基于稳定同位素标记与质谱分析的蛋白质定量算

摘要】 　　蛋白质定量研究已成为蛋白质组学的热点，它是疾病相关生物标志物发现的重要途径。基于稳定同位素标记的质谱分析技术是蛋白质定量最常用的方法之一。随着实验方法的发展和改进，定量数据处理方法也在不断更新与完善。一般来说，定量数据处理包括四步：搜库鉴定、图谱定量信息提取与计算、肽段丰度比计算和蛋白质丰度比计算及差异显著性分析，其中后三步是数据处理的核心。目前，后三步中每步都有多种可选算法，这些算法一般都是针对特定实验技术而提出的，缺乏深入的工作对它们进行系统比较和优化。为此，在总结目前主要实验技术方法的基础上，论述了定量算法的现状和存在问题，并针对一些问题提出了可行的解决办法。

【关键词】 定量蛋白质组 质谱 稳定同位素标记 定量算法 评述

　　1 引言

　　自1994年提出蛋白质组学的概念以来，该项研究已逐步走向深入。与基因组相比，蛋白质组是一个动态概念[1]，它不仅要从整体上系统地、大规模地研究一个组织、器官或细胞中表达的全套蛋白质的结构，而且要全面研究这些蛋白质的动态性质和行为。随着实验技术的进步及研究的深入，定量蛋白组学已成为研究热点，它不仅鉴定一个基因组表达的蛋白质，而且要对其丰度进行测量。目前，大规模蛋白质定量技术是定量蛋白质组学研究的主要内容之一，也是疾病相关生物标志物发现的重要途径与手段[2]。

　　目前，大规模蛋白质定量技术主要分为四大类：（1）基于双向电泳（2de）光密度的定量[3]；（2）基于稳定同位素标记与质谱分析的定量[4,5]；（3）基于质谱分析的无标记定量[6]；（4）基于免疫印迹和蛋白质芯片的定量。其中第一类技术由于固有缺陷而慢慢淡出；第二类技术目前应用最为广泛和成熟；第三类技术有很大的应用前景，但目前有一些关键问题尚未完全解决[7]；第四类技术定量准确度最高，但价格昂贵，且大规模应用还存在一些困难。

　　以发现生物标志物为目的，基于稳定同位素标记与质谱分析的蛋白质定量技术，其典型流程如图1所示，该流程分为实验与定量数据处理两部分。实验部分由以下3步完成：首先，从组织或器官提取出需对比样品，并对样品进行预处理，包括酶切、稳定同位素标记、混合等；其次，对得到的肽段混合物进行色谱分离，减少同时进入质谱仪样品的复杂度；最后，对肽段进行质谱分析，产生一级图谱与二级图谱。不同肽段在一级图谱中表现为不同质荷比和强度的谱峰，且肽段经过惰性气体诱导碰撞（collisioninduced dissociation, cid）碎裂产生的碎片离子在二级图谱中也表现为不同质荷比和强度的谱峰[8]。

　　定量数据处理由以下４步完成：（1）搜库鉴定 利用二级图谱，通过搜库得到肽段与蛋白质的鉴定结果；（2）图谱定量信息提取与计算 肽段经过轻重标记后会附加质量不同的质量标签（mass tag），它们将在一级图谱表现为具有固定质荷比差异的谱峰，而峰的信号强度就是基本的定量信息。在这种情况下，定量信息是包含在一级图谱中，现在大部分标记技术都属于这种情况，只有itraq标记[9]，它的定量信息包含在二级图谱中。针对上述两种情况，图谱定量信息提取就是从一级或二级图谱中提取特征峰的信号强度。由于高精度质谱仪给出的是谱模式（profile）图谱，同位素峰簇面积与肽段丰度成正比[10]，所以在提取出信号强度后，还需要进行噪声去除、面积积分等计算才能得到基本的定量信息;（3）肽段丰度比计算 由于肽段的色谱峰会持续一段时间，在这个过程中肽段会被多次质谱分析。所以，需要将肽段色谱流出时间内提取的定量信息综合。一般通过构建肽段的离子流色谱峰xic（extracted ion chromatography）[1１]来综合定量信息，并在此基础上计算与肽段丰度成正比的定量指标，进一步计算肽段的丰度比；（4）蛋白质丰度比计算与差异显著性分析 首先通过蛋白质与肽段的对应关系，从肽段丰度比推断得出蛋白质丰度比；其次对一批蛋白质的丰度比进行统计分析，确定差异显著性，从而确定候选生物标志物。当然，后续的生物学实验验证,例如western blot实验，是最后确定生物标志物的决定性步骤。

