根际土壤溶液中磷的毛细管电泳分析

摘要】 应用毛细管区带电泳间接紫外吸收法，对测定根际土壤溶液中po３－４的检测波长、电泳温度、分离电压和电解液组成等参数进行了选择，发展了根际土壤溶液中po３－４浓度的毛细管电泳分析法。选择后的电泳条件为：电解液为32 mmol/l三羟甲基氨基甲烷+4 mmol/l 1,2,4-苯三酸+0.3 mmol/l十六烷基三甲基溴化铵（ph=8.5）；检测波长为205 nm，分离电压为－20 kv，温度为25 ℃。本方法有效地屏蔽了土壤溶液中cl－，so2－４和no－3等离子对po3－４测定的影响，对根际土壤溶液中po３－４的检出限为0.68 mg/l（s/n=3）； 回收率为87.2%~99.4%，适于测定微量根际土壤溶液样品中po3－４的浓度。

【关键词】 po３－４；根际土壤溶液；毛细管电泳

analysis of phosphate in rhizosphere soil solution　samples using capillary electrophoresiswang zhen-yu，wen sheng-fang，li ai-feng*(key laboratory of marine environmental and ecology，ministry of education，ocean university of china，qingdao 266100)abstract analytical method of capillary zone electrophoresis with indirect uv detection was optimized and validated to determine the phosphate in rhizosphere soil solution effect of detection wavelength，electrolyte composition，separation voltage and temperature were es were performed in a 56 cm uncoated fused-silica capillary(length to the detector window) with reversed electroosmotic flow，anodic detection in 205 nm，separation voltage －20 kv，and temperature 25 ℃.the electrolyte contained 32 mmol/l tris-hydroxymethyl-aminomethane，4 mmol/l 1,2,4-benzene-tricarboxylic trimellitic acid and 0.3 mmol/l tetradecyl-trimethylammonium bromide，ph the conditions，the negative effect of the inorganic anion，such as cl－，so２－4 and no－3，can be reduced on detection limit was 0.68 mg/l(s/n=3)，and the recovery was 87.2%－99.4%.the method has been applied to the determination of the concentration of phosphate in the rhizoshere soil solution.

　　keywords phosphate；ｓoil solution；ｃapillary electrophoresis

　　1 引言

　　利用根箱抽提系统收集的原位根际土壤溶液中磷元素的动态变化研究可直接反映植物根系吸收磷的根际过程，对于理解磷的生物可利用性具有重要意义[1]。土壤根际中磷的研究过程，由于样品量很少，且磷的浓度很低，限制了对根际土壤溶液中磷的测定，成为根际土壤溶液中磷研究的瓶颈[2,3]。毛细管电泳技术的微量进样和较高的分离效率优势使其在根际研究中占有重要地位。同时，紫外间接检测方法是检测无机离子的最普遍和有效的方法，被广泛应用[4,5]。但由于土壤溶液中po3－４浓度远低于其它无机离子，且高浓度的cl－，so2－４，no－3等离子峰形的扩展，影响po3－４的出峰时间，增加了定性分析的难度[6,7]。

　　本研究基于文献[7]测定土壤溶液po3－４的方法，对po3－４的检测波长、电解液的组成、电泳温度及电压等条件进行了选择，以减少离子干扰，满足原位根际土壤溶液样品中po3－４测定的需要。
　　
　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　毛细管电泳仪（agilent 3d ce，g1601 a，germany）， 包括安捷伦工作站a.10.02，二极管阵列检测器（dad）； 熔融石英毛细管（内径50 μm，总长度64.5 cm，有效长度56 cm，河北永年锐沣色谱器件有限公司）。

　　三羟甲基氨基甲烷（tris，99.0%）、1,2,4-苯三酸（tma，99.9%）和十六烷基三甲基溴化铵（ttab，99.0%，美国sigma公司； nah2po4（99.0%，美国fluka公司）。实验用水为milliq水（美国millipore公司）。

