KIR在NK92MI及K562细胞中的基因型及表达谱分析

【摘要】 目的: 分析杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)在nk92mi及k562细胞中的基因型及表达谱, 探索kir受体的表达调控规律。方法: 采用pcr、 rtpcr及分子克隆测序技术, 检测k562及nk92mi细胞中kir2dl1、 2dl2、 2dl3、 2dl4、 2dl5、 2ds1、 2ds2、 2ds3、 2ds4、 2ds5、 3dl1、 3dl2、 3dl3、 3ds1、 2dp1、 3dp1的基因型, 及kir2dl1、 kir2dl2、 kir2dl3、 kir3dl1、 kir2ds1、 kir2ds3及kir2ds2/4受体mrna的表达。结果: k562细胞携带kir2dl1、 2dl2、 2dl3、 2dl4、 2dl5a、 2ds2、 2ds4*003006、 2ds5、 3dl1、 3dl2、 3dl3基因, 但不表达kir。nk92mi细胞携带kir2dl1、 2dl2、 2dl3、 2dl4、 2ds2、 2ds4*001/002、 2ds4*003006、 3dl1、 3dl2、 3dl3, 但只表达kir2dl1、 kir2dl3及kir2ds2/4。结论: k562细胞及nk92mi细胞均携带kir2dl1、 2dl2、 2dl3、 2dl4、 2ds2、 2ds4*003006、 3dl1、 3dl2、 3dl3。nk92mi细胞表达kir受体, k562细胞不表达上述kir, kir呈细胞特异性表达。

【关键词】 杀伤细胞免疫球蛋白样受体; 基因型; 表达谱

killer immunoglobulinlike receptor gene genotype and expression pattern in nk92mi and k562 cells

　　dou liping, da wanming, liu jinghua, sun jingfen, zhao yu, wang quanshun, gao chunji, yu li

　　department of hematology, pla general hospital of china, beijing 100853, china

　　[abstract] aim: to make clear the repertoire of killer immunoglobulinlike receptor at the level of dna and rna in nk92mi and k562 cells and compare kirs gene genotype and expression patterns in both cells. methods: kirs gene genotype, include kir2dl1, 2dl2, 2dl3, 2dl4, 2dl5, 2ds1, 2ds2, 2ds3, 2ds4, 2ds5, 3dl1, 3dl2, 3dl3, 3ds1, 2dp1, 3dp1, was analyzed by pcr. kirs gene phenotype, include kir2dl1, kir2dl2, kir2dl3, kir3dl1, kir2ds1, kir2ds3, kir2ds2/4 gene, was determined by rtpcr and sequencing. results: kir2dl1, 2dl2, 2dl3, 2dl4, 2dl5a, 2ds2, 2ds4*003006, 2ds5, 3dl1, 3dl2 and 3dl3 gene were present in k562 cells, but all corresponding receptors were not expressed by k562 cells. kir2dl1, 2dl2, 2dl3, 2dl4, 2ds2, 2ds4*001/002, 2ds4*003006, 3dl1, 3dl2 and 3dl3 gene were present in nk92mi cells, but only transcripts of kir2dl1, kir2dl3 and kir2ds2/4 were detectable. conclusion: kir2dl1, 2dl2, 2dl3, 2dl4, 2ds2, 2ds4*003006, 3dl1, 3dl2 and 3dl3 gene were present in both k562 and nk92mi cells. all corresponding kir receptors were not expressed by k562 cells and only partial kirs by nk92mi cells. the repertoire of kirs were specific for k562 and nk92mi cells.