　　本文首先简单总结了基于稳定同位素标记的质谱定量实验方法，及其对定量数据处理方法的影响，并在此基础上，详细分析了定量数据处理方法的基本流程和算法，着重论述了定量算法的现状、存在问题，并针对其中一些问题提出了可行的解决办法。

　　2 蛋白质的稳定同位素标记质谱定量分析方法

　　从图1中的实验部分可看出，实验方法主要包括稳定同位素标记与质谱分析，它们的主要作用是引入质量差异和产生包含蛋白质定性与定量信息的图谱数据。

　　图１ ｓhortgun实验策略中，基于稳定同位素标记与质谱的蛋白质定量分析及发现生物标记物流程图（略）

　　fig.1 ｆlowchart of protein quantification and biomarker discovery based on stable isotope labeling and mass spectrometric analysis in shortgun strategy

　　目前，常用的稳定同位素标记分为体内标记和体外标记。体内标记主要有15n[1２]、13c、silac[1３]标记，体外标记主要有18o[1４]、icat[1１]、cicat[1５]、icpl[1６]、itraq标记等。这些标记方法从本质上来说，都是在肽段序列上引入不同标签，从而在质谱分析中区分不同来源的肽段。利用不同的质谱平台可以对蛋白质进行分析，将产生不同格式与精度的图谱数据。从本质来说，质谱分析就是要把蛋白质和肽段的结构与丰度信息以图谱的形式展现出来。由于实验产生的数据在格式、定量信息表现形式、误差、噪声等方面的不同，需要根据实验方法选择不同的定量数据处理方法，且实验方法的改进必然要求其处理算法的更新。实验技术从以下几个方面影响数据处理方法及其算法的研究。

　　２．１ 标记方法的差异

　　标记方法不同，在定量信息的表现形式、标记效率、定量动态范围、定量准确度等方面有很大差异。例如，itraq标记与其它标记方法相比，它的定量信息包含在二级图谱中，且它可以同时对8个样品进行定量分析，而其它标记方法只能同时对两个样品进行分析，但它同时存在饱和效应[1７]问题。再如，18o标记效率比较低，不同肽段的标记效率不同，且轻重标记肽段形成的谱峰可能会重叠在一起[1８]。这些差异，使数据处理时需要局部优化，分别对待。

　　２．２ 标记方法的不断发展

　　为了改进标记技术在标记效率、适用条件（例如逼近生理条件）等方面的性能，不同的标记方法还在不断的改进之中，且新的标记方法也不断被提出。例如，ab公司在2007年推出的可同时对8个样品进行定量分析的itraq试剂，panchaud等[1９]提出的，可以同时对蛋白质中的氨基与羧基进行标记的anibal (stableisotopebased quantitative proteomics by aniline and benzoic acid labeling of amino and carboxylic groups)标记方法。新标记技术有新的定量信息表现形式，需要新的算法和软件支持。标记技术的不断发展和更新，导致已有的算法和定量软件还没有得到优化和发展至稳定的版本，这就需要面对标记技术新的发展，开发和研究新的定量算法，于是，给算法研究和通用工具的开发带来了一定困难。

　　２．３ 仪器平台的不同

　　不同实验方法所适用的仪器平台有较大差异，且不同仪器产生的数据在格式与精度方面都不尽相同。例如，thermo与ab公司的质谱仪产生的数据格式不同，离子阱质谱仪比傅里叶变换质谱仪产生数据精度低，而低精度数据更容易受到噪声和随机因素的影响。不同的仪器平台，导致通用数据分析算法研究和软件开发困难。

