猪囊尾蚴cDNA文库的免疫学筛选和新基因

【摘要】 目的 从猪囊尾蚴cdna文库中筛选免疫学阳性蛋白的编码基因，为临床猪囊尾蚴患者的免疫学诊断提供特异的重组抗原。方法 用脑囊尾蚴病人血清免疫学筛选猪囊尾蚴cdna文库，阳性克隆经pcr技术扩增噬菌体载体中插入的dna片段，并将其克隆入pmd18t质粒载体中，测序结果与genbank中的核苷酸序列进行同源性分析。结果 血清免疫学筛选后，从猪囊尾蚴cdna文库中挑取了4个阳性斑，pcr后4个片段大小约在200～1800 bp，3个大的片段测序结果经分析表明均含有完整开放阅读框，同源序列分析结果显示获得的3个基因片段与genbank中已知的猪囊尾蚴蛋白基因无同源性。结论 本试验中所发现的基因均是猪囊尾蚴新基因，为进一步基因克隆、表达和鉴定等研究奠定了基础。

【关键词】 囊尾蚴； 基因文库； 克隆，分子； 序列分析

【基金项目】 安徽省高等学校青年教师科研资助计划自然科学项目(2006jq1094)；安徽医科大学科学技术研究基金项目(2006kj08)

　　immunoscreening of taenia solium metacestodes cdna library and discovery of new genes

　　huang li, zheng shengsheng, sun junmin, guang shengfang, wang xuelong.

　　ment of parasitology, anhui medical university, hefei 230032, china; college of traditional chinese medicine, hefei 230038, china; of public health, anhui medical university, hefei 230032, china; people's hospital, luan 237005, china

　　【abstract】objective to discover new diagnostic protein genes. methods taenia solium metacestodes cdna library was immunoscreened with mixture serum of taenia solium neurocysticercosis. the 4 positive clones were selected. the insert genes were amplified with pcr. the products from pcr were cloned into pgemt vector and followed by sequencing. the genes obtained were compared against emblparasites database and genbank datebase by blastn and blastx. results a total 4 positive clones were randomly selected for sequencing. from these clones, 3 estquality sequences were obtained. they were putatively identified sequence of other organisms, and had no matches in the database of taenia solium metacestodes. conclusions new genes of taenia solium metacestodes have been discovered. it provides the basis for further study on its immunological diagnosis.

　　【key words】 taenia solium metacestodes; gene library; cloning, molecular; sequence analysis
(chin j dis control prev 2008，12(1)：47)

囊尾蚴病是由猪带绦虫的中绦期囊尾蚴引起的一种危害严重的人畜共患寄生虫病。该病呈世界性分布，以发展中国家较为多见；我国人体囊尾蚴病分布广泛，据新近统计在29个省(区/市)的675个县市有流行［1～3］。

　　目前，临床上尤其是深部组织的囊尾蚴病主要依赖于血清免疫学及影像学进行诊断。市售猪囊尾蚴病诊断试剂主要是用虫体抗原检测病人血清中的循环抗体，易与其他寄生虫病产生交*反应，且虫源抗原短缺，应用受到一定的限制。

本研究采用脑囊尾蚴病人血清筛选囊尾蚴cdna文库，从中筛选出阳性克隆，测出其抗原的编码基因，并在表达载体对其进行克隆、表达和鉴定，进一步对纯化的重组蛋白的抗原特性、诊断价值进行研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　猪囊尾蚴cdna文库、猪囊尾蚴病人血清、大肠杆菌xl1blue均由安徽医科大学寄生虫学教研室保存提供。

　　1.2 主要试剂

　　hind iii、bamh i和pmd18t克隆载体购自大连宝生物公司，辣根过氧化物酶标记羊抗人igg购自北京中杉金桥公司。琼脂糖凝胶dna纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京道普生物科技有限公司。琼脂糖为丹麦litex 公司产品；胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂为英国oxoid 公司产品；余为国产分析纯。

　　1.3 病人血清的预吸收

　　xl1blue大肠杆菌-20 ℃反复冻融；用功率400 w超声粉碎，获得裂解液。1 ml病人血清加7 ml菌体裂解液，摇12 h，10 000 rpm离心收上清，再分2次分别加8 ml和16 ml大肠杆菌裂解液，同上处理收上清，分装-20 ℃备用。

　　1.4 猪囊尾蚴cdna文库的筛选

　　挑取单个xl1blue菌落接种入15 ml lb液体培养基(1m硫酸镁150 μl，20%的麦芽糖150 μl)。37 ℃，220 rpm振荡培养过夜。离心弃上清，用7.5 ml 10 mm的硫酸镁重悬沉淀。加1∶20稀释的cdna文库及上述菌悬液孵育，铺板培养。覆盖醋酸纤维素滤膜(nc)，继续培养4 h。做不对称的位置标记后，小心剥离nc膜。漂洗后于5％脱脂奶粉中封闭，置于已预吸收的抗血清中，孵育后pbstween中漂洗，浸入羊抗人hrpigg过夜。再洗后，dab底物显色。根据nc膜上阳性反应环的位置，挑取lb平板上相应的噬菌斑，4 ℃保存备用［4］。