　　2.2 实验方法

　　根据文献[7]中测定土壤溶液阴离子的方法（毛细管电泳仪：beckman p/ace 5510，ca，usa），以po3－４为目标离子，对检测波长、电泳温度、分离电压及电解液组成浓度等电泳条件进行选择。

　　电解液经用0.45 μm混合纤维膜过滤，实验前用超声波脱气15 min。毛细管使用前，先用1 mol/l naoh冲洗30 min，电解液冲洗10 min。在不进样的情况下电泳5次至毛细管壁平衡。每次测定样品后，用电解液冲洗5 min，使管壁回复到相同的待测状态。采用压力进样法，进样时间4 s，负极进样，正极检测，整个电泳分析过程由仪器自动完成。

　　2.3 土壤根际溶液样品的制备

　　用文献[2]建立的根箱抽提系统，分别将微型抽提管（rhizosphere research products，wageningen，netherlands，外径为1 mm，前端为多孔陶瓷p80材料，孔隙度48%，最大孔径为1 μm）插入到植物根尖以上3 cm左右的根系周围土壤中。微型抽提管的后端则通过内径0.75 mm的聚醚醚酮管与真空收集器相连，在负压下将土壤溶液收集于聚丙烯瓶（200 μl）中。根箱中分别种植喜旱莲子草和香蒲2种植物，每种植物的根际（距离根表<1 mm）插10个微型抽提管，非根际（距离根表>5 mm）插5个微型抽提管，在（－30±2） kpa的压力下连续收集48 h，每个抽提点收集到的土壤溶液约为100 μl。

　　3 结果和讨论

　　3.1 检测波长、温度和电压的选择

　　根据毛细管电泳仪工作站的等吸收绘图确定po３－４的最佳检测波长。检测波长为205 nm时，磷的信号峰的信噪比最大。因此，选择205 nm作为检测波长。

　　温度和电压条件可影响磷的出峰时间、峰面积和峰高。实验中保持毛细管电泳电解液（2 mmol/l tma+8 mmol/l tris+0.3 mmol/l ttab，ph=7.8）和电泳电压（－30 kv）不变，改变电泳温度（10， 15， 20， 25和30 ℃），测定5 mg/l po3－４标准溶液。随温度升高，po３－４出峰时间变短，峰形越来越尖锐，25℃时峰面积达到最大（见表1）。然后再保持毛细管电泳电解液（2 mmol/l tma+8 mmol/l tris+0.3 mmol/l ttab，ph=7.8）和电泳温度（25 ℃）不变，改变电泳电压（－15， －20， －25和－30 kv）， 测定5 mg/l po3－４标准溶液。随电压升高，po3－４出峰时间变短，但同时峰面积变小，峰高基本不变（见表2）。综合考虑峰面积和出峰时间，电泳温度选择25 ℃，电压选择－20 kv。

　　表1 电泳温度对po３－４的迁移时间、峰面积及峰高的影响（略）

　　table 1 migration time， peak area and peak height of phosphate at different temperature

　　表2 电泳电压对po３－４的出峰时间、峰面积及峰高的影响（略）

　　table 2 migration time， peak area and peak height of phosphate in different voltage

　　3.２ 电解质溶液的影响

　　由于阴离子迁移方向与电渗流（eof）方向相反，阴离子出峰时间很长或无法检测，因此在分离缓冲体系中加入电渗流反向改性剂改变毛细管内壁电荷，从而使电渗流方向反转。ttab是一种常用的电渗流反向剂，一般选择浓度0.3 mmol/l时，分离时间比较合适[8,9]。

　　tris是一种弱碱，其缓冲ph值范围7.5~9.0（25 ℃）。当电压为－20 kv，温度为25 ℃， ttab为0.3 mmol/l， tma为2 mmol/l， tris浓度为8，16和24 mmol/l时，电解液ph值在7.8~8.7之间变化（表3）。h3po4的pkα2为7.2，随着ph升高，h2po－4向hpo2－４转化； ph值越大，hpo2－４比例越大； 当ph>7.2时，以hpo2－４为主[10]。随着ph值的升高，谱图中po３－４的峰形对称性越好，但基线越不稳定。ph=8.5时的峰形和基线都较理想。

　　表3 不同浓度tris缓冲溶液对po3－４峰形的影响（略）

　　table 3 effect of different concentration of tris buffer solution on phosphorus peak

　　tris： tris-hydroxymethylaminomethane.