　　２．４ 实验策略中的细节问题

　　例如，为了提高蛋白质定量的动态范围，先通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（sdspage)分离蛋白质，再逐个分析不同条带中的蛋白质。由于各种原因，相邻条带间可能存在相同蛋白质，那么在数据处理时，就要对相同蛋白的定量结果进行合并[２０]。由此可见，实验策略中的细节问题也会引起定量数据处理方法的不同。

　　总之，不同实验方法决定不同定量数据处理方法，它的改进需要定量算法及软件的及时更新。

　　3 定量算法

　　定量算法主要是为完成从图谱信号到蛋白质定量的信息解析，完成信息表现形式的转换和统计分析。虽然不同实验方法需要不同数据处理方法，但这些不同处理方法可抽象为以下四步（图1中定量数据处理部分）：（1）搜库鉴定；（2）图谱定量信息提取与计算；（3）肽段丰度比计算；（4）蛋白质丰度比计算及差异显著性分析。其中步骤1，一般由商业化软件来完成的，例如sequest[2１]和mascot[2２]，且数据库搜索结果的评估也有比较成熟的方法和软件可以使用[2３]，例如，基于随机数据库[2４]的方法和peptideprophet[2５]。对于2、3、4步骤，每步虽然有许多可选算法，但这些算法都存在一些问题。第1步是定量数据处理的基础，其它３步骤都是在此基础上进行的，是定量数据处理的核心，主要完成从图谱中查找、提取、计算定量信息，并最终计算出蛋白质丰度比。下面对定量数据处理中的核心算法进行论述。

　　3.1 图谱定量信息的提取与计算

　　图谱定量信息提取是根据搜库鉴定结果，从肽段色谱流出时间段内的一级图谱或二级图谱中提取轻重肽段的谱峰信号，并且进行噪声和基线去除等信号处理。如果定量信息包含在一级图谱中，就需要根据母离子的质荷比和电荷状态，在一级图谱中查找不同标记肽段形成的具有确定质荷比差异的配对峰；如果定量信息包含在二级图谱中，则要根据报告离子的质荷比，在二级图谱中查找配对峰。

　　现在常用的提取方法有设定误差容限法[１０]和同位素匹配法[2６]两种。其中第一种方法是在一级或二级图谱中，寻找与母离子或报告离子质荷比在一定误差容限（mass error tolerance）范围内相匹配的配对峰。这种方法是比较简单的，也是现在定量软件中主要采用的方法，但是，这种方法会因为噪声峰和叠加峰簇的影响而找到虚假的配对峰。第二种方法在匹配的同时也进行同位素峰簇的匹配，有更好的准确性。目前的提取方法大都比较简单，不能充分利用天然同位素的分布信息，也没有考虑同位素峰个数随信号强度的变化，因为在手工读图中发现，信号强度比较强的峰簇可能有6个同位素峰，而信号比较弱时，可能只出现一个同位素峰。虽然也有人提出仅仅利用同位素峰的分布和标记引入的固定差异，而不利用搜库鉴定结果，来寻找和确认配对峰簇[2７]。但是受到噪声、峰簇叠加等因素的干扰，以及质谱信号测量精度不高、肽段分子量在目前仪器精度水平下的区分能力等因素的限制，这种方法得到结果的可靠性还存在一定问题。另外，如果定量信息包含在二级图谱中，同位素峰匹配方法很难适用，因为目前大规模实验中，都是使用精度比较低的质量检测器（如：离子阱质量检测器）产生二级图谱，导致同位素峰簇很不明显。

　　图谱定量信息计算，是利用提取到的配对峰信号来计算肽段定量指标（表征肽段丰度）。由于质谱仪产生的图谱是谱模式（profile）的，即肽段母离子所形成的质谱峰是由多个离散采样的数据点所组成的。从理论上来讲，这个峰的面积代表了肽段的丰度，可以作为肽段定量指标。但实际计算中，受到噪声、采样点数目等因素的影响，面积计算可能会有比较大的偏差。