　　[keywords]killer immunoglobulinlike receptor; genotype; expression pattern

杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer immunoglobulinlike receptor, kir)家族是决定人nk细胞活性的一类重要的受体, 在先天免疫耐受及后天免疫应答中发挥调控作用, 其在异基因造血干细胞移植免疫中的作用也越来越为临床医生所重视[1]。kir基因呈高度多态性, 在nk细胞及t细胞表面呈克隆性、 随机性分布, 其表达调控机制是近年来分子免疫学领域研究的热点[2]。本研究分析了不同细胞中kir的基因型及表达谱, 探索 kir的表达调控规律。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 k562及nk92mi细胞系由本室保存。trizol及rpmi1640培养基为invitrogen公司产品。超级小牛血清购自杭州四季青生物材料厂。dna提取试剂盒、 mmlv反转录酶、 oligo(dt)15、 rna酶抑制剂为promega公司产品。taq dna酶、 dntp购自大连宝生物公司。dna测序由上海生物工程公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞dna提取 采用 promega wizard genomic dna purification kit提取dna, 按照promega公司产品使用说明书操作。

　　1.2.2 kir基因型检测 kir基因采用 pelfreez kir genotying ssp kit检测kir2dl1、 2dl2、 2dl3、 2dl4、 2dl5、 2ds1、 2ds2、 2ds3、 2ds4、 2ds5、 3dl1、 3dl2、 3dl3、 3ds1、 2dp1、 3dp1。

　　1.2.3 细胞总rna提取 采用trizol一步法抽提细胞总rna, 按照invitrogen公司使用说明书操作。

　　1.2.4 细胞总rna rtpcr 逆转录引物采用polyt逆转录为cdna。βactin引物上游序列: 5′ccgacaggatgcagaaggag3′, βactin引物下游序列: 5′caagaaagggtgtaacgcaact3′, 扩增片段为251 bp。kir系列引物序列及扩增条件见表1。取6 μl产物电泳后进行图像分析。表1 kir引物序列及扩增片断

　　1.2.5 pcr产物测序 nk92mi细胞kir各受体rtpcr产物克隆入pgemt载体(promega公司产品), 导入dh5α感受态大肠杆菌(博大泰克公司产品), 挑选单个阳性克隆, 送上海生工测序。各加样孔至少出现一条内参照条带, 若出现两条或三条条带该孔扩增结果为阳性。

　　2 结果

　　2.1 k562细胞和nk92mi细胞kir基因型分析 如图1、 2所示, k562细胞携带kir2dl1、 2dl2、 2dl3、 2dl4、 2dl5a、 2ds2、 2ds4*003006、 2ds5、 3dl1、 3dl2、 3dl3基因。nk92mi细胞携带kir2dl1、 2dl2、 2dl3、 2dl4、 2ds2、 2ds4*001/002、 2ds4*003006、 3dl1、 3dl2和3dl3。各加样孔至少出现1条内参照条带, 若出现2条或3条条带该孔扩增结果为阳性。

　　2.2 k562细胞和nk92mi细胞kir表达谱分析 rtpcr结果显示, nk92mi表达kir2dl1、 kir2dl3、 kir2ds3及kir2ds2/4(图3)。k562细胞在rtpcr检测中不表达kir。

　　2.3 nk92mi细胞kir受体测序结果 kir2dl1、 2dl3、 2ds2/4及2ds3特异性引物扩增nk92mi细胞逆转录cdna, 获得目标扩增产物。经琼脂糖凝胶电泳, 与预计结果符合, 然后pcr产物纯化回收, 切胶回收后的pcr产物与t4 dna连接酶连接, 成功的将扩增产物插入质粒, 经蓝白斑筛选阳性克隆后, 利用pcr进一步筛选, 获得阳性克隆菌株, 送上海生工公司测序。结果证实nk92mi表达kir2dl1、 kir2dl3、 kir2ds2/4, kir2ds2引物扩增的序列片段为kir2ds4及kir2ds2。kir2ds3引物扩增序列为杂带。

　　3 讨论

　　单倍体相合造血干细胞移植后异源反应性nk细胞对于移植疗效有着深远的影响。异源反应性nk细胞的产生主要与其表面杀伤细胞免疫球蛋白样受体有关, 如何调控kir受体表达, 诱导异源反应性nk细胞产生是目前移植领域的研究热点[1, 3, 4]。

