黄芪、 党参提取物增强紫杉醇抑制肿瘤血管生成

【摘要】 　　目的: 观察黄芪、 党参提取物对紫杉醇抑制lewis肺癌血管生成和肿瘤转移的增强作用, 为中医药抗肿瘤应用提供实验依据。方法: c57bl/6小鼠右肋处皮下接种lewis肺癌, 6 h后随机分为实验组、 紫杉醇组和对照组。实验组接受紫杉醇联合参芪注射液治疗, 紫杉醇组接受同等剂量的紫杉醇治疗, 对照组用等体积的生理盐水代替。观察指标: 移植瘤体积, 肿瘤组织内微血管度和肺脏转移瘤数量, 小鼠存活时间。结果: 与紫杉醇治疗相比, 紫杉醇联合参芪可以明显减少移植瘤内的微血管密度(10.1±4.4 vs 16.8±7.3, p＜0.05)和肺脏转移瘤个数（13.4±4.3 vs 18.4±3.9, p＜0.05）, 明显延长小鼠的存活时间（43.3±8.4 d vs 36.3±6.6 d, p＜0.05）。 结论: 黄芪、 党参提取物对紫杉醇抑制肿瘤血管生成和移植肿瘤转移有一定的增强作用。

【关键词】 黄芪 党参 紫杉醇 lweis肺癌 血管生成

　　inhibitory effect of huangqi and dangshen extraction with pacilitaxel on metastasis and angiogenesis on mouse lewis lung carcinoma model

　　bai chang-qing, song ying-fang, wang de-tang, guo hui-ling

　　department of respiratory diseases, affiliated hospital, academy of military medical sciences, beijing 100071; department of respiratory diseases, genetics laboratory, xijing hospital, fourth military medical university, xi’an 710032, china

　　［abstract］ aim: to study enhance effect of huangqi and dangshen extraction (shenqi) on pacilitaxel inhibitory metastasis and angiogenesis on mouse lewis lung carcinoma model.　methods: lewis lung carcinoma cells were inoculated into right hind footpad of c57bl/6 mice. six hour after tumor inoculated, the mice were randomly divided into 3 (paclitaxel plus shenqi) or paclitaxel was intraperitoneally injected in two group since the second day of the establishment of animal model. the third group simply administered with normal saline was set as placebo-control. tumor volume, quantitation of microvessel density (mvd) in inoculated tumor, the number of metastasis in the lungs and survival analysis were compared in 3 groups. results: paclitaxel plus shenqi can effectively reduced mvd in inoculated tumor and the number of lung metastasis as compared with other two group (p<0.05). the survival time of shenqi group was also significantly longer (p<0.05). tumor volume was no statistical difference in three group (p>0.05). conclusion: shenqi can amplify the paclitaxel effect of anti-angiogenesis and anti-metastasis, enhances the survival time of mice bearing llc, might has possible therapeutic applications in the treatment of lung cancer.

　　［keywords］huangqi; dangshen; pacilitaxel; lewis lung carcinoma; anti-angiogenesis

　　扶正中药在肿瘤的治疗中广泛应用, 具有减轻放化疗毒副反应、提高疗效和患者生活质量的作用。体外研究提示, 扶正中药可能对vegf、mmp-9等血管生成因子的表达具有抑制作用［1］。有鉴于此, 本研究中采用荷瘤动物模型, 观察紫杉醇和黄芪、 党参提取物联合治疗, 对肿瘤组织中微血管密度(microvessel density, mvd)和远处器官转移的影响, 从血管生成角度对其抗肿瘤机制进行探讨。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 66～88周龄c57bl/66 小鼠(第四军医大学实验动物中心)。lewis 肺癌瘤株(上海市医药工业研究院药理研究室馈赠)。紫杉醇（pacilitaxel, ptx, bristol-myers squibb company）。黄芪、 党参提取物（参芪注射液, shenqi, 每1 ml含总皂甙>3 mg, 总酚性物质>0.34 mg, 多糖类物质>35 mg。广东丽珠集团利民制药厂馈赠）。兔抗cd31单克隆抗体（santa cruz）。sp 组化试剂盒（北京中山生物公司）。光学显微镜及照相系统（olympus-bh-200）。解剖显微镜（leica）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 荷瘤小鼠模型建立及分组 无菌条件下从供瘤鼠上摘除生长良好的肿瘤, 生理盐水洗净血污, 眼科剪将肿瘤块剪成 1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块, 每克肿瘤组织加3.0 ml生理盐水, 玻璃匀浆器匀浆, 200目尼龙网滤过后取0.2 ml肿瘤匀浆接种于c57bl/6 小鼠右肋处皮下, 复制肿瘤模型。小鼠接种肿瘤匀浆 6 h 后, 随机分成实验组（experiment group, eg）、 ptx组（ptx group, pg）和对照组(normal saline group, ng), 每组30只。

