F肌动蛋白与负电荷磷脂膜的相互作用研究

【摘要】 　　细胞膜的内膜含有大量的负电荷磷脂，研究f肌动蛋白与负电荷磷脂的相互作用将有助于更深入地了解细胞骨架与细胞膜的体内相互作用机制。在金片和金电极上分别构建了负电荷磷脂的杂化双层磷脂膜，通过表面等离子体共振方法(spr)和电化学阻抗技术研究了f肌动蛋白与负电荷磷脂膜的相互作用。结果表明，f肌动蛋白可以在没有中间联系蛋白的情况下，直接与负电荷磷脂膜发生相互作用。钙离子可以有效地促进它们的相互作用，表明钙离子在其中发挥了重要作用。高浓度的kcl显著抑制它们的相互作用，表明这种相互作用主要受静电作用影响。实验结果进一步证明在f肌动蛋白与负电荷磷脂膜相互作用时，除了可以通过其它蛋白发生间接相互作用外，还可以与磷脂膜发生直接的相互作用。

【关键词】 肌动蛋白 负电荷磷脂膜 表面等离子体共振 电化学阻抗

　　1 引言

　　肌动蛋白是一种在细胞中广泛存在的细胞骨架蛋白，参与例如细胞迁移、细胞分裂、吞噬作用、细胞黏附和形态发生等细胞过程[1]。以单体形式存在的肌动蛋白称为g肌动蛋白。在二价阳离子如ca2+、mg2+等存在的条件下，肌动蛋白单体在浓度高于某一关键浓度时会多聚化成为纤维状分子，称为f肌动蛋白[2]。肌动蛋白一般以其多聚化的形式发挥功能。在多聚化过程中，结合的atp分子水解为adp[3]。

　　f肌动蛋白必须锚定到细胞膜上才能发挥它的功能。事实上，细胞骨架蛋白，包括f肌动蛋白、中间纤维、微管及相关蛋白都必须以一定方式锚定到浆膜上来发挥功能[4]。一般认为f肌动蛋白通过膜蛋白复合物连接到细胞膜上，包括膜桥蛋白[5]、肌浆球蛋白i[6]、富组亲动蛋白[7]、血影蛋白[8]等等。，有研究指出，肌动蛋白也可以在没有中间联系蛋白的情况下直接与膜磷脂发生相互作用[1]，其作用机制可能包括静电相互作用。然而，多数研究中采用的磷脂为带正电荷的磷脂或中性磷脂，f肌动蛋白与负电荷磷脂的相互作用很少有人报道。众所周知，细胞膜的内膜含有大量的负电荷磷脂，因此研究f肌动蛋白与负电荷磷脂的相互作用将有助于更深入地了解细胞骨架与细胞膜的体内作用机制。

　　表面等离子体共振（spr）已经被广泛用来研究生物分子相互作用，包括dna蛋白、抗原抗体、酶底物、受体配体等[9，１０]。电化学阻抗也是一种表面敏感的技术，因其简单性及高的灵敏性，已经被广泛用来研究生物分子的相互作用[1１]。本研究在spr金基底上和金电极上分别构建了负电荷磷脂的杂化双层膜（hbm），并通过spr和电化学阻抗方法研究了f肌动蛋白与负电荷磷脂膜的相互作用。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　spr实验采用autolab spr系统(eco chemie bv, 荷兰)，金片在使用前于新制的piranha 洗液(75％h2so4/25％h202)中浸泡2 min，然后用蒸馏水和乙醇依次洗涤。金片通过折射率匹配液固定在半圆棱镜上，再将spr检测池安装在金片上。spr数据的记录频率为0.5 hz。电化学实验在autolab pgstat30电化学分析系统上进行(eco chemie b.v. 荷兰)，循环伏安测定控制软件为gpes 4.9。电化学阻抗测定控制软件为frasoftware 4.9。采用传统的三电极系统，金电极作为工作电极，ag/agcl(饱和kcl)电极作为参比电极，大的铂片作为对电极。5 mmol/l k4[fe(cn)6]/k3[fe(cn)6]溶于２ mmol/l trishcl 溶液中(含 0.1 mol/l kcl, ph 7.4)作为氧化还原探针。阻抗记录频率为0.1～100000 hz，扰动幅度为5 mv。

