赖型钩体毒力相关基因ompL17的重组表达以及体外

【摘要】 目的：观察ompl17基因表达产物的免疫原性以及该表达蛋白在动物模型中的分布情况。方法：提取钩端螺旋体017株基因组dna,扩增出ompl17基因，与表达载体pgex4t1重组，诱导表达ompl17蛋白，分析该基因在017株中体外不同温度的表达情况。结果：pcr和酶切分析证实构建成功了表达载体，sdspage分析证实诱导表达出ompl17蛋白；体外不同温度下发现该基因不表达蛋白。结论：成功表达出ompl17基因的蛋白，体外不同温度未发现该蛋白的表达，为赖型钩体的分子机制的阐明奠定了基础。

【关键词】 钩端螺旋体；克隆；表达；体内分布

钩端螺旋体病（简称钩体病）是由钩端螺旋体引起的一种人兽共患自然免疫源性疾病，严重危害人类的健康和农牧业生产。赖型钩体56601和哥本哈根型的测序完成[1，2]为钩体基因组学及其功能蛋白学的研究提供了一个新的契机。ompl17基因作为本研究室从赖型钩体强毒株中独立获得的基因，经过基因打靶技术初步断定为毒力相关基因。生物信息学分析结果表明，ompl17属于外膜蛋白，可能与钩体毒力相关。因此选择ompl17基因进行克隆表达，分析其在大肠杆菌中的表达以及赖型钩体017株中不同温度下的表达研究，探讨该基因是否体内诱导表达，将有助于钩体致病的分子机理的解释。

1 材料与方法

1.1材料

问号钩端螺旋体赖型017株（leptospira interrogans serovar lai strain 017）由成都生物制品所提供，本室保存，连续在豚鼠中传代培养以保持毒力。实验用菌株于kornthof培养基28 ℃培养7 d，菌数达1010条。pgex4t1载体购自promega 公司，大肠杆菌jm109株由本室保存。限制性内切酶bamhi、hindⅲ，t4 dna连接酶、牛小肠碱性磷酸酶、massrulertm dna ladder、蛋白质分子量标准均为mbi公司产品；elisa 检测试剂盒由晶美生物工程有限公司。bca protein assay reagent kit为pierce公司产品，其余试剂均为国产或进口分装（分析纯）。

1.2方法

1.2.1 引物设计参照ompl17基因全序列设计钩体ompl17基因，p1：5’ gtc gga tcc cgt atg acc cta gag tcc ttg–3’；p2：5’ gcg gaa ttc gtt tat caa aaa ggc cat cg3’，序列中引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点 。

1.2.2钩体ompl17基因的扩增回收、酶切及纯化：参见terpstra 等方法[3]并稍作修改进行钩体基因组dna的提取与纯化。以纯化的钩体017株基因组dna为模板，反应体系如下: 模板2 μl，taq 0.5 μl，dntp 4.0 μl，p1 1.0 μl，p2 1.0 μl，sterile h2o 38.5 μl，10×pcr buffer 5.0 μl。循环参数：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30sec，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30循环，72 ℃延伸6 min。扩增产物电泳鉴定后以pcr产物纯化试剂盒（roche）纯化回收，操作程序参照试剂盒说明书。然后用bamhⅰ和ecorⅰ酶切该产物，纯化后备用。

1.2.3 重组表达载体的构建pcr产物与质粒pgex 4t1的连接及转化[4]：提取质粒pgex 4t1，加入bamhⅰ和ecorⅰ37 ℃进行双酶切，纯化后与同样酶切过的ompl17基因混合，在t4连接酶作用下连接。然后转化大肠杆菌jm109株，取转化后的菌液均匀涂布于含氨苄青霉素50 μg/ml lb平板上培养过夜。重组质粒的筛选与鉴定：从转化后生长后的平板上挑取白色单菌落于含氨苄青霉素的液体lb培养基中增殖后提取质粒dna,通过酶切分析、pcr扩增鉴定以及测序筛选出正确重组子。

1.2.4重组质粒pgstompl17在大肠杆菌中的诱导表达分别挑取含空质粒pgex4t1和含重组质粒pgstompl17的菌落接种于lb培养液培养过夜，次日取菌液按比例接种于lb液体培养基，培养2小时后加入iptg至终浓度1 mmol/l，在诱导前及诱导后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h时收集菌液，菌体悬于含溶菌酶的pbs中，经反复冻融裂解细菌至菌液清亮，取裂解液上清、沉淀及收集的细菌培养液进行sdspage电泳，分析ompl17蛋白的表达量及表达形式。

