人参皂苷对肝损伤的防治作用

　　人参为五加科植物人参的干燥根，而红参则是人参经过高温炮制后得到的加工品。人参具有抗氧化、抗衰老、提高机体免疫力及护心保肝等药理作用。由于乙醇在体内主要经肝脏代谢，其代谢物乙醛及代谢过程中产生的活性氧会对肝脏造成损害，长期饮酒和过量饮酒，会造成乙醇在体内堆积，对肝脏造成不同程度的损伤。而人参皂苷是红参的主要活性成分，《中国药典》和国家标准均以人参皂苷为红参的考核指标。近年来，有研究发现红参具有保肝功能[2-3],本文旨在研究人参皂苷提取物对小鼠酒精性肝损伤的防治作用，揭示作用机制，为红参的临床应用提供依据。

　　1 材料与与仪器

　　1.1 仪器

　　Infinite M200pro 酶标仪(瑞士帝肯);Lecia-DM2500 微生物显微镜，德国 Lecia 公司。

　　1.2 药物与试剂

　　鲜人参，为 5 年生，产自吉林省抚松县，由长春中医药大学王淑敏教授鉴定为五加科人参属人参Panax ginseng C. A. Meyer 干燥根;联苯双酯滴丸(浙江万邦药业有限公司，批号 A02130407);56°北京红星二锅头酒(北京红星二锅头酒厂，批号20140224);ALT 试剂盒、AST 试剂盒、MDA 试剂盒、GSH 试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20150112);TG 试剂盒(浙江东瓯生物工程有限公司，批号 2015040104)。

　　1.3 实验动物

　　清洁级 ICR 雄性小鼠，体质量 20~22 g,由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK-(吉)2014-005.

　　2 实验方法

　　2.1 红参炮制

　　称取鲜人参约 300 g,用纱布包好，放入蒸参箱，在 60 min 升温到 100 ℃后蒸制 6 h,蒸制完毕后置于 50 ℃烘干箱内烘干。将烘干后的红参研碎成粉，过 80 目筛。

　　2.2 人参皂苷提取物(Ginseng saponin extracts,GE)制备

　　称取红参粉末，加入 8 倍量 80%乙醇，超声提取(500 W,100 Hz)30 min,抽滤，滤渣加入 6倍量乙醇超声 30 min,滤过，合并滤液，40 ℃水浴蒸干，加入适量水溶解，即得人参皂苷提取物(人参总皂苷含量为 3.84%)，4 ℃下保存待用。

　　2.3 动物分组

　　取清洁级 ICR 雄性小鼠 72 只，正常喂养 5 d后，将其按体重平均分为 6 组，分别为对照组、阳性组(联苯双酯)、模型组及 GE 高、中、低剂量组，每组 12 只。

　　2.4 动物造模及给药

　　给药剂量按照成人日均用药量与小鼠给药量进行剂量换算，除对照组每天 ig 等体积的蒸馏水外，其余各组 ig 给予 56°白酒，给药剂量为 0.2 mL/20g,1 次/d,造模 5 d.给药组给予 GE,低、中、高剂量组每日分别给予 0.38、0.75、1.13 g/kg 生药材浓度的 GE,阳性对照组给予联苯双酯 0.90 mg/kg,给药后 1 h 给予 56°白酒，1 次/d,连续 30 d.小鼠给药期间每周进行称质量并记录，并观察小鼠的毛色、饮食、行为及死亡情况。

　　2.5 样本采集

　　处理前禁食 12 h,给药及白酒 1 h 后，小鼠摘眼球取血，常温静置后待其凝固，3 000 r/min 离心15 min,取血清，?80 ℃保存待测。采血后，迅速剖取肝脏，用冷生理盐水洗净，滤纸吸湿后，称取肝脏湿重，计算肝脏系数(肝脏系数=肝质量/体质量)。取肝右叶做 HE 染色，肝左叶制备 10%肝匀浆，匀浆制备方法：用冷生理盐水冲洗肝脏至无血色，称质量，加入 9 倍量冷生理盐水机械匀浆，将匀浆液 2 500 r/min 离心 20 min,4 ℃，取上清。

　　2.6 生化指标检测

　　每组取同等样本量的小鼠血清及肝匀浆，严格按照试剂盒操作方法进行小鼠血清 ALT、AST、TG、肝匀浆 MDA、GSH 含量测定。

　　2.7 肝组织病理学检查

　　取小鼠肝脏右叶置于10%中性福尔马林中进行固定，经一定梯度浓度的乙醇脱水、石蜡包埋、切片进行 HE 染色，用显微镜观察肝组织病理变化。

　　2.8 数据处理

　　应用 SPSS 19.0 统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析，组间比较采用最小显着差数法(LSD)，数据均以 x ±s 表示。

　　3 结果

　　3.1 小鼠状况观察

　　试验期间，GE 中剂量组及阳性组死亡小鼠 4只，其余各组死亡小鼠 2 只。对照组小鼠精神状态正常，毛色正常，模型组小鼠毛色较差，造模期间，ig 给予白酒后 20 min 左右，出现醉酒状态，不自主行为增多，爬行不稳，有些小鼠呈现昏睡状态，给药组小鼠给予白酒20min 后，醉酒状态较模型组稍好。

