能与toll蛋白样受体作用，发挥免疫佐剂功能。montanide isa 720可增强寡核苷酸cpg和多肽疫苗诱导的细胞免疫，效果优于福氏佐剂［11，12］。本实验表明，小鼠接种以montanide isa 720为佐剂的hcvdna疫苗，脾淋巴细胞受hcvns3或ns5b抗原刺激后，细胞因子的产生，尽管统计学上无显著性，但数值上明显低于接种裸dna疫苗鼠，提示montanide isa 720对dna疫苗无免疫辅佐效应，相反由于其制剂的高黏稠性，可能会延缓dna进入细胞表达，对dna疫苗可能会有抑制作用。另外，无论是用hcv结构抗原还是非结构抗原刺激， montanide组小鼠脾淋巴细胞产生的ifnγ均低于il4，说明montanide isa 720还会将dna疫苗th1免疫反应为主的特性转换为以th2免疫反应为主。

　　铝制剂作为免疫佐剂用于临床已有50多年的历史。水溶性抗原可在铝凝胶中缓慢释放，延长抗原与免疫系统的作用时间，还可与补体、酸性粒细胞和巨噬细胞相互作用，激活apc，增加apc摄取抗原的效率，为增强th2免疫反应的佐剂［13］。我们的结果表明，小鼠接种铝佐剂hcvdna疫苗，受hcvns5b刺激时，淋巴细胞产生的il4显著高于其它佐剂或裸dna组，提示在此种情况下，氢氧化铝可诱导较其它佐剂更强的th2反应。另外，接受铝佐剂hcvdna疫苗的小鼠淋巴细胞受抗原刺激后，il4的产生明显高于ifnγ，说明铝佐剂可使dna疫苗的免疫反应从th1为主转为th2为主。这与peng等［14］报道相似。

　　因此，根据我们的实验结果，ddab/epc对hcvdna疫苗的辅佐作用最好，可增强dna疫苗诱导的th1免疫反应，而dcchol/dope辅佐作用不明显；氢氧化铝似可增强dna疫苗诱导的th2免疫反应，而montanide isa 720似可减弱dna疫苗免疫反应；氢氧化铝和montanide isa 720可改变dna疫苗的免疫反应特性，使其由th1为主转为th2为主。

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