　　肌动蛋白(牛的肌肉组织)购自sigma公司，使用前未经进一步纯化，所得蛋白为单体形式，溶于低离子强度的缓冲液中：2 mmol/l trishcl, 0.2 mmol/l atp，ph 7.4 (g缓冲液)。肌动蛋白的多聚化在f缓冲液(2 mmol/l trishcl，ph 7.4, 0.2 mmol/l atp, 不同浓度的cacl2和kcl)中完成，hexanethiol由acros公司购得。1,2dipalmitoylsnglycero3phosphorac(1glycerol) sodium salt (dppg)磷脂购自sigma公司。其它试剂为国产分析纯。实验用水是二次蒸馏水再经美国milliq公司超纯水处理系统处理得到的超纯水。

　　2.2 脂质体的制备

　　脂质体的制备参照文献[12]：dppg磷脂溶于氯仿/甲醇(2/1)中，置于玻璃瓶中。溶剂用氮气吹干，将样品放在真空干燥器中过夜，以除去残留的氯仿。再用2 mmol/l trishcl (ph 7.4，含0.1 mol/l kcl) 缓冲液将磷脂重悬，使其终浓度为0.5 g/l, 然后将磷脂的悬液在水浴中超声至澄清(约2 h)。

　　2.3 spr实验

　　自组装hbm过程及f肌动蛋白与hbm的相互作用通过spr系统实时监测。每次注射前，spr检测池用2 mmol/l trishcl (含0.1 mol/l kcl, ph 7.4)平衡大约10 min，反应完成后，再用同样的缓冲液清洗。组装烷基硫醇单层时，将1 mmol/l 的烷基硫醇的乙醇溶液注入spr检测池中，至少组装12 h。用缓冲液冲洗后，将脂质体注射入spr检测池中。hbm的形成过程通过一系列spr角度变化曲线实时监测。用缓冲液冲洗几次spr检测池，将f肌动蛋白注入spr检测池中，记录spr的时间曲线。

　　2.4 电化学实验

　　金电极首先在抛光布上用al2o3抛光粉(1, 0.3, 0.05 μm)仔细抛光，并用超纯水清洗，然后在1 mol/l h2so4中在－0.2～1.55 v之间进行循环电位扫描直至得到标准的金电极的氧化还原峰。金电极再经大量水和乙醇冲洗，并用氮气吹干。清洗后的金电极放置于1 mmol/l 烷基硫醇的乙醇溶液中12 h进行自组装，然后用乙醇和水依次冲洗，除去非特异吸附的物质。在电化学鉴定烷基硫醇的自组装膜后，电极再放入脂质体中进行组装。hbm形成后，金电极再转入到f肌动蛋白的溶液中。

　　3 结果与讨论

　　图 1 裸金表面(a),烷基硫醇修饰的金表面(b)和磷脂膜修饰的金表面(c)的spr角度曲线（略）

　　fig.1 angleresolved surface plasmon resonance (spr) curves for a bare au film (a) and the same surface modified with hexanethiol (b) and then coated with lipid membrane (c)

　　3.1 spr系统

　　图1显示的是hbm形成过程的spr角度曲线。当烷基硫醇的自组装膜在金基底上形成后，spr角向正方向迁移；当脂质体沉积在烷基硫醇上并形成磷脂膜后，spr角进一步向正方向迁移。在biacore spr仪器中，在传感表面完全覆盖一层磷脂酰胆碱(dppc)的单层膜时,可以引起2200 ru的信号响应[13]，相当于在传感表面磷脂的表面浓度为2.2 ng/mm2 (0.92±0.05 pg/(mm ru)。在autolab spr仪器中，表面磷脂浓度变化1 ng/mm2将会引起132毫度的spr角度变化。本实验中，磷脂膜的形成引起了320毫度的spr角度迁移，可以推算出320毫度的spr角度迁移相当于表面磷脂的浓度为2.4 ng/mm2。使用的dppg磷脂的分子量与磷脂酰胆碱相近，因此表面磷脂浓度变化2.4 ng/mm2相当于在传感表面上形成了磷脂的单层膜。