　　肽段定量指标的计算常用以下几种方法：（1）固定宽度积分法；（2）自动宽度积分法；（3）峰形拟合法；（4）最大值法；（5）峰内信号强度加和法。其中方法1和2都是需要先对峰进行平滑，再计算其面积，但这样会由于噪声峰和峰叠加而产生比较大的偏差，计算精度也会受到数据点多少的强烈影响。方法3是用给定的函数（常用高斯函数）来拟合谱峰[26]，面积计算比较简单，并可以同时将噪声、基线，甚至叠加峰采用统一的框架考虑，方法的适用范围比较好。方法4是用峰内信号的最大值来代替峰的面积[27],但是，实际数据分析发现，谱峰的面积和最大值并不严格成正比关系。这样，这种方法虽然可以在一定程度上克服噪声等因素的干扰，但是会引入内在的系统偏差。方法5是用峰内信号强度加和代替面积[1]，也就是固定区间长度积分法（相差一个比例因子），是目前应用中适用范围与计算准确度较好的一种方法。上述几种方法都未考虑质谱仪信号检测的随机性和饱和问题，这些会使低信噪比和高强度信号的可信度降低，从而使计算结果准确性降低。multiq软件[1７]虽然考虑了这些情况，但只是剔除掉这些不确定信息。要想得到准确的结果，就需要引入数据滤波等信号处理方法。

　　3.2 肽段丰度比计算

　　由于肽段在一次实验中表现为一个完整的色谱峰，所以需要综合整个色谱峰时间段内提取的图谱定量信息来计算肽段丰度比。一般是通过构建轻重标记肽段的离子流色谱峰xic（图2a所示），来综合肽段色谱流出时间段内提取的定量信息，并在此基础上利用xic的面积或其它特征计算轻重标记肽段丰度比。

　　图2 xic及肽段丰度比计算方法（略）

　　fig.2 extracted ion chromatography(xic) and methods to calculate peptide abundance ratio

　　1. 重标记肽段xic（heavily labeled peptide xic）; 2. 轻标记肽段xic（lightly labeled peptide xic），*：不同色谱流出时间重标记肽段丰度（肽段定量指标）（heavily labeled peptide abundance (peptide quantitative index) at different retention time），o：不同色谱流出时间轻标记肽段丰度（肽段定量指标）(lightly labeled peptide abundance (peptide quantitative index) at different retention time)。ａ． 原始ｘｉｃ（original xic）； ｂ． 三次样条平滑ｘｉｃ（cubic spline xic）； ｃ． 不同ｒｔ的肽段丰度值（peptide abundance ratio at each retention time）； ｄ．相对应轻重标记肽段丰度值（corres ponding heavy to light）； ｅ． 线性回归（linear regress）； ｆ． 主成分分析法（principle component analysis）。

　　３．２．１ 离子流色谱峰面积比 对配对轻重肽段的xic进行平滑（图2ｂ为３次样条平滑后的xic）、计算面积，然后计算比值得到轻重肽段的丰度比[10]。这种方法会受到xic中背景噪声的影响，而出现一定的偏差。

　　３．２．２ 直接平均法 先算出每个rt（retention time）时刻轻重标记肽段的丰度比ratio(rt)=heavy/light（图2c所示）。其中，heavy和light分别为时刻重/轻标记肽段的丰度值。然后对这些ratio进行平均[2８]，作为肽段的总丰度比。这种方法会因为轻重标记肽段的色谱行为差异而带来误差。

　　3.2.3 线性回归法 从理论上来说，不同rt时刻的heavy值与其相对应的light值应该是线性关系即（图2d）：reavy=ratio×light＋b。用线性回归的方法（结果如图2e所示）来估计b与ratio值，其中b受xic中的噪声影响，ratio对应肽段丰度比[29]。这种方法在计算肽段丰度比的同时，还在一定程度上减少xic中背景噪声影响。但显而易见的是这种方法不适于数据点少的情况。

　　3.2.4 主成分分析法 这种方法假设噪声和真实信号在统计意义上是正交的，把原含有噪声的heavy与light信息，转化成只包含定量信息的主成分p1和由噪声组成的次成分p2[30]。由图2ｆ可知：ii＝ｎi＋ｓi， ratio=tan(θp1)，其中，ni为第二主成分，si为第一主成分，ii为原轻重标记数据在主成分空间中的表示。同样，在xic内数据点少时，这种方法可能会出现较大误差。