　　1.5 pcr扩增

　　上下游载体臂上通用引物5′aattaaccctcactaaaggg3′，5′gtaatacgactcactatagggc 3′。扩增条件为：预变性94 ℃，2.5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，33个循环，72 ℃延伸，10 min。pcr产物进行1%琼脂糖凝胶电泳及切胶回收。

　　1.6 阳性克隆鉴定、测序及同源性分析

　　按文献［5］pcr纯化产物与pmd18t载体连接，连接产物转化感受态xl1blue菌，在含氨苄青的lb固体培养基中过夜培养，次日挑选单个菌落摇菌提取质粒，用hind iii和bamh i进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳检测，质粒送上海生工测序。运用pubmed中blast程序与ncbi数据库在核苷酸水平进行同源性分析(blast)。

　　2 结果

　　2.1 cdna文库的免疫学筛选

　　确诊阳性脑囊尾蚴病人血清为第一抗体，山羊抗人hrpigg为第二抗体，对cdna文库进行筛选，nc膜上深黄色、边缘整齐的单个噬菌斑初步定为阳性克隆(图1)。

　　2.2 阳性克隆cdna的pcr

　　挑取阳性克隆，利用设计的上下引物进行pcr扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检查cdna插入片段长度约为200～1 800 bp左右(图2)。

　　2.3 阳性克隆cdna片段的克隆和鉴定

　　pmd18t载体连接和pcr产物连接，产物转化感受态细胞，提取质粒dna，经hind iii和bamh i双酶切，电泳后插入片段的长度与pcr结果相符(图3)。

　　2.4 序列测定与同源性分析

　　挑取了有插入片段的4个重组噬菌体单克隆进行序列测定，获得的序列送genbank进行同源性分析。结果表明，4条序列均有est价值，均为未知的猪囊尾蚴序列，其中之一基因的开放阅读框序列及编码的氨基酸序列见图4，序列成功登录于genbank 中，录入号为 eu009656。

　　3 讨论

国内外已有多个实验室在进行猪囊尾蚴重组抗原的研究。chung等［4］筛选猪囊尾蚴cdna文库获得一个mr为10 kda的抗原基因克隆tsm。原核表达的重组抗原对活动性猪囊尾蚴病的敏感性为97%，对其他寄生虫病和健康者血清特异性为98%。该基因在真核表达系统中表达并用于猪囊尾蚴病患者血清和脑脊液elisa检测，用猪囊尾蚴囊液粗抗原作比较，结果真核表达的重组蛋白(rtsm10)总敏感性和特异性分别为94.3%和96.4%，而囊液粗抗原分别为95.7%和84.5%［6］。苏彩霞等［7］将猪囊尾蚴磷蛋白p12基因克隆到毕赤酵母菌表达系统分泌性表达载体，经过培养条件的初步优化获得稳定表达目的蛋白的重组蛋白菌株，表达产物的sdspage检测结果表明，表达量占33％，分子量为12.6 kda，westernblot分析结果表明，重组磷蛋白能被囊尾蚴病人阳性血清抗体识别。

由于阳性病人的血清中可能含有大肠杆菌抗体，为减少或消除免疫学筛选过程中造成的假阳性结果，必须先去除所用血清中的大肠杆菌抗体。通常去除大肠杆菌抗体的方法有：假筛选法、大肠杆菌裂解液吸收法以及亲和层析法。本实验稍做改变，对去除大肠杆菌抗体采用大肠杆菌裂解液nc膜吸收法，即先用nc膜吸附大肠杆菌裂解液中的蛋白质，再用此nc膜与稀释后的抗血清共同温育，反复3次。此方法尽可能地保持了抗血清中抗体的量和活性；吸收较完全；实验操作简单、无需其他特殊试剂，且节省了材料。

分析本实验所获得的基因可知，其含有一个684 bp的开放阅读框序列及编码了227个氨基酸，核苷酸序列与目前genbank中基因无同源性，所编码的蛋白质理论分子量25.9 kda，等电点6.68。其他如基因结构、蛋白功能等分析正在进行，为下一步的扩增、克隆、表达及鉴定等工作做准备。

【参考文献】
　　［1］甘绍伯. 囊虫病 ［m］. 北京：人民卫生出版社， 2002.

　　［2］许隆祺，余森海，徐淑惠. 中国人体寄生虫分布与危害 ［m］. 北京：人民卫生出版社， 2000.244250.

　　［3］杨艳君，戚慧，马巧荣，等. 多发小囊型脑囊虫病的诊断与治疗研究 ［j］. 疾病控制杂志， 2005，9(6)：673674.

　　［4］chung jy, bahk yy, huh s, et al. a recombinant 10kda protein of taenia solium metacestodes specific to active neurocy sticercosis ［j］. j infect dis， 1999，180(4):13071315.

　　［5］j.萨姆布鲁克，ef.费里奇，t.曼尼阿蒂斯著，金冬雁，黎孟枫，等译. 分子克隆实验指南 ［m］. 第2版. 北京：科学出版社， 1993.5765911.

　　［6］lee eg, lee my, chung jy, et al. feasibility of baculovirusexpressed recombinant 10kda antigen in the serodiagnosis of taenia solium neurocysticercosis ［j］. trans r soc trop med hyg, 2005,99(12):919926.

　　［7］苏彩霞，才学鹏，韩雪清，等. 猪囊尾蚴磷蛋白在毕赤酵母中的表达及初步应用 ［j］. 生物工程学报， 2003，19(4)：424427.