　　在ca2+存在的条件下，肌动蛋白单体会被激活。当达到临界浓度时，肌动蛋白单体会发生多聚化。根据文献报道，在本文采用的实验条件下，临界浓度为4.4 mg/l[3]。本实验中，所用的肌动蛋白的最低浓度为 5 mg/l，因此可以确保所得到的激活后的样品为f肌动蛋白。图2为不同浓度的f肌动蛋白与dppg磷脂膜相互作用的实时传感图。从传感图上，可以直接观察到f肌动蛋白与磷脂膜的结合和解离。随着f肌动蛋白浓度的增加(5, 10, 15, 20和30 mg/l)，spr角分别向正方向迁移了76.0, 118.4, 151.5, 167.6, 193．０毫度。结果表明f肌动蛋白可以在没有中间联系蛋白的情况下，直接结合到负电荷的磷脂膜上，并且结合的数量与蛋白的浓度成正相关。

　　3.2 电化学阻抗表征

　　电化学阻抗技术也被用来研究f肌动蛋白与负电荷磷脂膜的相互作用。图3显示的是裸金电极(曲线a)、烷基硫醇修饰的金电极(曲线b)、磷脂膜修饰的金电极(曲线c)的阻抗图。用改进的randle等效电路对阻抗结果进行拟合(图3内插图)。根据文献[1４]，在烷基硫醇/磷脂膜系统中，磷脂层的特异性电容(cmpl)为得到双层电容(cmbilayer)和硫醇自组装层的电容(cmmonolayer)串联计算得到。

　　图2 不同浓度的f肌动蛋白与负电荷磷脂膜相互作用的实时传感图（略）

　　fig.2 representative overlaid sensorgrams illustrating the realtime interaction of factin at different concentrations with the negatively charged lipid membrane

　　f肌动蛋白浓度 (concentration of factin)： a． 5 mg/l； b． 10 mg/l； c． 15 mg/l； d． 20 mg/l； e． 30 mg/l； f缓冲液组成 (the composition of fbuffer)：2 mmol/l trishcl(ph 7.4), 0.2 mmol/l adenosine triphosphate(atp), 2 mmol/l cacl2, 0.1 mol/l kcl。

　　图3 复合阻抗图。内插图为拟合阻抗数据用的平衡电路（略）

　　fig．3 complex plane impedance plots. inset: equivalent circuit model used to fit the impedance data

　　a． 裸的金电极表面 (baregold electrode)； b． 烷基硫醇修饰的金电极表面 (hexanethiolmodified electrode)； c． 磷脂膜修饰的金电极表面 (1,2dipalmitoylsnglycero3phosphorac(1glycerol)sodium salt (dppg)coated electrode)。

　　图4 复合阻抗图（略）

　　fig．4 complex plane impedance plots

　　a． 磷脂膜修饰的金电极表面 (dppgcoated electrode)； b． 磷脂膜修饰的金电极浸入到不含f肌动蛋白的f缓冲液中 (dppgcoated electrode after incubation in fbuffer without factin)； c． 磷脂膜修饰的金电极与10 mg/l f肌动蛋白相互作用 (dppgcoated electrode after interaction with 10 mg/l factin)。f缓冲液组成 (the composition of fbuffer)：2 mmol/l trishcl (ph 7.4), 0.2 mmol/l atp, 2 mmol/l cacl2, 0.1 mol/l kcl。
　　
　　将磷脂膜作为平板电容器来处理，磷脂膜的电容和厚度的关系可以表示为：

　　cmpl=ε0к/d（2）其中ε0为真空介电常数(ε0=8.85×10－14 f／cm), к为磷脂的介电常数(к=2.1)[1４]。通过计算，得到磷脂膜的厚度大约为3.32 nm，而dppg单层膜的厚度为3.12 nm [1５]，因此所形成的膜为磷脂单层膜。这也表明在金电极上成功构建了硫醇/磷脂的杂化双层膜。

　　hbm修饰的金电极首先浸入到不含f肌动蛋白的f缓冲溶液 (2 mmol/l trishcl, 0.2 mmol/latp, 2 mmol/l cacl2, 0.1 mol/l kcl, ph 7.4)中约3 h，如图4所示，磷脂膜的电子转移阻抗rm值为192 kω，略有下降(曲线b)，这主要是由于ca2+结合到了磷脂膜上的两相邻磷脂分子的极性头部，从而导致了磷脂分子的重排[1６]。当此电极再浸入到10 mg/l f肌动蛋白中0.5 h后，rm值显著增加，为282.6 kω(曲线c)，表明f肌动蛋白结合到了磷脂膜上，并产生了一个大的电子转移阻抗阻碍了氧化还原探针到达电极表面。阻抗结果也证明了f肌动蛋白可以直接和负电荷的磷脂膜相互作用。