　　表4 不同浓度tma对基线噪声和po３－４迁移时间的影响（略）

　　table 4 effect of different concentration of 1,2,4-benzenetricarboxylic trimellitic acid(tma) on base line and the migration time of phosphate

　　保持ttab浓度为0.3 mmol/l，背景电解质分别选择2，4和8 mmol/ltma， ph为8.5（tris浓度分别为16，32和64 mmol/l）。从表4可见，tma浓度越大，po3－４的迁移时间延后程度越小。这主要是因为检测方式采用的是间接紫外吸收方法，无紫外吸收特性的无机阴离子与背景电解液中的强紫外吸收物质tma进行置换，改变了电解液的紫外吸收强度，形成倒立的信号峰[11]。当tma浓度增大时，其对cl－和so2－４的容量越大，谱带展宽越小，这些非目标离子对po3－４出峰时间的影响就越小。然而，tma浓度增大的同时，背景电解液的噪声也逐渐增大，提高了po3－４的检出限。因而tma浓度选择4 mmol/l。

　　3.３ 线性关系、重现性及回收率

　　在选定的条件下，用6.4 mg/l po3－４标准液重复进样5次，迁移时间的平均值为5.77 min； 其rsd为0.03%~0.5%；峰面积的平均值为9.68 mau·s， 其rsd为0.2%~0.7%； po3－４浓度与其峰面积在0.4~25.6 mg/l范围内呈线性关系，其线性回归方程为：a（mau·s）=1.478c+0.0514（r=0.9999），检出限为0.5 mg/l。

　　用香蒲根际土壤溶液与12.8 mg/l po3－４标准液按照体积比为1∶1混合制备加标样品，重复进样5次，迁移时间rsd为0.7%~2.5%；峰面积相对标准偏差为0.8%~1.6%； 加标样品的回收率为87.2%~99.4%； 样品检出限为0.68 mg/l（s/n=3），可以满足样品的测定需求。

　　图1 po３－４标准溶液(a)和香蒲根际土壤试样(b)的电泳谱图（略）

　　fig.1 electrophoregraph of standard phosphate and rhizosphere soil sample of cattail

　　电泳条件(ｅlectrode conditions)：毛细管(ｃapillary): 56 cm×５０ μm； 电解液(buffer solution)： 0.3 mmol/l tetradecyltrimethylammonium bromide(ttab) mmol/l tris-4 mmol/l tma，ph 8.5；压力进样：50 kpa×4 s； 电泳电压(seperation voltage): －20 kv， 电泳温度(ｔemperature): 25 ℃， 检测波长(detection wavelength): 205 nm。

　　3.４ 土壤溶液的测定

　　采用本方法测定土壤根际溶液中的磷元素含量，每个样品测定3次，每3个样品间插测3次po3－４标准溶液进行校正。po3－４标准溶液和香蒲土壤溶液样品的电泳谱图见图1。喜旱莲子草根际的土壤溶液po3－４质量浓度（2.5±1.0） mg/l显著低于香蒲根际（5.4±1.8） mg/l（p<0.05），且均显著低于非根际土壤溶液（11.8±2.4） mg/l（p<0.05）。

【参考文献】
1 gttlein a，hell u，blasek ma, 1996，69(1-2): 147~156

　　2 gttlein a，blasek science，1996，161（１０）: 705~715

　　3 wang z y，kelly j m，kovar j .，2004，33(4): 1387~1392

　　4 valsecchi s m，polesello togr.a，1999，834（１-２）: 363~385

　　5 chang s y，tseng w l，mallipattu s，chang h a，2005，66（２）: 411~421

　　6 lｉ li-ping(李立平)，zｈａｎｇ jia-bao(张佳宝)，zｈｕ an-ning(朱安宁)，xｉｎｇ wei-qin(邢维芹).acta pedologica sinica，2004，41（６）: 881~888