　　1.2.2 动物处理 eg: 建立动物模型后第2天开始, ptx［10 mg/(kg·3d)］和shenqi［3.0 mg/(kg·d)］腹腔内注射; pg: pxt腹腔内注射, 时间和剂量同eg组; ng: 等体积的生理盐水腹腔内注射。

　　1.2.3 实验指标与测量方法 (1)移植瘤积: 肿瘤接种10 d后, 每5天用游标卡尺测量移植瘤大小, 按公式v = (长×宽 )×0. 52计算肿瘤体积(mm3 ); (2)移植瘤内的微血管密度: 肿瘤接种后第20天,每组随机挑选荷瘤小鼠10只, 断颈处死, 剩余小鼠继续观察, 用作生存分析。小鼠处死后取出移植肿瘤, 石蜡包埋、 切片、 sp 法血管cd31染色。mvd计数方法:从每只小鼠的肿瘤切片中随机选出 5 张, 先在低倍镜(100×) 下检查整个切片, 找到并选取微血管密度最高的5 个视野(热点), 在高倍镜(200 ×) 下对这5 个视野内的微血管进行计数, 每个被染成棕黄色的单个内皮细胞或细胞簇, 与周围其他组织有明显界限, 无论有无管腔, 定义为1条血管, 血细胞和大的血管腔不计, 取其平均值作为每只小鼠每个高倍视野内的mvd。(3)肺脏转移瘤数量:小鼠死亡后,立即取出肺脏, 40 g/l多聚甲醛固定, 解剖显微镜下计数肺脏表面的肿瘤结节。(4)存活时间:观察并记录荷瘤小鼠的存活状况, 直至死亡。

　　1.2.4 统计学处理 方差比较肿瘤大小、 肺脏表面的转移瘤数目、 mvd, 实验小鼠的存活天数采用方差分析和kaplan-meier生存分析。所有统计均用spss12.0统计软件进行, 检验水准为p<0.05具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 ptx联合shenqi治疗对小鼠移植瘤体积的影响 肿瘤接种9～12 d后,肿瘤可长至1.5 cm3大小, 随着接种时间的延长, 部分小鼠移植瘤中心区域开始出现溃烂。尽管eg、 pg小鼠肿瘤体积的测量平均值在各时间点均小于ng, 但统计学分析3组之间无统计学意义（p>0.05, 图1）。

　　图1 移植瘤体积的比较（略）

　　fig 1 comparison of tumor volume in three groups

　　2.2 ptx联合shenqi治疗对小鼠移植瘤内mvd的影响 pg移植瘤内的mvd为16.8±7.3, 较ng（27.8±8.4）明显减少（p<0.01）。加入shenqi后这种抑制作用进一步增强, mdv数量降至10.1±4.4, 与pg差异有统计学意义（p<0.05）。

　　2.3 ptx联合shenqi治疗对小鼠移植瘤肺脏转移的影响 所有小鼠均可在肺脏表面发现肿瘤结节, 个数较少者为7个, 最多者32个。eg、 pg明显少于ng, 同时eg肺脏转移瘤个数也明显少于pg组(p<0.05, 表1)。

　　表1 种植瘤组织中mvd和肺转移瘤数量的比较（略）

　　tab 1 mvd in in inoculated tumor and the number of metastasis in the lungs

　　ap<0.05, cp<0.05 vs ng.

　　2.4 ptx联合shenqi治疗对小鼠存活时间的影响 实验小鼠在建立荷瘤模型后第22天开始死亡, ng在第42天全部死亡, 而pg和eg的最长存活天数可达50 d以上。3组小鼠的的存活天数分别为43.3±8.4 d（eg）、 36.3±6.6 d （pg）和 25.9±6.3 d（ng）, 组间比较sg vs pg（p＜0.05）, eg vs ng (p<0.01), pg vs ng (p<0.01)。但kaplan-meier生存率分析eg、 pg与ng之间无统计学意义(图2)。