　　图5显示的是不同浓度的f肌动蛋白与磷脂膜相互作用后电子转移阻抗的变化值(δrm)。其中，δrm为不同浓度的f肌动蛋白与磷脂膜相互作用后的rm与磷脂膜在fbuffer中稳定后的rm之差。δrm随着f肌动蛋白浓度的增加而增加，表明f肌动蛋白与负电荷磷脂膜的相互作用与蛋白浓度有关。

　　图5 不同浓度的f肌动蛋白与磷脂膜相互作用后电子转移阻抗的变化值（略）

　　fig．5 ｐlot of the δrm values vs the concentrations of factin

　　3.3 ca2+与盐浓度对f肌动蛋白与负电荷磷脂膜相互作用的影响

　　已有很多文献报道了f肌动蛋白与正电荷及中性磷脂膜相互作用，其相互作用力中都包含静电作用。本实验通过用spr技术研究ca2+与盐浓度对f肌动蛋白与负电荷磷脂膜相互作用的影响，并对它们的相互作用力进行了初步探讨。

　　ca2+在肌动蛋白磷脂复合物的形成过程中起着重要作用。ca2+对f肌动蛋白与负电荷磷脂膜相互作用的影响如图6所示。ca2+在样品中的浓度越大，spr角度向正方向迁移的也越多，表明ca2+可以有效的促进f肌动蛋白与负电荷磷脂膜的相互作用。

　　在高浓度的盐溶液中，f肌动蛋白与负电荷磷脂膜相互作用受到抑制。如图7所示，0.1 mol/l kcl即可显著抑制f肌动蛋白与负电荷磷脂膜的结合。当kcl浓度增高时，抑制作用更加明显。然而，在1 mol/l kcl的溶液中，仍然有少量f肌动蛋白结合在负电荷的磷脂膜上。表明静电力在f肌动蛋白与负电荷磷脂膜的相互作用中起着主要作用，磷脂的酰基链与肌动蛋白疏水区域的疏水力也起着一定作用。

　　图6 ca2+对f肌动蛋白与负电荷磷脂膜相互作用的影响（略）

　　
　　fig．6 effect of ca2+ on the interaction of factin with the negatively charged lipid membrane
f肌动蛋白浓度(the concentration of factin): 5 mg/l。f缓冲液组成 (the composition of fbuffer)：2 mmol/l trishcl (ph 7.4)，0.2 mmol/l atp, 0.1 mol/l kcl, 0～10 mmol/l cacl2。

　　图 7 盐浓度对f肌动蛋白与负电荷磷脂膜的相互作用的影响（略）

　　fig．7 effect of the salt concentration on the interaction of factin with the negatively charged lipid membrane

　　f肌动蛋白浓度(the concentration of factin): 5 mg/l。f缓冲液组成 (the composition of fbuffer)： 2 mmol/l trishcl (ph 7.4), 0.2 mmol/l atp, 2 mmol/l cacl2, 0 ～ 1 mol/l kcl。

　　在ph 7.4时，f肌动蛋白与dppg磷脂膜都带负电荷，它们应该是互相排斥的。然而，实验中发现它们可以发生直接相互作用，并且高浓度的kcl可以显著抑制这种相互作用。表明尽管有其它作用力的存在，它们的相互作用主要受静电作用控制。ca2+可以有效地促进f肌动蛋白与负电荷磷脂膜的相互作用,表明ca2+在其中发挥了重要作用。文献［１７］报道，二价阳离子如ca2+、mg2+等，可以结合在负电荷磷脂的头部区域，并中和磷脂所带的电荷，从而减弱f肌动蛋白与负电荷磷脂的排斥力。g肌动蛋白已被证明可以直接结合在负电荷磷脂膜上(在ph 7.0时，g肌动蛋白也是负电性的)，其作用机制主要源于g肌动蛋白中含有3个荷正电的氨基酸残基(hisarglys)，通过静电作用可以吸附在负电荷磷脂膜上。而f肌动蛋白是由g肌动蛋白构成的，因此f肌动蛋白也可能通过这种静电作用结合在负电荷磷脂膜上。bihan等［１８］采用膜平衡技术研究了气水界面上的肌动蛋白磷脂复合物，发现f肌动蛋白通过一种典型的静电作用方式与负电荷磷脂膜相互作用。

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