　　编码kir的一系列基因位于人类染色体19q13.4上的被称为白细胞受体簇的区域内, 全长约150 kb, 由大小不等的一组多态性丰富的多基因家族组成[5, 6]。至今已命名17个kir基因, 包括kir2dl14、 kir2dl5a、 kir2dl5b、 kir2ds15、 kir2dp1、 kir3dl13、 kir3ds1、 kir3dp1, 其中kir2dp1及kir3dp1为假基因。本研究检测了上述17种kir基因, 基本涵盖了目前文献报道的所有基因。结果发现, k562细胞及nk92mi细胞均携带kir2dl1、 2dl2、 2dl3、 2dl4、 2ds2、 2ds4*003006、 3dl1、 3dl2、 3dl3。文献报道kir2dl1、 2dl3、 2dl4, 3dl1、 3dl2、 3dl3为人群中出现频率较高的基因[5], k562细胞及nk92mi细胞中均出现上述几种基因, 与文献报道一致。另外k562细胞携带kir2dl5及kir2ds5, 携带的基因种类多于nk92mi细胞。

　　kir受体在人体内的表达独具特色, 其表达调控机制一直困扰着各国科学家们[7]。kir各基因高度同源, 其蛋白结构也类似, 目前市售的抗体缺乏特异性, 一种抗体可结合数种kir受体, 如gl183抗体即结合kir2dl2/kir2dl3/kir2ds2, 不能准确反映各种kir的表达情况。故本研究通过rtpcr技术来特异性分析kir的表达。本研究采用的nk92mi细胞来源于人类nk细胞, k562细胞来源于人类慢性粒细胞白血病转化的红白血病细胞。结果证实, nk92mi细胞表达kir受体, 如kir2dl1、 kir2dl3及kir2ds2/4。k562细胞不表达上述kir。证实kir受体表达于nk细胞上。目前研究认为kir主要与nk细胞的杀伤功能有关, k562细胞表面kir缺失, 与其无杀伤功能相关。另外, k562细胞具有多系分化潜能, 为进一步研究kir的表达调控机制奠定基础。

　　目前的研究认为, kir的基因型决定其表型, 同时转录因子及表观遗传学调控机制影响kir表达[2]。本研究显示, k562细胞携带kir2dl1、 2dl2、 2dl3、 2dl4、 2dl5a、 2ds2、 2ds4*003006、 2ds5、 3dl1、 3dl2、 3dl3基因, 但不表达kir。nk92mi细胞携带kir2dl1、 2dl2、 2dl3、 2dl4、 2ds2、 2ds4*001/002、 2ds4*003006、 3dl1、 3dl2、 3dl3, 但只表达kir2dl1、 kir2dl3及kir2ds2/4。说明kir呈细胞特异型表达, 除基因型外, kir还有其他表达调控机制, 需要进一步研究。

【参考文献】
　　[1] ahmet h, elmaagacli ho, michael k, et al. reduced risk for molecular disease in patients with chronic myeloid leukemia after transplantation from a kirmismatched donor[j]. transplantation, 2005, 79(12): 1741-1747.

　　[2] leung w, iyengar r, triplett b, et al. comparison of killer iglike receptor genotyping and phenotyping for selection of allogeneic blood stem cell donors[j]. j immunol, 2005, 174(10): 6540-6545.

　　[3] sebastian gfl, teresa l, andrea v, et al. survival advantage with kir ligand incompatibility in hematopoietic stem cell transplantation from unrelated donors[j]. blood, 2003, 102(3): 814-819.

　　[4] 窦立萍, 达万明, 赵丹丹, 等. 中国北方汉族人群中kir分布规律及其在hla相合亲缘移植中的作用[j]. 中华医学杂志, 2007, 87(44): 3111-3114.

　　[5] liping d, dehua z, chang w, et al. the diversity of kir gene in chinese northern han population and the impact of donor kir and patient hla genotypes on outcome following hlaidentical sibling allogeneic hematopoietic stem cell transplantation for hematological malignancy in chinese people[j]. int j hemat, 2008, 87(3): 422-433.

　　[6] jiang k, zhu fm, lv fz, et al. distribution of killer cell immunoglobulinlike receptor genes in the chinese han population[j]. tissue antigens, 2005, 65(6): 556-563.