　　图2 实验小鼠生存天数的kaplan-meier分析（略）

　　fig 2 kaplan-meier analysis of three groups during the study period

　　3 讨论

　　肺癌的生长和转移与肿瘤区域的血管密切相关, 肺癌区域的新生毛细血管是肿瘤赖以生长和生存的物质基础。早在20世纪70年代就有人提出把抑制肿瘤血管形成作为肿瘤治疗的一种途径。目前这种以肿瘤血管为靶标的治疗策略肿瘤血管靶向治疗(tumor vascular targeting therapy), 已经成为肺癌治疗的重要策略, 在肺癌等肿瘤的治疗中显示了良好的前景［2］。在肺癌治疗领域, 普遍采用的抗血管生成药物主要针对vegf和vegfr［3］。此外, 传统的化疗药物如：紫杉醇等也具有抑制肿瘤血管生成的作用［4］。不可否认抗血管生成为肺癌的临床治疗带来了新的希望, 但也存在许多亟待解决的问题［5］: （1）使用周期长, 用药剂量大, 医疗成本高;（2）血管生成过程是人体内许多正常生理活动的基础, 长期用药也会对生理性血管生成造成影响; (3)由于促血管形成因子的多样性, 不可能有一种血管生成抑制剂能有效地治疗所有肿瘤。

　　中医药是我国的宝贵财富, 扶正中药在肿瘤治疗中广为应用,取得了减轻毒副作用、提高治疗耐力和患者生活质量的肯定疗效。少数研究发现扶正中药能够增强放化疗的疗效、 减少远处转移, 但其机制似乎不能仅以“清热解毒”、“活血化瘀”简单解释。近年来, 跟踪血管生成理论, 国内学者对中医药的抗肿瘤机制进行了有益的探讨。如人参皂苷可能通过下调肿瘤vegf-mrna及蛋白的表达量, 阻滞肿瘤血管生成从而抑制肿瘤生长和转移［6］。姜黄素可以通过影响细胞增殖周期和诱导凋亡、 下调肿瘤血管内皮细胞生长因子(vegf)基因的表达、 减少细胞中vegf的水平和抑制基质金属蛋白酶活性等多个环节对鸡胚尿囊膜血管生成产生抑制作用［7］。也存在一些相反的研究结论, 丹参、莪术及高剂量赤芍能提高肿瘤组织mvd 及vegf表达, 可能会促进小鼠lewis肺癌血管生成, 促进肿瘤侵袭和转移发生, 与临床应用的初衷相矛盾, 这是扶正中药治疗肿瘤中值得注意的问题之一［8］。另外, 中医药多为复方制剂, 在配伍后可能产生新的药性及作用, 这些也是需要深入研究的问题。

　　本研究采用lewis肺癌的c57bl/6小鼠模型, 观察参芪注射液对lewis肺癌生长、 转移、 肿瘤组织中微血管密度和荷瘤小鼠存活时间的影响。结果表明: 尽管参芪注射液对移植瘤的体积无明显影响, 但可以减少肿瘤组织内的微血管密度和肺脏转移瘤的数量。此外, 尽管3个处理组生存率曲线无明显差异, 但从小鼠的绝对存活时间（d）上看, 实验组明显长于其他2组。综合以上实验结果我们认为: 参芪注射液能够增强紫杉醇的抗肿瘤效果, 其机制可能与减少肿瘤组织中的微血管密度有关。该研究结果从另一个方面丰富了参芪注射液的抗癌机制。

　　在临床常用药物中筛寻血管生成抑制剂, 由于其作用机制、 使用剂量和毒副反应较为明确, 是一种低投入、短周期的研究策略。因此对参芪注射液, 特别是与化疗相结合治疗肿瘤的有效性和作用机制值得进一步探讨。

【参考文献】
　　［1］ 叶 菁, 陈培丰. 中药及其提取物抑制肿瘤血管生成的研究进展［j］. 浙江中医药大学学报, 2007, 31(4): 530-532.

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　　［4］ wang f, cao y, zhao w, et al. taxol inhibits melanoma metastases through apoptosis induction, angiogenesis inhibition, and restoration of e-cadherin and nm23 expression［j］. j pharmacol sci, 2003, 93(2): 197-203.

　　［5］ kuhn h, hammerschmidt s, wirtz h. targeting tumorangiogenesis in lung cancer by suppression of vegf and its receptor-results from clinical trials and novel experimental approaches［j］. curr med chem, 2007, 14(30): 3157-3165.

　　［6］ 潘子民, 叶大风, 谢 幸, 等. 人参皂苷rg3对荷卵巢癌的严重联合免疫缺陷鼠的抗肿瘤血管生成作用的研究［j］. 中华妇产科杂志, 2002, 37(4): 227-230.

　　［7］ 丁志山, 高承贤, 陈铌铍, 等. 姜黄素具有抑制血管生成与诱导肿瘤细胞凋亡双重作用［j］. 中国药理学通报, 2003, 19(2): 171-173.