　　3.3 蛋白质丰度比计算与差异显著性分析

　　根据肽段丰度比推断蛋白质丰度比，需要解决以下两个问题：（1）对于一个肽段匹配多个蛋白质（共享肽段）时，如何将肽段的丰度比在不同蛋白质之间进行分配；（2）如何对计算得到的蛋白质丰度比进行可信度评估。

　　对于第一个问题，目前尚未见文献报道直接的处理方法。现在的算法一般都避开这个问题，只对非共享肽段（仅匹配一个蛋白质）丰度比取中值[1]或加权平均[17]，以获得到蛋白质的丰度比，或对蛋白质对应的所有肽段丰度比进行平均[20]得到蛋白质丰度比。我们可以借鉴keller等[25]为解决肽段概率在不同蛋白质之间分配问题时，所采用的期望最大(expectation maximization, em）算法，对肽段丰度比进行迭代分配，避免去除共享肽段导致的蛋白质定量信息减少或缺失的现象。对于第二个问题，常用推断蛋白质丰度比的所有肽段丰度比的一致程度（标准差或相对标准差），来评估蛋白质比值的可信度[20]。

　　在完成蛋白质丰度比计算后，还要利用统计检验的方法给出蛋白质丰度比差异的显著性。目前一般是假设比值服从正态分布，利用3倍的标准差（3σ）来确定差异是否显著[2５]。在无标记定量的研究中，zhang等[3１]比较了多种差异显著性统计检验方法，发现基于正态分布假设的t检验并不是最好的选择。但是，在对稳定同位素标记产生的定量数据处理中，还没有类似的研究。通过数据分析，建立正确与严格的表达差异统计检验方法是亟待解决的问题。

　　3.4 定量软件

　　目前常用的一些定量分析软件如表1所示。这些软件都可免费下载，但各自适用不同的范围，例如，它们中只有asapratio及maspectras对蛋白质丰度比进行差异显著性分析，其它只是简单地计算出蛋白质丰度比，且itracker仅计算出肽段丰度比。另外，只有mfpaq考虑了不同条带间相同蛋白质定量结果合并问题。这些软件都存在对标记技术、搜库鉴定结果、仪器平台不兼容的问题，且它们的底层算法很多并不是最优的。

　　表１ 定量分析软件（略）

　　table 1 summary of software tools for protein quantification based on stable isotope labeling and mass spectrometry analysis

　　注（note）：其中源文件格式为质谱仪产生的数据格式或其转化格式（the source file format is the mass spectrum raw data format or its converted format）。

　　引入现代信号处理技术和基于统计的方法，将是算法研究的一个新方向。例如，coombes等[32]用udwt（undecimated discrete wavelet transform）来对质谱数据去噪，eckelpassow等[33]用回归的方法来对18o标记产生的数据进行分析。

　　4 讨论与展望

　　从图谱数据到蛋白质的定量要经过几个步骤才能完成，且每个步骤有很多可选算法来实现，但是这些算法往往不是最优的，存在不同的问题。现在算法的共同问题是，对质谱仪器信号测量的随机性、饱和性、以及随强度的变化性等，都没有进行系统分析与校正; 对低丰度蛋白质定量的准确性和鲁棒性不高，对定量结果没有进行正确与严格的可信度评估与差异显著性分析。

　　目前，还普遍存在实验产生的数据没被充分利用的问题，算法的优化和改进能让我们充分利用这些数据并指导实验技术的改进。应设计特定实验，构建标准数据集，引入现代信号处理技术与基于统计的方法，在标准数据集上对定量信息提取算法进行优化，对表达丰度比差异的显著性判定方法进行深入的研究，对信号测量的随机因素和饱和效应进行分析和校正，从而建立系统的质谱数据定量分析方法，并提供能够适应实验技术发展需要的软件工具，这将进一步提高蛋白质定量结果的准确性与可靠性，并为生物标志物的发现提供可靠保障。

　　随着实验技术的改进和算法的及时优化、更新，生物标志物的发现将更加方便、准确与快速，从而为疾病的发现、诊断、治疗与研究提供有力支撑。

　　致 谢 感谢刘辉在文章修改方面提出的宝贵意见，感谢北京蛋白质组研究中心质谱组刘新等在数据分析方法研究中的深入讨论。

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