1.2.5赖型钩体在体外不同温度ompl17蛋白表达分析[5]赖型钩体017和双曲钩体patocⅰ培养好后，将赖型钩体017放在28 ℃、30 ℃和37 ℃三种温度条件进行培养24小时，然后将上述钩体离心分钟集菌。菌液沉淀用pbs洗涤，再用离心收集沉淀。将沉淀用pbs溶解，用纯化蛋白做阳性对照，用patocⅰ做阴性对照，sdspage操作同前，电泳后的凝胶利用半干法将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上。ttbs洗膜后加入含辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg的ttbs液中孵育后再用ttbs洗膜，加入底物二氨基联苯胺（dab）液显色，直至有条带出现时用蒸馏水洗涤终止反应。

2结果

2.1 ompl17基因的pcr扩增及序列测定

以赖型017株为模板，用引物p1、p2在适宜条件扩增出约900bp左右的特异片段见fig.1。

　　2.2pgex 4t1质粒dna的提取与纯化

碱裂解法提取pgex 4t1质粒，电泳结果显示质粒dna有超螺旋、线性、环状三种形式的条带出现，无蛋白和rna的污染（fig.2）。

2.3 重组质粒的克隆及鉴定

赖型钩体基因ompl17的pcr片段与载体pgex 4t1质粒纯化后经bamh i和ecor i双酶切，连接酶作用下经转化转入大肠杆菌jm109中，挑取菌落在lb中培养后，提取质粒dna，以凝胶电泳初步检测比pgex 4t1 dna分子量大的质粒。酶切分析显示bamh i 和ecor i双酶切产生4.9 kb和900 bp 两条酶切条带提示该重组质粒已包含-900 bp的插入片段（图3）。以该重组质粒pgstompl17为模板，以引物p1、p2进行pcr扩增，能扩出约900 bp条带，而以空质粒为模板未扩出相应条带，进一步证实重组质粒pgstompl17构建成功（图4）。

　 2.4 重组质粒pgstompl17在大肠杆菌中的融合表达

在变性聚丙烯酰胺凝胶上，经iptg诱导的pgex4t1表达产物在26kd处出现gst蛋白带，而未经iptg诱导的pgex4t1没有26kd条带出现；经iptg诱导的pgstompl17表达产物在54kd处出现浓的蛋白带。用不同剂量iptg和改变iptg诱导时间，可提高融合蛋白的表达量。sdspage 结果见fig.5。

　　2.5 赖型钩体017在体外不同温度ompl17蛋白表达分析

分别取赖型钩体017株在28 ℃、30 ℃、37 ℃三种温度下表达蛋白和patoc在28 ℃表达蛋白和阳性对照进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜和western–blotting检测，结果阳性对照在约54kda处检测到阳性杂交信号，而赖型钩体56601和patoc无杂交信号（fig.6）。

　　3讨论

钩端螺旋体外膜研究一直是钩体分子生物学研究的重点和热点。但是，目前钩体外膜在致病过程中的作用机制仍不十分清楚。1993年，外膜蛋白的研究才有报道，首先haake等从外膜蛋白纯化分离入手，克隆测序了外膜蛋白ompl1[6]，以后几个膜脂蛋白lipl41[7]，lipl36[8],lipl32[9] 用同样的方法得到分离。研究表明这几个外膜蛋白可能与钩体致病和免疫保护有一定的相关性。本研究结果表明ompl17基因可以进行重组表达，但是该基因在赖型钩体017中体外不同温度下的蛋白表达情况表明，该基因在赖型钩体017的培养液中在28 ℃、30 ℃、和37 ℃培养都不表达，结合本研究者已做的免疫组织化学染色结果表明该蛋白在赖型钩体中是体外不表达而是在体内诱导表达的蛋白质。

目前，国内外已经确认的钩体毒力因子为钩体的溶血素蛋白，同时溶血素[10]有三种类型：酶类，成孔蛋白类和表面活性剂类。问号状赖型钩体测序完成后[1]，通过全基因组orf分析，发现9个基因与genbank/ncbi或embl数据库中登录的溶血素基因相似或者相同。目前已发现[11]钩体的又一种新的溶血素基因,它是鞘磷脂酶样的蛋白质，同时发现它是钩体体内诱导表达的蛋白质，而钩体在体外培养不表达该蛋白质，还发现该蛋白质对马肺内皮细胞有细胞毒性，同时对马和兔的红细胞有一定的溶血活性。ompl17作为一种在体内诱导表达蛋白质，或许在钩体致病过程中起着重要作用，但是其在钩体致病中的具体作用以及是否与钩体是否相关有待于进一步的分析和探讨。

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