　　3.2 体质量及肝脏系数变化

　　各组小鼠体质量无统计学差异，与对照组相比，模型组小鼠肝质量增大(P<0.05)，表明长期饮酒和乙醇的堆积造成小鼠肝脏受损肿大，质量增加可能与肝脏内脂肪堆积或其他物质生成有关。给药组小鼠肝脏系数相较模型组有明显降低(P<0.05)，GE 高、中、低剂量组均有降低，但组间变化趋势不明显，GE 对酒精引起的小鼠肝脏受损肿大有一定的缓解作用。

　　3.3 对小鼠血清 ALT、AST、TG 的影响

　　与对照组相比，模型组小鼠血清 ALT(P<0.05)、AST(P<0.05)、TG(P<0.01)含量明显升高;与模型组相比，GE 高、中剂量组 ALT 含量降低(P<0.01)，GE 各剂量组均能降低 AST 和 TG水平(P<0.01)，联苯双酯组可明显降低 ALT、AST水平。但 GE 高、中、低剂量组组间呈现的量效关系不明显。长期白酒灌胃会造成小鼠血清 ALT、AST、TG 含量增高，GE 可明显降低血清 TG 的含量，对 ALT、AST 含量降低有一定作用，说明 GE对小鼠酒精性肝损伤有一定保护作用。

　　3.4 对小鼠肝脏 MDA、GSH 的影响

　　小鼠肝匀浆 MDA 含量结果显示，模型组小鼠MDA 含量高于对照组(P<0.01)，GE 各剂量组MDA 含量低于模型组(P<0.01)。模型组 GSH 含量低于对照组(P<0.01)，GE 各剂量组 GSH 含量高于模型组(P<0.01)，GE 可降低 MDA 含量，增加 GSH 含量，说明其可在一定程度上抵御肝脏内的氧化作用，从而保护肝脏进一步损伤。

　　3.5 病理观察结果

　　正常组肝细胞结构正常，肝细胞条索排列整齐;模型组肝细胞变性坏死，有炎性细胞浸润，脂泡小而密集;联苯双酯组炎性细胞浸润和坏死程度减轻

　　4 讨论

　　本研究采用长期、固定剂量的酒精灌胃造模方法[4-5]来模拟长期饮酒的状态，形成慢性酒精性肝损伤模型。通过实验观察，长期灌胃白酒的小鼠，不自主行为增多，会出现嗜睡、四肢无力、食欲减退、呼吸衰竭等状态，模型组小鼠的生化指标也表明长期白酒灌胃引起的肝功能的损伤，长期、固定剂量的酒精灌胃引起小鼠慢性酒精性肝损伤是可行的。

　　ALT、AST 是检验肝脏损伤的一个重要指标，正常血清里 ALT、AST 含量极少，只有在肝细胞死亡破裂后肝细胞内的 ALT、AST 才会释放入血，血清中 ALT、AST 含量增加说明肝脏出现炎症。乙醇经肝脏代谢过程中产生的活性氧会直接对肝细胞造成氧化损伤[6],形成过脂质氧化产物--MDA,其含量是细胞氧化损伤的一个重要检测指标。模型组小鼠肝组织 MDA 含量高于正常组，GSH 含量低于正常组，肝脏长期的酒精代谢会造成肝脏内氧化物质的增多，还原物质减少，造成肝细胞氧化损伤。

　　同时肝脏脂质过氧化会产生脂肪酸的氧化，影响肝脏微管功能，致使肝脏内 TG 代谢障碍，长期的乙醇摄入，不仅增大了小鼠的肝质量、肝脏系数，也致使模型组小鼠较正常组小鼠 TG 的量明显增多。

　　红参醇提液中的成分主要是人参皂苷，红参中含有 20 多种人参皂苷，如人参皂苷 Re、Rb1、Rh1、Rh2、Rd 等，其人参皂苷 Rg3、Rg2、Rh1的含量高于白参[7].研究发现人参皂苷 20 (S)-人参皂苷 Rg3可明显抑制肝损伤小鼠 ALT、AST 的酶活性[8],人参皂苷Rb1可明显降低大鼠肝微粒体细胞色素P450酶与 NADPH-P450 的活性[9],人参皂苷 Rh2可抑制肝纤维 DNA 的合成[10]等。通过本研究发现，GE 可明显降低长期白酒灌胃小鼠血清中 TG 的含量，对降低其 ALT、AST 作用不明显，对抑制肝脏内 MDA的含量，增加 GSH 含量有一定作用，对长期饮酒所造成的肝损伤有一定的预防和保护作用，从而阻止肝脏向纤维化进一步恶化。GE 中、高剂量组与模型组的病理观察比较，GE 可在一定程度上抑制肝细胞炎症发生，但抑制效果不明显，但可以显着减少小而密集的脂肪泡数量，GE 中、高剂量组可明显抑制肝脏内的泡样损伤。GE 可能主要通过抑制体内活性氧对肝脏脂质过氧化、减少肝脏脂肪堆积这一途径来避免肝脏受损。

　　综合以上结果，人参皂苷提取物对小鼠酒精性肝损伤有一定的保护作用，以中、高剂量效果最好，但红参保肝机制尚不明确，此研究为红参的保健开发和治疗酒精性肝损伤提供了一定的参考。